鐵皮石斛組培體系的建立

鄭子首,孫晨瑜,呂曉倩,侯文秋,李 濱

山東農業大學 生命科學學院,山東 泰安 271018

鐵皮石斛組培體系的建立

鄭子首,孫晨瑜,呂曉倩,侯文秋,李 濱*

山東農業大學 生命科學學院,山東 泰安 271018

鐵皮石斛作為一種重要的抗癌抑癌藥物，在全民養生的今天越來越多的成為了人們消費的熱點。然而，由于野生的鐵皮石斛非常稀少而且非常昂貴，不適合大眾消費。所以建立一套適合工業化生產的組培體系成為了發展的趨勢。以幼嫩的鐵皮石斛帶節莖段為原材料，1/2MS作為培養基，探究了不同激素濃度及其他因素對鐵皮石斛快繁和組培的影響。再以組培出的幼苗為原材料，研究了溫度、水質、培養基質及澆水方式等對鐵皮石斛煉苗的影響。結果表明，鐵皮石斛快繁的最佳激素濃度為6-BA,1.0 mg/L和NAA，1.0 mg/L，及1%的活性炭，誘導率為12.5%；組培的最佳激素濃度為6-BA,1.5 mg/L及NAA,2.0 mg/L或6-BA,0.5 mg/L,NAA,0.5 mg/L和2,4-D,1.5 mg/L，誘導率都在80%以上。鐵皮石斛的最優煉苗條件為25℃，光照過的自來水澆灌；最適合的培養基質為水苔+直徑約為0.5～1.0 cm的樹皮。

鐵皮石斛;組培

鐵皮石斛(Dendrobium officinaleKimura et Migo)是一種名貴的中藥材，在民間，被譽為“救命仙草”，具有抗癌、防癌、抗輻射、抗衰老，提高人體免疫力、擴張血管、抗血小板凝結等多種功能。但鐵皮石斛自然結實率很低，僅為0.31%。目前全國野生的鐵皮石斛越來越少，已不足500 kg，全國市場上每年流通的正宗野生鐵皮楓斗不到數十公斤，而早在87年就被國家列為野生藥材重點二級保護瀕危植物。

今年來，鐵皮石斛在組培快繁方面取得了部分的進展，國內外的研究內容涉及了培養基選擇[1-3]、外植體選擇[4-7]、激素配比[5-6,8-10]等諸多方面。然而，對于天然添加物的種類、濃度、添加時機等方面的結論差異較大。李筑等[2]對石斛煉苗的基質進行了詳細的研究，但還有水源等幾個方面沒有考慮到，有進一步研究的價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組培原料 選用純種的生長狀況均一的鐵皮石斛為快繁和組培的原料。

1.1.2 煉苗原料 組培獲得的生長狀況相同的幼苗。基質：Ⅰ直徑大約為0.5～1 cm的樹皮。Ⅱ直徑大約為0.5～1 cm樹皮+直徑大約為1 cm的磚頭。Ⅲ水苔+直徑大約為0.5～1 cm的樹皮。Ⅳ腐殖土。Ⅴ腐殖土和少量珍珠巖配成的混合基質。

1.2 方法

1.2.1 快繁 Ⅰ外植體消毒:選取生長旺盛無病害的粗壯植株莖段，每一節為一段，剝去莖表皮，用去離子水洗凈，放入超凈工作臺中。用75%酒精消毒30 s，用5%的NaClO消毒8 min，最后用去離子水洗凈，切去邊緣。Ⅱ外植體的培養:將處理過的莖段接入1/2的MS+3%的蔗糖+0.1%的活性炭的培養基中，用不同激素進行處理。然后將其放入光照培養箱中培養70 d左右。

1.2.2 組培 Ⅰ外植體消毒：方法同上。Ⅱ愈傷組織的形成：將橫切過的鐵皮石斛帶節莖段放入不同激素的1/2MS+3%蔗糖的固體培養基中并用不同激素進行處理。Ⅲ當誘導分化出的不定芽長到大約3 cm時，將不定芽沿根部的愈傷組織切下，并轉移到最佳生根培養基中，誘導其分化成不定根。本文著重研究不同激素處理對鐵皮石斛脫分化形成不定芽的影響。

