一株產纖維素酶菌株的鑒定及其產酶條件優化

李 楊,桓明輝,高曉梅,劉曉輝,敖 靜,朱巍巍,池景良

遼寧省微生物科學研究院,遼寧 朝陽 122000

一株產纖維素酶菌株的鑒定及其產酶條件優化

李 楊,桓明輝,高曉梅,劉曉輝,敖 靜,朱巍巍,池景良

遼寧省微生物科學研究院,遼寧 朝陽 122000

從土壤中篩選出一株產纖維素酶的細菌，編號為X-2。該菌株為革蘭氏陽性菌，好氧，可生成芽孢。根據其菌體形態、菌落形態、生理生化特征作為初步分類依據，并通過16S rDNA分子生物學鑒定的技術手段，鑒定為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）。液體發酵試驗表明，其產酶的最適條件為：發酵時間為72 h，培養溫度35°C，轉速130 rpm、接種量6%以及初始pH 7.2，在該條件下其羥甲基纖維素酶（CMCase）活性可達10.89 U/mL。

纖維素酶;鑒定;蘇云金芽孢桿菌;產酶條件優化

纖維素是地球上數量最大的可再生能源物質，由于其存在很多的高能氫鍵難以水解，因此很難被人類或動物直接利用[1]。我國是農業大國，每年產玉米秸稈超過7億t，玉米秸稈是一種纖維素含量很高的農作物廢棄物，目前對玉米秸稈的處理大部分是丟棄或者焚燒，產生了嚴重的環境問題[2-4]。如何使玉米秸稈達到無害化和資源化利用已經成為目前研究的熱點。利用微生物產生的纖維素酶作用于玉米秸稈，已經取得了一定的進展，具有效果穩定、降解徹底和降低污染的優點，因而得到了普遍的認可[5,6]。因此，篩選和分離出產纖維素酶的微生物菌株，提高其對纖維素的降解能力，研制出混合菌株的腐熟劑已經成為目前利用微生物降解玉米秸稈以及纖維素資源的開發利用的研究重點，同時對于解決能源危機和環境污染等具有重大的意義。纖維素酶是能夠降解纖維素生成葡萄糖的一類酶的總稱，是一個由多種水解酶組成的復雜酶系[7,8]。在纖維素資源的綜合利用過程中，纖維素酶發揮重要作用。

過去的研究中，大多數報道的纖維素酶來源于絲狀真菌，尤其是木霉屬和曲霉屬，由于這些菌株產纖維素酶種類多、產量高、性質多樣，因此成為發酵法產纖維素酶的主要菌株[9,10]。近幾年人們對產纖維素酶的細菌產生了濃厚的興趣，因為細菌的一個最大優點是易于培養、生長周期和產酶周期短，生產過程中可以降低成本，同時可徹底降解天然纖維素，達到預想的效果。隨著對細菌深入研究，一些新的可降解纖維素的好氧細菌菌種被發現和開發利用。本實驗室從自然界中篩選出了一株好氧、生長速度快且產纖維素酶較高的細菌菌株X-2，鑒定為蘇云金芽孢桿菌，對其進行了進一步分子生物學鑒定，通過測定菌株菌數和CMCase活力作為指標，優化其最適產酶條件，為后期深入研究該菌株的規模化生產奠定了基礎，同時為微生物秸稈腐熟劑提供一株后備菌株。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

從土壤中分離一株產纖維素酶細菌，命名為X-2。

1 mg/mL葡萄糖標準溶液；3,5-二硝基水楊酸顯色劑（DNS顯色劑）；pH4.8乙酸-乙酸鈉緩沖液；1%CMC-Na溶液。

1.2 培養基

牛肉膏蛋白胨培養基；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）培養基[11]。

液體發酵培養基：蛋白胨l0.0 g，酵母提取物l0.0 g，(NH4)2S042.0 g，KH2PO44.0 g，CaCl2?2H2O 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g,CMC-Na l0.0 g，蒸餾水 l000 mL，pH7.2。

