CXCL12-G801A基因多態性在非小細胞肺癌中的表達及發病風險相關性研究

黃佳濱,隋小芳,王鳳玲,袁博洋,劉 影,范巧菊

(佳木斯大學附屬第一醫院 老年病科，黑龍江 佳木斯154002)

*通訊作者

CXCL12-G801A基因多態性在非小細胞肺癌中的表達及發病風險相關性研究

黃佳濱,隋小芳*,王鳳玲,袁博洋,劉 影,范巧菊

(佳木斯大學附屬第一醫院 老年病科，黑龍江 佳木斯154002)

肺癌是多基因以及多因素參與的疾病，發病機制還有影響預后的因素還不夠明確，診斷以及治療技術仍然需要改進。其中非小細胞肺癌占全部肺癌患者的比例>80%，但是該病患者的5年生存率只有10%左右[1]。雖然非小細胞肺癌患者的預后判斷依據主要是組織學類型以及臨床分期，不過有著相同特點的該病患者應用相同的治療措施，預后質量可能存在很大的區別。這就需要進一步探討該病發病風險。在腫瘤發生發展的過程當中，趨化因子發揮著重要的影響，部分趨化因子可以刺激腫瘤增殖，加速血管的形成，從而使得腫瘤細胞移動并且粘附到內皮細胞當中，實現腫瘤的轉移與擴散。另一部分趨化因子可以控制腫瘤血管以及腫瘤細胞的形成，激發機體的特異性免疫應答，有效預防腫瘤轉移與生長[2]。本研究選取非小細胞肺癌患者以及健康人群，對比CXCL12-G801A基因多態性在兩組對象當中的區別，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月到2013年1月我院收治的NSCLC患者中408例為研究組，均未進行放化療，同時選取同期健康體檢人員303例為對照組，同研究組對象之間不存在血緣關系。兩組研究對象均知情同意，并且經過醫院倫理委員會批準。收集兩組研究對象的性別、年齡以及吸煙史等資料，兩組患者一般資料有可比性(P>0.05)，見表1。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器及試劑。主要儀器：壓力滅菌器(美國MILLIPORE公司)、超純水儀(上海任氏電子公司)、Diagnostics酶標儀(美國MILLIPORE公司)、L420低速離心機(湘儀離心機公司)、基因擴增儀TC-XP(德國Bioer公司)、電泳槽DYC-31D(北京六一廠)。主要試劑：限制性內切酶(上海Sangon公司)、PCR引物(上海Sangon公司)、dNTP(美國MILLIPORE公司)、瓊脂糖(BBI公司)、Taq DNA聚合酶(美國Invitrogen公司)。

1.2.2 樣本采集方法。兩組研究對象在無菌條件下采集5 ml靜脈全血，加入構椽酸鈉試管當中混勻，冰箱保存備用，其中保存的時間應當<7 d，提取血細胞的DNA[3]。

1.2.3 DNA提取方法。取出標本并在室溫條件下解凍，吸取1 000 μl的血液放入到EP管當中，在血液當中添加1 000 μl Tip并且充分混勻，之后3 000 r/min持續分離5 min之后棄上清。重復進行該步驟，如果血樣仍為紅色需要繼續重復。如果沉淀為淡紅色使用200 μl的TE懸浮[4]。添加500 μl的Cell lysis solution到樣本當中充分混勻，添加5 μl的Pro tein K之后在60℃條件下孵育10 min。使用70%的乙醇沉淀顆粒，在空氣當中干燥5 min，從而溶解DNA顆粒到純水當中保存[5]。

表1 兩組研究對象一般資料比較(例，%)

1.2.4 DNA鑒定方法。將提取得到的基因組DNA，在脂糖凝膠當中電泳30 min之后，將凝膠轉移到像系統下完成觀察，溶解DNA使用蒸餾水根據比例稀釋到100 ng/ul，震蕩器持續震蕩30 s之后離心備用，作為PCR反應當中的DNA模板[6]。

