組蛋白去乙酰化酶抑制劑MS-275對卵巢癌SKOV3細胞增殖凋亡的影響

黃玉琴

(湖北醫藥學院附屬襄陽市第一人民醫院， 湖北 襄陽441000)

組蛋白去乙酰化酶抑制劑MS-275對卵巢癌SKOV3細胞增殖凋亡的影響

黃玉琴

(湖北醫藥學院附屬襄陽市第一人民醫院， 湖北 襄陽441000)

目的 探討MS-275對卵巢癌SKOV3細胞增殖凋亡的影響及其作用機制。方法 MTT法檢測MS-275和順鉑單藥及聯合用藥對SKOV3細胞增殖的影響，并計算半抑制濃度IC50；流式細胞術檢測MS-275和順鉑單藥及聯合用藥對SKOV3細胞凋亡的影響；Western-Blot法檢測各組BCL2、survivin及p21蛋白的表達。結果 MS-275和順鉑兩單藥均可抑制SKOV3的增殖，各濃度組具有統計學差異(P<0.05),聯合用藥時可顯著降低順鉑半抑制濃度(P<0.05)；同時兩單藥組可促進SKOV3細胞凋亡(P<0.05)，聯合用藥時凋亡作用更顯著(P<0.05)；MS-275和順鉑可顯著抑制SKOV3細胞BCL-2和survivin蛋白的表達，增強p21的表達(P<0.05)。結論 MS-275抗SKOV3細胞增殖，促進其凋亡及增強順鉑敏感性的機制可能與抑制HDAC活性，抑制BCL-2和survivin蛋白表達，促進p21蛋白表達有關。

MS-275；順鉑；卵巢癌；SKOV3

(ChinJLabDiagn,2017,21:1448)

組蛋白去乙酰化酶(HDACs)主要通過調節組蛋白的乙酰化狀態從而調控染色質的結構和基因的表達。組蛋白的乙酰化狀態由兩個酶家族調節：組蛋白乙酰轉移酶(HATs)和組蛋白去乙酰化酶(HADCs)。HDACs家族分為18種不同亞型；Ⅰ類(HDAC1-3和8)、Ⅱ a類(HDAC4、5、7和9)、Ⅱ b類(HDAC6和10)、Ⅲ類(SIRT1-7)和Ⅳ(HDAC11)[1]。而HDAC抑制劑(HDACIs)可分為5類，包括短鏈脂肪酸、羥肟酸、環狀四肽、脂族酸和苯甲酰胺。其中MS-275是一種苯甲酰胺類HDAC抑制劑。在多種腫瘤實驗中，表現出良好的抗腫瘤活性，包括胰腺癌[2]、乳腺癌[3]、肺癌[4]及黑色素瘤[5]等實體腫瘤。本研究主要以卵巢癌SKOV3細胞為研究對象，探討MS-275對卵巢癌SKOV3細胞增殖凋亡及化療敏感性的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料

SKOV3細胞株購自武漢大學細胞典藏中心，注射用順鉑(凍干型)購自齊魯制藥有限公司，MS-275購自美國Cayman公司，McCoy's 5A液體培養基購自武漢博士德生物工程有限公司，胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司，MTT 試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，兔抗人BCL-2、survivin及p21抗體購自美國Santa公司。

1.2 細胞培養

SKOV3細胞于McCoy's 5A液體培養基(10%胎牛血清)在37℃5%CO2培養箱中培養，細胞貼壁生長，待細胞長至80%左右時，0.25%胰酶(含EDTA)消化傳代。

1.3 MTT法檢測細胞增殖

收集生長對數期細胞，調整細胞密度為1×104/ml， 100 μl/孔接種于96孔板中，PBS填充邊緣孔，置于細胞培養箱繼續培養。細胞貼壁處于生長對數期時，MS-275(2、4、6、8、10 μmol/L)，DDP(2.5、5、10、20和40 μg/ml)，聯合用藥組為MS-275 (5 μmol/L)聯合DDP(2.5、5、10、20和40 μg/ml)濃度梯度處理各組細胞，設置3復孔，同時設置調零孔、對照孔，繼續培養48 h。每孔加入20 μl MTT染色液，繼續培養4 h，后每孔加入150 μl Formanzan溶解液，酶聯免疫檢測儀測定570nm下各孔吸光度，細胞抑制率%=1-(OD加藥孔-OD調零孔)/(OD對照孔-OD調零孔)。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