V-P培養基；甲基紅（M.R.）培養基；明膠液化培養基；淀粉水解培養基；葡萄糖氧化發酵培養基（休和利夫森培養基）；檸檬酸鹽利用培養基[12]。

甘露醇卵黃多粘素瓊脂培養基（MYP）、胰酪胨大豆羊血瓊脂基礎培養基和無菌脫纖維羊血購于青島海博生物技術有限公司。

1.3 菌種鑒定方法

1.3.1 形態學特征和生理生化試驗 根據《伯杰細菌鑒定手冊》(第8版)和《常見細菌系統鑒定手冊》[13,14]，對分離得到的菌株進行鑒定。

1.3.2 16S rDNA序列比對及系統發育分析 用細菌16 S rDNA的引物，即上游引物F：5′-CAGAGT TTGATCCTGGCT-3′，下游引物 R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，進行 16S rDNA 的擴增。擴增體系為：rTaq 酶(5 U/μL)12.5 μL，上游引物和下游引物（2.5 μmol/L）各 1 μL，模板 DNA 2 μL，最后加雙蒸水至50 μL，混合后瞬間離心，置于PCR儀上98℃變性3 min，然后98℃變性25 s，5 5℃退火25 s，72℃延伸1 min，共30個循環，最后72℃延伸10 min反應結束。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統下觀察并拍照記錄結果。委托上海生工進行測序。將測序結果輸入GenBank進行同源性分析。利用Mega、Clustal等軟件進行比對，構建進化樹，重復次數為1000次。

1.4 產酶發酵條件優化

1.4.1 產CMCase的測定

1.4.1.1 剛果紅平板法檢測菌株產纖維素酶能力 將菌株接種于CMC-Na培養基平板上培養3 d，用0.1%的剛果紅染色30 min后用1 M NaCl溶液洗脫，觀察是否出現透明圈。

1.4.1.2 CMCase的測定

(1)粗酶液的制備：將發酵液于4°C、5000 rpm條件下離心l0 min，所得上清液即為粗酶液。

(2)葡萄糖標準曲線：取8支20 mL的具塞刻度試管，分別加入標準葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，加入蒸餾水 2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6 mL，1.5 mL 的 DNS 顯色劑，混合液搖勻后于沸水浴中煮沸5 min，迅速置于涼水中冷卻，定容到l0 mL，搖勻，540 nm處測定吸光值。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標，以對應的吸光度值為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。

(3)羧甲基纖維素酶活力（CMCase）的測定[15,16]。取4支試管編號。其中1-3號為反應管，4號為對照管。取0.5 mL粗酶液加入1-3號試管中，加入1%CMC-Na溶液1.5 mL；4號管中加入0.5 mL經高溫滅活的粗酶液和1%CMC-Na溶液1.5 mL。將上述試管置于50°C水浴30 min，立即加入1.5 mL DNS顯色劑終止反應。再將上述試管一同沸水浴5 min后，迅速冷卻并定容至l0 mL，搖勻，540 nm波長處測定吸光度，記錄各管的吸光值。

CMCase酶活力定義:在上述反應條件下,纖維素酶液每分鐘催化底物1%CMC-Na溶液生成l μg葡萄糖所需酶量定義為一個酶活力單位（U）。

1.4.2 產酶發酵時間的優化 將菌株X-2接種到發酵培養基中，于30°C、130 rpm條件下培養24 h、36 h、48h、60 h、72 h、84 h及96 h后測發酵液在570 nm的OD值并測定CMCase活力，重復3次。

1.4.3 溫度的優化 設25°C、30°C、35°C、40°C 4個溫度條件，130 rpm振蕩培養72 h后測發酵液的OD值和CMCase活力，重復3次。

1.4.4 接種量的優化 按1%、2%、4%、6%、8%、10%的接種量接種，在35°C、130 rpm的條件下培養72 h后測發酵液的OD值和CMCase活力，重復3次。

1.4.5 轉速的優化 設定搖床轉速在100 rpm、130 rpm、150 rpm、180 rpm，于35°C培養72 h后測發酵液的OD值和CMCase活力，重復3次。

1.4.6 初始pH的優化 設定培養基初始pH為6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8和8.0，于35°C、130 rpm培養72 h后測發酵液的OD值和CMCase活力，重復3次。

2 結果

2.1 形態學特征

對X-2細菌形態特征進行觀察（表1），結果表明菌株X-2為革蘭氏陽性菌，24 h后可形成穩定的菌落。X-2細菌菌體為桿狀，側生鞭毛，產中生芽孢。

表1 細菌X-2的形態觀察Table 1 The morphological observation of X-2

2.2 生理生化反應

X-2菌生理生化反應見（表2）。根據《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》所列的芽孢桿菌屬形態學和生理生化性狀的描述，初步認為X-2為芽孢桿菌屬（Bacillus）。

表2 細菌X-2生理生化性狀鑒定Table 2 Identification of X-2 physiological and biochemical characters