1.2.5 PCR擴增方法。PCR反應體系是25μl，離心混勻之后置入PCR擴增儀。2%的瓊脂糖凝膠電泳用來鑒定PCR擴增產物，將特異性內切酶置于恒溫箱當中消化2 h，使用2%的瓊脂糖凝膠電泳來分析結果。

1.2.6 PCR產物分析方法。將制備得到的膠板置入水平電泳槽，使用稀釋的1xTAE液。吸取2 μl擴增產物之后加樣到瓊脂糖凝膠電泳，同時加樣陰性對照(未添加DNA模板)及陽性對照(穩定PCR產物)。通電之后穩壓在100 V，設定電泳的時間為10 min。電泳完成之后取出凝膠，在紫外燈下同Marker條帶對比，從而確定擴增片段的長度，使用PCR-RFLP法實現CXCL12-G801的基因分型[7]。

1.3 統計學方法

檢測數據用SPSS18.0分析，采用卡方檢驗，P<0.05為有統計學意義。

2 結果

CXCL12-G801A同非小細胞肺癌的發病風險關系方面，兩組研究對象的 G/G基因型、A/A基因型以及A/G基因型頻率對比無明顯區別(P>0.05)，見表2。

表2 CXCL12-G801A同非小細胞肺癌的發病風險的關系(例，%)

CXCL12-G801A等位基因分布同非小細胞肺癌的易感性聯系方面，兩組研究對象的多態性等位基因頻率對比無明顯區別(P>0.05) ，見表3。

表3 XCL12-G801A等位基因分布同非小細胞肺癌病理分期的關系

3 結論

肺癌患者當中絕大多數屬于非小細胞肺癌，因為該病的早期診斷率比較低，導致患者在臨床確診之后已經錯過最佳手術時機，所以放化療成為治療非小細胞肺癌晚期患者的常用方法[8]。有研究人員發現非小細胞肺癌患者化療的效果以及預后生存同基因變異以及表達水平存在聯系。非小細胞肺癌患者的預后質量較差，主要是因為該病在長段時間內缺乏典型的臨床癥狀，患者在確診之后己經屬于晚期，難以進行手術治療[9]。臨床實踐顯示，有著類似臨床特征并且采取相同治療措施的患者，生存時間也可能存在區別。這一方面同患者的個體體質存在聯系，另一方面也受遺傳變異等因素的潛在影響。

趨化因子CXCLl2作為基質衍生因子的一種，在淋巴細胞發育、腫瘤發生發展、免疫炎癥調節以及血管生成等領域都有著不容忽視的重要影響。在編碼CXCLl2基因轉錄區存在801位鳥嘌呤(G)突變為腺嘌呤(A)的多態性，也就是CXCLl2-G801A。研究人員最初克隆小鼠骨髓的基質細胞，其中鼠以及人體的CXCLl2有氨基酸序列相同程度>99%。人體當中的CXCLl2-G801A主要是骨萌基質細胞以及組織間質細胞進行分泌，同時在肺、腦、骨骼以及肝臟等多種細胞以及組織當中都有表達[10]。CXCLl2屬于高效淋巴細胞以及單核趨化因子，在人體造血干細胞歸巢骨髓的過程當中有著重要的作用。CXCLl2借助于同受體結合而發揮生物學功能，可以同CXCLl2進行結合的相關趨化因子受體主要是CXCR4以及CXCR7。相關研究的結果顯示，CXCR7在人體腫瘤轉移以及腫瘤侵襲的過程當中都有重要的影響。近年來最新研究結果顯示肌肉瘤細胞當中的CXCR7表達要顯著高于CXCR4，二者同正常橫紋肌細胞對比均呈現出高表達狀態[11]。