1.2.3 煉苗 Ⅰ原材料的選取:從組培苗中選取生長狀況相近，莖稈健壯，高度相差較小的鐵皮石斛組培苗若干，洗凈根部的培養基，并消毒備用。Ⅱ培養基質的配置:購買實驗所需的各種土壤基質，配制成以下幾種培養基質：①直徑約為0.5～1 cm的樹皮。②直徑約為0.5～1 cm樹皮+直徑約為1 cm的磚頭。③水苔+直徑約為0.5～1 cm的樹皮。④腐殖土。⑤腐殖土+少量珍珠巖配成的混合基質。（以下稱①、②、③、④、⑤）Ⅲ分組對照：按照溫度、培養基質、水源的不同將選取的鐵皮石斛組培苗平均分成大小株數相近的30組，并設置一組重復組作為對照，培養觀察，并進行記錄。

2 結果與分析

2.1 不同激素處理對鐵皮石斛的快繁的影響

野生石斛體內存在大量的內生共生菌，普通滅菌方法難以根除，加入活性炭后能夠顯著降低鐵皮石斛的染菌率。用不同濃度的激素（表1）進行處理后得出外植體在培養30 d左右就可以明顯發現石斛腋芽的出現，60 d石斛幼苗幾乎發育完全，可以進行煉苗。經實驗證明，鐵皮石斛莖段在（1）條件下誘導率最高，為12.5%，(2)、(3)分別為11.2%和5.0%。結果表明，鐵皮石斛快繁最佳培養基為1/2MS培養基+1.0 mg/L的6-BA，3%的蔗糖+0.1%的活性炭，并對外植體進行切割處理。（圖1）

表1 鐵皮石斛快繁不同激素處理Table 1 Different phytohormone in micropropagation rapid propagation ofDendrobium officinaleKimura et Migo

圖1 鐵皮石斛快繁Fig.1The result of micro-propagation rapid propagation ofDendrobium officinaleKimura et Migo

2.2 不同激素處理對鐵皮石斛的組培的影響

用不同濃度的激素（表2）對鐵皮石斛大量進行處理，最終獲得了幾組誘導率很高的濃度配比。其中，誘導率最高的是1.5 mg/L的6-BA和2.0 mg/L的NAA，其誘導率為96%，其次是0.5 mg/L的6-BA，0.5 mg/L的NAA和1.5 mg/L的2，4-D，其誘導率是大約83%。其他濃度誘導率都在50%以下。因為加入活性炭具有良好的抑菌效果，因此在組培過程中依舊保存著0.1%的活性炭。（愈傷組織見圖2）

表2 鐵皮石斛組培不同激素處理Table 2 Different phytohormone in tissue culture ofDendrobium officinaleKimura et Migo

圖2 鐵皮石斛愈傷組織Fig.2 The callus ofDendrobium officinaleKimura et Migo

2.3 鐵皮石斛的煉苗

經預實驗發現一次性澆透水過后，3天之后基質干透，需再次澆水，為防止水分過多爛根，水分較少根部枯萎，澆水周期定為3天。每隔十天觀察記錄一次現象，大約3個月之后，對數據進行生物統計學統計，統計出組培苗的成活率和幼苗的生長速率，可得出最適宜石斛煉苗的條件和對其影響最大的外界因素，從而實現對鐵皮石斛進行的生產培育工作。通過對鐵皮石斛的溫度、培養基質、水源等影響因素進行分組處理（表3、4），經一年的觀察，以及對出芽時間和數量的記錄，得出了鐵皮石斛煉苗最快恢復（以分化出第一芽的時間為依據）的培養條件為30℃，⑤號培養基質并用光照過的自來水澆灌，第一芽分化的時間只有10 d。但這種條件對于鐵皮石斛日后生長不利，極易會出現枯死、爛根等情況。后期有利于鐵皮石斛生長（以植株長勢及最后出芽總數為依據）的培養條件是25℃，③號培養基質。水質方面，自來水與光照過的自來水效果差不多，但均優于去離子水。在此條件下幼苗全部存活并且長勢良好，澆水次數方便人工管理，適合大面積煉苗（圖3）。