2.3 PCR反應擴增后各菌株的16 S rDNA片斷

從圖1可以看出，得到的擴增產物的分子量在1500 bp左右，符合16 S rDNA片斷大小，說明該擴增片斷是16S rDNA片斷。

圖1 細菌X-2的16 S rDNA M 泳道為marker，點樣量為5 μLFig.1 16 s rDNA of X-2 M lane was marker,sample dosage was 5 μL

2.4 細菌X-2的16 S rDNA鑒定以及系統發育樹的構建

測序測得16 S rDNA大部分序列為1494 bp。登陸NCBI，使用BLAST在線將得到的16 S rDNA序列提交進行BLAST在線分析。將測出的序列通過16 S rDNA序列同源性比較，X-2與Bacillus thuringiensis的16 S rDNA序列相似性均達到100%。根據同源性比較結果，可以初步確認細菌X-2為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）。

從Genbank中選擇了11個菌株，應用Mega、Clustal軟件進行多重比較后構建系統發育樹。如圖2所示，菌株X-2和蘇云金芽孢桿菌在一個分支中，且菌株X-2與蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis（FN433030.1）和Bacillus thuringiensis（GU471753.1）的親緣關系較近。進一步證明菌株X-2為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）。

圖2 細菌X-2基于16 S rDNA的系統進化樹Fig.2 Phulogenetic tree of X-2 based on the 16 S rDNA sequence

2.5 葡萄糖標準曲線的繪制

不同含量的葡萄糖對應的吸光值和葡萄糖標準曲線如下所示。吸光值與葡萄糖含量成正比例關系，且R2=0.995，因此可以通過測定溶液的吸光值OD計算出相應的葡萄糖含量。

圖3 葡萄糖標準曲線Fig.3 Standard carve of Glucose

2.6 菌株X-2產纖維素酶能力的測定

菌株培養3 d后，結果如圖4。剛果紅能與培養基中的纖維素形成紅色復合物。當纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅-纖維素的復合物就無法形成，培養基中會出現以纖維素分解菌為中心的透明圈，因此通過是否產生透明圈可以判定菌株是否產纖維素酶。測量X-2透明圈的直徑（12.72±3 mm），D1/d1是3.24。故X-2是一株可以產纖維素酶的細菌。

圖4 菌株X-2產纖維素酶的定性分析Fig.4 Qualitative analysis on CMCase of X-2

圖5 培養時間對菌株X-2生長和產CMC酶的影響Fig.5 Culturing time effect on growth and CMCase of X-2

2.7 培養條件對生長速率和產酶量的影響

2.7.1 發酵時間對生長速率和產酶量的影響 結果如圖5所示，接種后24 h內，菌株生長比較緩慢，24 h后菌株快速生長，培養72 h后發酵液OD值達最大，產酶量達到10.31 U/mL，為纖維素酶的最佳收獲期。72 h后隨著時間的延長，生長速率逐漸減小趨于平衡。由于養分的消耗和代謝產物的分泌，菌絲老齡化嚴重，慢慢解體，故發酵液的OD值有所下降。

2.7.2 發酵溫度對生長速率和產酶量的影響 結果如圖6所示，X-2在30～35°C代謝最旺盛，可見其最適生長溫度為30～35°C。隨著溫度升高生長速率均受到抑制，說明培養溫度對細菌X-2的CMCase影響效果顯著。產酶量隨著溫度的升高呈上升趨勢，在35°C時達到最高，超過35°C，隨溫度升高，酶活力有所下降。綜合考慮其生長曲線和產酶能力，確定X-2最適宜的發酵產酶溫度為35°C。

圖6 發酵溫度對菌株X-2生長和產CMC酶的影響Fig.6 Temperatures effects on growth and CMCase of X-2

圖7 接種量對菌株X-2生長和產CMC酶的影響Fig.7 Inoculum effects on growth and CMCase of X-2

2.7.3 接種量對生長速率和產酶量的影響 結果表明，如圖7，隨著接種量的增加，菌株的生長代謝呈現較好狀態，菌數和CMCase的酶活力均增加，OD值均均可達到1.00以上，接種量對細菌X-2生長的影響并不顯著。但當接種量超過6%的時候，酶活力逐步下降，推測是由于接種量過多導致培養基中溶氧量不足的原因。綜合生長速率和CMC酶活力確定X-2的最適接種量為6%。