藥物處理后，收集細胞培養液于15 ml離心管內，2 ml PBS清洗，每孔加入0.25%胰酶400 μl，于培養箱消化約1 min，后將前述收集的細胞培養液加入6孔板終止消化，小心吹散細胞，收集細胞液于15 ml離心管內，2 000 rpm離心3 min，棄上清，1 ml PBS重懸細胞并轉移至1.5 mlEP管內，2 000 rpm離心3 min，棄上清，每管加入Annexin V-FITC結合液150 μl，Annexin V-FITC 5 μl，碘化丙啶染色液5 μl，避光室溫孵育20 min，隨即進行流式細胞儀檢測。

1.5 Western-Blot檢測蛋白表達

各組藥物處理后細胞，細胞裂解液冰上處理30 min，取上清液，BCA測定蛋白含量，加入上樣Buffer，沸水浴5 min，SDS-PAGE凝膠電泳，分離后蛋白電泳轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入一抗(兔抗人BCL-2、survivin和p21多克隆抗體)在4℃條件下過夜12 h，分別加入HRP標記羊抗兔抗體作用1 h，TBST洗膜3次， ECL顯影。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1MS-275對卵巢癌SKOV3細胞增殖的影響

MTT實驗結果表明，不同濃度MS-275及順鉑單藥處理SKOV3細胞48h后均能抑制細胞生長增殖(見表1)，其中MS-275單藥組IC50為5.98±2.19μmol/L，順鉑單藥組IC50為11.39±3.04μg/ml。因此，聯合用藥組時MS-275固定濃度為5μmol/L，聯合用藥組與順鉑單藥組比較各濃度間具有統計學差異(P<0.05)(見表2)，同時聯合用藥組時順鉑IC50為5.60±2.35μg/ml，順鉑單藥組IC50與聯合用藥組順鉑IC50比較，兩者具有統計學意義(t=5.876，P<0.05)，結果顯示，MS-275可顯著抑制SKOV3細胞生長，增強SKOV3對順鉑的敏感性，降低順鉑的半抑制濃度。

表1 不同濃度MS-275和順鉑對SKOV3細胞的抑制率

表2 MS-275聯合順鉑對SKOV3細胞的抑制率

2.2 MS-275對卵巢癌SKOV3細胞凋亡的影響

依據MTT實驗結果，取MS-275濃度5 μmol/L，順鉑濃度10 μg/ml作用SKOV3細胞48 h后檢測各組細胞凋亡情況，結果表明，與對照組相比，兩單藥組及聯合用藥組細胞凋亡率比較差異具有統計學意義(P<0.05)，兩單藥組無明顯統計學差異(P>0.05)，而聯合用藥組與兩單藥組細胞凋亡率相比差異具有統計學意義(P<0.05)(如圖1)。

圖1 MS-275對卵巢癌SKOV3細胞凋亡的影響

2.3 MS-275對SKOV3細胞BCL-2、survivin和p21表達的影響

Western結果顯示，MS-275可顯著增加SKO3細胞中p21蛋白的表達，降低survivin和bcl-2蛋白的表達，差異具有統計學意義(P<0.05)，當與順鉑聯用時，p21蛋白表達更高，與兩單藥組比較差異具有統計學意義(P<0.05)，survivin和bcl-2表達水平顯著降低，與兩單藥組比較差異具有統計學意義(P<0.05)(見圖2)。

