圍手術期檢測肝細胞癌病人外周血AFPmRNA和MAGE-1mRNA的臨床意義

趙何偉，顧殿華，周 兵，孫 勇

(南京醫科大學附屬淮安市第一人民醫院 肝膽胰外科，江蘇 淮安223300)

圍手術期檢測肝細胞癌病人外周血AFPmRNA和MAGE-1mRNA的臨床意義

趙何偉，顧殿華，周 兵，孫 勇*

(南京醫科大學附屬淮安市第一人民醫院 肝膽胰外科，江蘇 淮安223300)

近年來，巢式復合酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術被廣泛用于實質器官惡性腫瘤微轉移及復發的檢測[1]。AFP mRNA和MAGE-1 mRNA是肝細胞癌患者常用的檢測指標[2]。本文分析這兩種mRNA在肝細胞癌診斷方面的臨床價值，探討圍手術期聯合檢測對于監測術后腫瘤復發的意義，現報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

病例組(A組)：2015年1月-2016年1月期間我院肝膽外科收治的肝細胞癌患者66例，其中男/女：38/28;年齡45-62歲，平均年齡：(51.2+8.8)歲；診斷依據為術中病理；B組：同期收治的肝炎和肝硬化患者48例，其中男/女：19/29;年齡44-64歲，平均年齡：(50.2+8.4)歲；符合《中華醫學會第十一屆會議》關于病毒性肝炎和肝硬化的診斷標準[3]。排除合并惡性腫瘤的患者；C組：同期收治的肝臟轉移瘤31例，有胃腸、乳腺、肺等其他器官惡性腫瘤病史，CT表現為多發性病灶，增強掃描符合“早出晚歸”的特點，其中男/女：12/19;年齡43-66歲，平均年齡：(51.1+8.7)歲；D組：肝血管瘤50例，符合《中華醫學會第十一屆會議》關于肝血管瘤的診斷標準。其中男/女：23/27，年齡41-65歲，平均年齡：(52.1+7.9)歲；E組：健康志愿者40人，其中男/女：15/25，年齡43-67歲，平均年齡：(51.8+8.7)歲；5組患者的性別和年齡之間不存在統計學差異(P<0.05)，具有可比性。參與本次研究的所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

病例組患者于圍手術期(術前1天、術后7天、術后28天)抽取肘正中靜脈血5 ml，對照組于住院期間或門診抽取任意時間肘正中靜脈血5 ml。通過聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法提取外周血中單核細胞。采用異硫氰酸呱法提取細胞中總RNA。RT-PCR設定的參數為：變性(96℃，30 s)，退火(56℃，60 s)，延伸(68℃，30 s)，循環40輪，所得產物為176 bp和101 bp，產物101 bp在2.0-瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像分析儀照相。表達AFPmRNA和MAGE-1mRNA的細胞株HepG2(北京生物研究院)作為陽性對照。如圖1。

M：DNA-Marker 0：含104癌細胞 1：含 103癌細胞 2：含102癌細胞 3：10個癌細胞 4：1個癌細胞 5：無癌細胞

圖1 外周血AFPmRNA檢測敏感性

1.3 儀器及試劑

RT-PCR Mx3000P由日本SANYO公司提供，RT-PCR檢測試劑盒及Taq DNA聚合酶由美國Promega公司提供，PRMI-1460培養基和DNA-Marker由德國Roche生物技術有限公司提供，其余實驗用緩沖液、稀釋液、分離液均來自北京中山生物科技有限公司。操作過程嚴格按儀器及試劑說明進行。

1.4 肝細胞癌根治術

66例肝細胞癌患者均行肝細胞癌根治術，根治術標準為全麻下徹底切除肉眼可見的腫瘤，清除癌栓，并完成相應區域淋巴結清掃。單個病灶直徑≤2 cm者可在B超引導下通過射頻(RF)進行全病灶毀損。整個手術過程中遵循無瘤原則。

1.5 隨訪

對病例組患者進行為期3個月的隨訪，肝內腫瘤復發和轉移的診斷依據美國肝癌研究協會2006年制定的標準；肝外轉移依據臨床表現及影像學檢查。

1.6 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件對所有數據進行分析處理，計數資料用率表示，組間對比采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 術前病例組和對照組AFPmRNA、MAGE-1mRNA陽性率比較

術前病例組AFPmRNA和MAGE-1mRNA陽性率分別為58.2%和61.8%，二者均陽性占20.0%。肝轉移瘤組AFPmRNA陽性率為35.5%，與病例組差異有統計學意義(P<0.05)。其余各對照組陽性率極低，與病例組的差異有顯著的統計學意義(P<0.01)，詳見表1。

表1 術前病例組和對照組AFPmRNA、MAGE-1mRNA陽性率比較

2.2 圍手術期AFPmRNA、MAGE-1mRNA的檢測與術后復發的關系

通過比較，Ⅱ組患者術后腫瘤復發率最高(76.5%)，Ⅲ組復發率最低(9.1%)，三組的差異有統計學意義(P<0.05)，圍手術期AFPmRNA和MAGE-1mRNA均陽性的患者比單一陽性的患者復發率高，差異均存在統計學意義(P<0.05)，其中IIb組患者復發率為100%;詳見表2。在為期3個月的隨訪中Ⅱ組死亡人數為3例(17.64%)，Ⅲ組死亡人數為1例(4.54%)，Ⅰ組無死亡患者；總死亡率為6.06%；圖2為IIb組中的一個患者通過RT-PCR檢測圍手術期外周血AFPmRNA的凝膠成像結果。