2.7.4 轉速對生長速率和產酶量的影響 由圖8可以看出，當轉速為100 rpm時，菌數和酶活力都較低，生長狀況相對最好的轉速條件是130 rpm和150 rpm，此時OD值分別為1.011和1.014。130、150和180 rpm轉速條件下，菌株X-2的產纖維素酶能力差別不大，當轉速在130 rpm時，其菌數和產纖維素酶能力相對偏高。綜合考慮，菌株X-2的產酶發酵最佳轉速確定為130 rpm。

圖8 轉速對菌株X-2生長和產CMC酶的影響Fig.8 Rotate speed effect on growth and CMCase of X-2

圖9 pH對菌株X-2生長和產CMC酶的影響Fig.9 pH effect on growth and CMCase of X-2

2.7.5 初始pH對生長速率和產酶量的影響 從圖9可以看出，初始pH對菌株X-2生長速率和酶活力均有顯著影響。初始pH在6.5時OD值較低，隨著初始pH的增加，OD值呈明顯上升趨勢。初始pH為7.2時，OD值達最高1.221，進一步增加而有所降低。初始pH在7.2～8.0的條件下，菌株X-2的產酶活性均可保持在一個較高的水平。在培養基初始pH為7.2、7.4時，CMCase分別達10.89 U/mL和10.72 U/mL。因此，菌株X-2的發酵培養最適pH為7.2。

3 討論

纖維素是年產量巨大的可再生能源物質，通過微生物產生的纖維素酶來分解和轉化纖維素是纖維素利用的有效途徑，也是多年來研究者的目標。已發現的具有降解纖維素能力的微生物有近200種，分布在真菌、細菌和放線菌中，其中以真菌類產纖維素酶為主[17-19]，但真菌產纖維素酶的規模生產較繁瑣、周期長，在很大程度影響了纖維素的酶解效率，增大了生產成本[20,21]，因此篩選出一種周期短、產酶高的菌株至關重要。本試驗對細菌菌株X-2進行了鑒定及產纖維素酶條件的優化。菌株X-2能產芽孢，革蘭氏陽性，分子生物學鑒定其為蘇云金芽孢桿菌。其最適產酶條件為:培養基起始pH值為7.2，發酵溫度35°C，接種量為6%，轉速為130 rpm，培養72 h，此條件下產CMCase可達10.89 U/mL。X-2在72 h即可達到產酶高峰，大大縮短了生產周期，且產纖維素酶量也較高，這與陳晨[22]等發現菌株F1即鑒定為蘇云金芽孢桿菌后，其纖維素酶活在72 h可達到最高的研究一致。到目前為止，對Bacillus agaradhaerens、Bacillus cellulyticus、解淀粉芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌產纖維素酶研究比較深入，纖維素酶的純化方法已經形成，超過20個編碼纖維素降解酶的基因已經被測序和克隆[23]。X-2對纖維素具有較強的降解作用，本實驗只是對其發酵條件進行了初步探索，下一步繼續研究該菌株產纖維素酶的基因及其纖維素酶的性質，期望從基因水平上提高菌株的纖維素酶活，將其應用于微生物腐熟劑的制作過程中，為腐熟劑的復合菌種提供后備菌株，對環境和生態問題會有很大的應用前景和意義。

4 結論

(1)根據其菌體形態、菌落形態、生理生化特征作為初步分類依據，該菌株為革蘭氏陽性菌，桿狀，好氧，可生成芽孢。并通過16S rDNA分子生物學鑒定的技術手段，鑒定為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）。

(2)剛果紅平板結果表明X-2是一株可以產纖維素酶的細菌，透明圈的直徑（12.72±3 mm），D1/d1是3.24。

(3)液體發酵試驗表明，其產酶的最適條件為：發酵時間為72 h，培養溫度35°C，轉速130 rpm、接種量6%以及初始pH7.2，在該條件下其羥甲基纖維素酶（CMCase）活性可達10.89 U/mL。