圖2 MS-275對SKOV3細胞BCL-2、survivin和p21表達的影響

3 討論

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤，多數患者就診已屬晚期，手術治療和化療治療效果差，遠期存活率低。近年來對卵巢癌的表觀遺傳學研究為卵巢癌的治療提供了一種新思路。卵巢癌惡性進展的分子基礎包括遺傳和表觀遺傳學的改變，而基因的表達由表觀遺傳學控制，如DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA等[6]。其中，組蛋白修飾是通過影響組蛋白之間的功能作用或組蛋白與DNA的連接而改變染色質的結構。組蛋白的乙酰化狀態由兩個酶家族調節;它們是組蛋白乙酰轉移酶(HAT)和組蛋白脫乙酰酶(HDAC)。HDAC家族分為四類：Ⅰ類(HDAC1-3和8)，Ⅱa類(HDAC4,5,7和9)，Ⅱb類(HDAC6和10)，Ⅲ類[sirtuins，(SIRT1-7)]和Ⅳ類(HDAC11)。近年來研究表明，賴氨酸殘基的乙酰化狀態失衡與腫瘤的發生發展密切相關。基因的突變、過表達或易位改變均可影響HAT和HDAC活性，從而使組蛋白乙酰化狀態失衡，促進腫瘤的發生和發展。BCL-2基因的異常活化參與惡性腫瘤的增殖和凋亡，通常認為，順鉑主要引起癌細胞DNA損傷，導致細胞周期停滯，從而誘導細胞凋亡，而研究表明，BCL-2在卵巢癌對順鉑的耐藥性方面發揮了重要作用[7]。Survivin是凋亡家族成員，影響多種細胞功能，包括細胞存活、增殖和侵襲等，在大多數正常組織中，survivin表達極低，而在腫瘤組織中高表達，包括卵巢癌[8]。Survivin的高表達與腫瘤的惡性增殖、低凋亡、化療耐藥、轉移、腫瘤復發和不良預后密切相關[9，10]。p21是一種細胞周期負性調節因子，通過抑制Cyclin E-CDK2和Cyclin D1-CDK4的激活，從而使細胞周期停滯在G1期，此外，通過調控細胞周期參與腫瘤細胞的凋亡[11]。

本文研究了MS-275單藥或聯合順鉑作用于卵巢癌SKOV3細胞，結果顯示，一定條件下，MS-275可顯著抑制SKOV3細胞活性，而與順鉑聯用時可增強順鉑敏感性，對細胞活性抑制作用更顯著。細胞凋亡實驗結果亦顯示，MS-275可誘導SKOV3細胞凋亡。此外，本文還檢測了SKOV3細胞中BCL-2、Survivin和p21蛋白表達情況，Western-Blot結果顯示，MS-275可抑制BCL-2和Survivin蛋白的表達，增加p21的表達水平。由此說明，MS-275抗SKOV3細胞增殖，促進其凋亡及增強順鉑敏感性的機制可能與抑制HDAC活性，抑制BCL-2和survivin蛋白表達，促進p21蛋白表達有關。

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Effect of histone deacetylase inhibitor MS-275 on proliferation and apoptosis of human ovarian cancer cell line SKOV3

HUANGYu-qin.

(XiangYangNo.1Pelople’sHospital,HubeiUniversityofMedicine，Xiangyang441000，China)

Objective To investigate the effect of MS-275 on the proliferation and apoptosis and its mechanism of SKOV3 cells.Methods The proliferation inhibitory rates of SKOV3 cells treated with MS-275 or DDP alone and the combination of MS-275 and DDP were detected by MTT assay，and calculate the half inhibitory concentration (IC50).The apoptosis rate of SKOV3 cells treated with MS-275 or DDP alone and the combination of MS-275 and DDP were determined by flow cytometry.The expression levels of BCL-2、survivin and p21 proteins in SKOV3 cells were examined by Western-Blotting.Results MS-275 and cisplatin alone could inhibit the proliferation of SKOV3,each concentration group has significant difference(P<0.05),United can significantly reduce the half inhibitory concentration of cisplatin(P<0.05).MS-275 or DDP alone can promote apoptosis of SKOV3 cell(P<0.05),MS-275 and cisplatin significantly inhibited the expression of BCL-2 and surviving,and enhanced the expression of p21 in SKOV3 cells (P<0.05).Conclusion The mechanism of MS-275 anti-SKOV3 cell proliferation,promoting apoptosis and enhancing cisplatin sensitivity may be related to inhibition of HDAC activity,inhibition of BCL-2 and survivin protein expression,and promotion of p21 protein expression.

MS-275;cisplatin;ovarian cancer;SKOV3

1007-4287(2017)08-1448-04

R737.31

A

2016-07-28)