表2 圍手術期AFPmRNA、MAGE-1mRNA的檢測與術后復發的關系

注：1與2相比，P=0.018；1與3相比，P=0.024；2與3相比，P=0.000 Ⅰ組：術前術后持續陽性(Ia：AFPmRNA或MAGE-1mRNA陽性；Ib：二者均陽性)；Ⅱ組：術前陽性，術后7天陰性，術后28天陽性(IIa：AFPmRNA或MAGE-1mRNA陽性；IIb：二者均陽性)；Ⅲ組：術前陽性，術后陰性(IIIa：AFPmRNA或MAGE-1mRNA陽性；IIIb：二者均陽性)。

M：DNA-Marker N：陰性對照 P：陽性對照 I：手術前1天(+) 2：術后7天(-) 3：術后28天(+)

圖2 肝細胞患者圍手術期AFPmRNA檢測結果

3 討論

原發性肝癌作為一種發病率較高的惡性腫瘤，流行病學顯示在亞太地區具有較高的發病率[4]。組織學顯示肝細胞癌的發病率較隱匿，早期的臨床癥狀一般不明顯的表現，這樣給早期肝癌發現和診斷造成了較大的難度，在以往的病例研究資料中顯示肝癌患者的發現大多數處于中晚期，同時由于肝細胞癌的高侵襲性和高復發性等特點，會造成肝細胞癌的死亡率極高[5]。

AFP(甲胎蛋白)作為一種臨床上篩選肝細胞癌變腫瘤術后檢測的重要血清學指標在臨床上使用廣泛,但是極易受到非癌性病變的疾病(慢性乙性肝炎、肝硬化)影響。部分學者指出相對于血清學AFP的蛋白檢測，分子RNA檢測更為準確可靠[6]。AFP的基因位于人類第4號染色體上，胎兒時期在干細胞和卵黃囊中合成，出生后會隨著白蛋白的合成增加而迅速的下降。AFP基因在正常人肝細胞中呈現極低表達狀態，在肝癌患者中呈現高表達[7]。MAGE是一類腫瘤特異性的抗原，是位于人類X染色體長臂末端的MAGE基因家族編碼，由12個基因成員組成，以往研究中顯示MAGE-1基因在原發性肝癌組織中呈現著特異性的高表達狀態[8]。本次研究結果中發現原發性肝癌組中的AFPmRNA、MAGE-1mRNA的陽性率要顯著的高于健康人群、非癌變的慢性肝病和非肝癌患者(P<0.05)。與宋愛英等研究結果一致[9]。外周血液的AFPmRNA、MAGE-1mRNA不但對于診斷原發性肝癌具有重要特異性，在圍術期的復發預測上也具有重要的意義，本次研究中發現在術前術后均陽性的患者隨訪3個月術后復發率要顯著的高于術后陰性的患者(P<0.05)。肝癌患者圍術期外周血中的AFPmRNA、MAGE-1mRNA可以對術后的肝癌復發率具有較好的預測和評價[10，11]。

[1]孫嘉玲，文 彬，孫海濤，等.miRNAs與肝細胞癌的相關性研究進展[J].中國藥理學通報,2017,33(4):445.

[2]Ge T，Shen Q，Wang N.Et Al．Diagnostic values of alpha-fetoprotein，dickkopf-1，and osteopontin for hepatocellular carcinoma[J]．Med Oncol，2015，32(3):59．

[3]Lebofskyr，Decraene C，Bernard V.et al．Circulating tumor DNA as a non-invasive substitute to metastasis biopsy for tumor genotyping and personalized medicine in a prospective trial across all tumor types[J]．Mol Oncol，2015，9(4):783.

[4]Pasqua Rdini L，Pancheri L，Potrich C.et al．SPAD aptasensor for the detection of circulating protein biomarkers[J]．Biosens Bioelectron，2015，68(12):500.

[5]Fiorino S,Bacchi-Keggini ML.possible biomarkers for diagnosis and prognosis of hepatitis B-and C-relited-hepatocellular-carcinoma[J].World J Gnstroeratero，2016，22(15):3907.

[6]Xu Y，An Y，Wang Y.et al.miR-101 inhibits autophagy and en-hances cisplatin-induced apoptosis in hepatocellular carcmnma cells[J].Oncol Rep,2013，29 (5):2019.

[7]Sausen M，Parpart S，Diaz L A Jr．Circulating tumor DNA moves further into the spotlight[J]．Genome Med，2014，6(5):35．

[8]林清華，黃清勇，吳玉英，等.血清甲胎蛋白異質體原發性肝癌的診斷價值[J].實用醫學雜志,2016,32(2):478.

[9]宋愛英，楊 丹，曹德勝，等．平調飲對原發性肝癌患者AFPmRNA、MAGE-1mRN表達的影響[J]．中國中醫藥信息雜志，2010，7(17)：17.

[10]慕海連，高建飛，姜開通，等 ．AFP-L3檢測在良惡性肝病鑒別診斷及肝癌預警中的臨床意義[J]．中國傷殘醫學，2014，22(7)：26.

[11]尚 紅，王毓三，申子瑜．全國臨床檢驗操作規程[M]．第4版．北京：人民衛生出版社，2014：533-536．

南京醫科大學科技發展基金項目(2016NJMUZD086)

1007-4287(2017)08-1362-03

2017-07-20)

*通訊作者