[1]張 勇,陶青燕.纖維素酶的應用進展[J].中國飼料,2002,18(4):17-19

[2]王巧蘭,郭 剛,林范學.纖維素研究綜述[J].湖北農業科學,2004(3):14-19

[3]辛亞平,昝林森,杜雙田,等.降解纖維素菌株篩選及其鑒定[J].畜牧獸醫雜志,2011,30(5):1-5

[4]趙方圓,范寧杰,朱建春,等.纖維素高效降解菌YN1的篩選及其降解特性[J].微生物學通報,2010,37(4):496-502

[5]劉春芬,賀稚非,蒲海燕,等.纖維素酶及應用現狀[J].糧食與油脂,2004(l):15-17

[6]胡 月,劉 霞,雷 頡.高產纖維素酶青霉菌的篩選及產酶條件的研究[J].中國食品添加劑,2007,2(l):80-84

[7]張傳富,顧文杰,彭科峰,等.微生物纖維素酶的研究現狀[J].生物信息學,2007,5(1):34-36

[8]周俊強,邱忠平,韓云平,等.纖維素降解菌的篩選及其產酶特性[J].環境工程學報,2010(3):705-708

[9]Johann O,Teinar RBB.Phylogenetic and Pysiological studies of FourHydrogen-Producing Thermoanareobes from Icelandic Geothermal areas[J].IcelandieAgri.Sei,2007,20:93-105

[10]Hari S,Krishna K,Selthar C.Studies on the Production and application of cellulose from Trichoderma reesei QM-9414[J].BioProcess.Eng,2000(22):467-470

[11]張建強,李亞瀾,李 勇.纖維素降解菌的分離鑒定及固態發酵條件[J].西南交通大學學報,2006,41(4):442-446

[12]沈 萍,范秀榮,李廣武.微生物學實驗[M].3版.北京:高等教育出版社,1999:214-222

[13]布坎南RE,吉本斯NE.伯杰氏細菌鑒定手冊[M].8版.北京:科學出版社,1984:62-65

[14]東秀珠,蔡妙英.常見細菌鑒定手冊[M].北京:科學出版社,2001:62-63

[15]齊 云,袁月祥,陳 飛,等.一組纖維素分解菌的分離、篩選及其產酶條件的研究[J].天然產物研究與開發,2003,15(6):510-512

[16]劉德海,楊玉華,安明理,等.纖維素酶酶活的測定方法[J].中國飼料,2002,17:27-28

[17]楊禮富,謝貴水,王真輝,等.木質纖維素酶高產菌株的篩選和鑒定[J].熱帶作物學報,2001,22(3):70-77

[18]馬旭光,張宗舟,藺海明,等.黑曲霉高產纖維素酶活突變株的篩選[J].中國釀造,2008,9:61-63

[19]趙連娣,孟順利,史兆國,等.綠色木霉液態發酵產纖維素酶條件的優化[J].浙江農業學報,2015,27(3):442-447

[20]陳麗燕,張光祥,黃春萍,等.兩株高產纖維素酶細菌的篩選、鑒定及酶學特性[J].微生物學通報,2011,38(4):531-538

[21]黃 艷,覃擁靈,凌 敏,等.不同碳源誘導康氏木霉產纖維素酶的研究[J].中國釀造,2008,15(8):41-44

[22]陳 晨,解玉紅,馮 炘,等.纖維素降解菌的分離及單菌株與菌群纖維素酶活性質[J].天津理工大學學報,2012,28(4-5):62-65

[23]Lin Ling,Kan Xianzhao,Yan Hao,et al.Characterization of extracellular cellulose-degrading enzymes fromBacillus thuringiensisstrains[J/OL].Electronic journal of biotechnology,2012,15(3).http://www.scielo.cl/scielo.ph p?pid=S0717-34582012000300002&script=sci_arttext&tlng=p

Identification for a Strain of Produce Cellulase and Enzyme ProductionConditionsOptimization

LI Yang,HUAN Ming-hui,GAO Xiao-mei,LIU Xiao-hui,AO Jing,ZHU Wei-wei,CHI Jing-liang
Microbial Research Institute of Liaoning Province,Chaoyang122000,China

This paper screened a strain of cellulose-producing bacteria No.X-2 from the soil.It was an aerobic Gram-positive bacteria and able to generate spore.It had been identified asBacillus thuringiensisin laboratory according to thallus morphology,Colony morphology,physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA molecular biology identification.Liquid fermentation test showed that Optimum fermentation conditions of X-2 were 72 h fermentation time,incubation temperature at 35°C,130 rpm of revolving speed,6%of inoculum size and pH7.2 of the initial value.The activity of hydroxymethyl cellulase(CMCase)under this condition reached 10.89 U/mL.

Cellulase;identification;Bacillus thuringiensis;optimization of fermentation conditions

Q93-331

A

1000-2324(2017)04-0556-06

2015-11-09

2015-12-03

國家農業科技成果轉化資金項目(2013GB2B000093)

李 楊(1982-),女,碩士研究生,助理研究員,主要從事農業微生物生理生化方面研究.E-mail:liyang_0223@163.com