研究顯示CXCLl2-G801A基因位點多態性同HIV感染、哮喘以及自身免疫疾病存在一定的聯系。人類CXCLl2一共包括6種基因型，在轉錄的過程當中剪切方式的不同導致不同種型形式的出現。CXCLl2-G801A基因的變異位于CXCLl213基因片段，往往會影響到CXCLl213的產生量。研究人員最早發現這一多態性影響到HIV患者的感染進程[12]。G/A雜合子能夠明顯延緩HIV患者疾病的發展進程，同時A/A純合子HIV患者的生存時間往往比較長，同時是暴露在HIV病毒當中的發病時間也顯著延遲。體外研究的結果顯示，CXCLl2-G801A的多態性保護效果主要是借助于穩定CXCLl2RNA，增加CXCLl2-G801A的表達而實現的。CXCLl2保護效果在自身免疫腦脊髓炎相關動物模型當中也得到證實。本研究的結果顯示，研究組以及對照組的吸煙個體比例是39.0%以及36.6%，兩組研究對象之間不存在明顯的區別(P>0.05)，推測同樣本數量比較有限存在聯系。研究組當中存在家族腫瘤史以及不存在家族腫瘤史的個體比例是78.7%以及21.3%，兩組比較無明顯區別(P>0.05)。研究組以及對照組研究對象的CXCLl2-G801A 3種不同基因型(G/G，G/G以及G/A)的頻率分別為56．0%、4.9%、39．1%以及73．3%、3.0%以及23．7%。兩組患者3種基因型之間的分布對比，無明顯的區別(P>0.05)。研究組還有對照組研究對象的CXCLl2-G801A的G/G基因型分布頻率是59.6%以及66.4%，研究組以及對照組的研究對象CXCLl2-G801A的A/G頻率是30.2%以及25.7%。A/G基因型以及G/G基因型對比而言，兩組研究對象之間的基因型分布無明顯區別(P>0.05)，G/A基因型以及G/G基因型對比而言，兩組研究對象的基因型分布無明顯區別(P>0.05) 。研究組以及對照組研究對象G/A基因的分布頻率是72.2%。75．9%以及27．8%、24．1%，G/A基因的頻率分布無明顯區別(P>0.05) 。本研究采用研究組以及對照組的對比研究，不過本實驗的研究組以及對照組研究對象均來自于我院，受種族、地域、樣本數量、環境以及個體差異等方面因素的影響，本研究只針對CXCLl2-G801A位點以及家族史、吸煙史等危險因素進行分析，存在一定的局限性。這是因為多個危險因素彼此之間可能會發生相互影響，從而生成不同的效果，所以CXCLl2-G801A的基因多態性同非小細胞肺癌的發病風險仍然需要深入的研究。

[1]張 青,劉益飛,章建國,等.趨化因子受體CXCR7在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義[J].中國腫瘤,2014,23(11):952.

[2]龔新華,楊 通,劉文丹,等.趨化因子受體CXCR4在非小細胞肺癌中的表達和臨床意義[J].熱帶醫學雜志,2016,16(7):829.

[3]Ghanem I,Riveiro M E,Paradis V,et al.Insights on the CXCL12-CXCR4 axis in hepatocellular carcinoma carcinogenesis.[J].American Journal of Translational Research,2014,6(4):340.

[4]張霄鵬,胡志娟,孟愛宏,等.血清趨化因子CCL20與非小細胞肺癌胸腔鏡根治術后早期復發及轉移的關系[J].廣東醫學,2015,36(23):3679.

[5]萬善志,韓一平.趨化因子受體CXCR7及其配體CXCL12、CXCL11與非小細胞肺癌關系[J].國際呼吸雜志,2014，1(8):617.

[6]崔豐和,黃江平,周 前,等.CXC趨化因子受體5及其配體CXCL13在非小細胞肺癌中的表達及意義[J].廣東醫學,2016,37(16):2416.

[7]袁 軍,張勝超,鄭如恒,等.趨化因子受體CXCR7在非小細胞肺癌中的表達及意義[J].中國實驗診斷學,2014，1(12):1954.

[8]紀 濤,朱水波,董永強,等.組織因子途徑抑制物-2和趨化因子受體-4在非小細胞肺癌組織中的表達及臨床意義[J].中國臨床保健雜志,2014，2(3):288.

[9]Kim D,Kim J,Yoon J H,et al.CXCL12 secreted from adipose tissue recruits macrophages and induces insulin resistance in mice[J].Diabetologia,2014,57(7):1456.

[10]劉 莉,陸 遠,王 媛,等.EGFR、HER2、CXCR4在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義[J].現代生物醫學進展,2014,14(6):1069.

[11]Qin J.CXCL12 inhibits cortical neuron apoptosis by increasing the ratio of Bcl-2/Bax after traumatic brain injury[J].International Journal of Neuroscience,2014,124(4):281.

[12]陳曉東,任開明,段瓊玉,等.CCR7蛋白和CXCR4蛋白表達水平與非小細胞肺癌患者的預后及相關性研究[J].河北醫藥,2016，1(3):331.

1007-4287(2017)08-1346-03

2016-07-20)