表3 30℃時的實驗處理Table 3 The number cultivated in 30℃

表4 25℃時的實驗處理Table 4 The number cultivated in 25℃

圖3 鐵皮石斛煉苗情況Fig.3 The conditions of hardening-seedlings ofDendrobium officinaleKimura et Migo

3 討論

鐵皮石斛屬于藥用價值極高的產品。在快速生長的過程中，會造成藥用成分質量的下降。下一步的研究方向應該是改良培養基的配方以及培養環境來降低或防止此現象。如果要實現大批量的生產，培養基的成本也是亟待解決的方面，優化培養基的配方，使其物美價廉。

另外在煉苗過程中，建議先使用135的條件進行培養，出芽后立即轉移到233的條件中。

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[2]李 筑.鐵皮石斛煉苗基質的篩選研究[J].中國民間醫藥,2015,2(2):27-28

[3]崔現亮.鐵皮石斛生根壯苗培養基及煉苗技術研究[J].現代農業科技,2015,1(1):104-108

[4]陳 希,黃丹丹.鐵皮石斛的組織培養與快速繁殖研究進展[J].海峽藥學,2011,23(8):19-22

[5]溫明霞,聶振朋,林 媚,等.鐵皮石斛組織培養與快速繁殖研究進展[J].廣西農業科學,2007,28(3):227-230

[6]宋 順,許 奕,李敬陽,等.鐵皮石斛的組織培養與快速繁殖研究進展[J].中國農學通報,2013,29(33):286-290

[7]遠凌威.三個產地鐵皮石斛組織培養及其抗寒生理研究[D].信陽:信陽師范學院,201

[8]王 聰.鐵皮石斛快速繁殖技術研究[D].廣州:仲愷農業工程學院,2014

[9]翟明恬,劉紅霞,王亞妮.鐵皮石斛組織快繁及移栽培養[J].東北林業大學學報,2015,43(1):50-53,71

[10]黃 勇.鐵皮石斛組織培養技術研究進展[J].文山學院學報,2013,26(6):14-19

TissueCultureSystemEstablishmentofDendrobiumofficinaleKimuraetMigo

ZHENG Zi-shou,SUN Chen-yu,LV Xiao-qian,HOU Wen-qiu,LI Bin*
College of Life Sciences/Shandong Agricultural University,Tai’an271018,China

As an important medicine for anticancer,Dendrobium officinaleKimura et Migo becomes a hot topic during the health-preserving society.WildDendrobium officinaleis very rare and very expensive and not suitable for public consumption.So the establishment of the tissue culture system suitable for industrial production has become the tendency.We used its stalk as material and 1/2 MS as basal culture medium,investigated the effects of different hormone concentration and other factors on the tissue culture ofD.Officinale,and then used these plants cultivated as material to explore the effects of temperature,water quality,culture medium and watering method on the seedling ofDendrobium officinale.The results showed that the best medium of rapid multiplication was basal culture medium+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/LNAA+1%PAC,and it’s inductivity was 12.5%.The best medium of tissue culture was basal culture medium+1.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA or 0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA or 0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L 2,4-D,and their inductivities were all over 80%.The best conditions to hardening-seedlings was 25℃+lighted tap wate,the most suitable culture medium was sphagna+0.5～1.0 cm barks in diameter.

Dendrobium officinaleKimura et Migo;tissue culture

S567.239;Q813.1

A

1000-2324(2017)04-0537-03

2016-04-12

2016-04-10

鄭子首(1996-),男,本科生.E-mail:775618761@qq.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:agribiolab@163.com