P-15肽促進間充質干細胞向軟骨細胞分化的實驗研究

張 郡，楊利麗，劉欽毅，孟憲榮，劉 睿，王瑞強，田海清，萬 騰

(吉林大學第二醫院，吉林 長春130041)

*通訊作者

P-15肽促進間充質干細胞向軟骨細胞分化的實驗研究

張 郡，楊利麗，劉欽毅，孟憲榮*，劉 睿，王瑞強，田海清，萬 騰

(吉林大學第二醫院，吉林 長春130041)

目的 本研究探討P-15肽能否有效激活、促進軟骨細胞向增殖分化。方法 在不同的培養基培養鼠間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)，培養細胞采用阿辛藍染色和堿性磷酸酶染色，并行堿性磷酸酶定量；免疫組織化學及蛋白免疫印跡檢測軟骨形成特異性標記。結果 ①與對照組相比，P-15肽組呈現大量的堿性磷酸酶陽性細胞，蛋白聚糖的合成明顯增加；②免疫組織化學檢測提示P-15肽組collagen X (COLX)、Runt-related transcription factor 2(RUNX2)、matrix metallopeptidase 13(MMP13)明顯高于對照組；③蛋白免疫印跡檢測提示P-15肽組在RUNX2、MMP-13、Vascular endothelial growth factor(VEGF)、COLX幾個因子表達明顯升高(P<0.05)。結論 P-15肽能有效激活、促進間充質干細胞增殖和向軟骨細胞分化。

P-15肽；軟骨細胞；軟骨內骨化；增殖；分化

(ChinJLabDiagn,2017,21:1425)

隨著當今社會人口老齡化逐年呈上升趨勢，由多種原因導致的骨折等疾病也日益增多。在骨折愈合過程當中，成骨速度是影響愈合速度及愈合率的關鍵因素[1-3]。影響成骨率的一個關鍵因素是相互作用間質細胞的表面細胞外基質[4,5]，其中最主要的是I型膠原蛋白[6]。P-15肽為膠原蛋白Iα-1鏈的一段15個氨基酸序列，為人工合成的人類Ⅰ型膠原蛋白細胞結合域[7]?，F已證明P-15肽通過α2β1亞基發揮作用，誘導骨細胞和成骨細胞發生粘附，遷移，增殖和分化[8,9]。P-15肽調節細胞數目和組織結構可能的機制是增強活性細胞的貼附和調節細胞的凋亡[10]。當前，P15肽作為增強劑吸附于無機骨基質促進脊柱融合手術中的骨化正在進行臨床試驗[11]。本研究旨在檢測外源性P-15肽對間充質干細胞向軟骨細胞形態分化、堿性磷酸酶水平以及對軟骨細胞基因和蛋白表達的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞培養及染色

該實驗選用鼠間充質干細胞在DMEM培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)中在37度，5%CO2的孵箱內培養。將第6代細胞分為P-15肽組和空白對照組分別接種于均勻鋪有P-15肽的培養皿和未做任何處理的培養皿中，制備軟骨誘導分化培養基，每2天換液一次，培養12天，細胞培養的溫度為37度，濕度95%，CO2濃度為5%。提取第6天的細胞進行染色分析，剩余細胞培養至12天進行下一步分析。

1.2 細胞團的培養及染色

將培養出的第6代細胞利用0.25%的胰酶消化，在無菌的瓊脂糖溶液(42℃，2%W/v PBS)里重懸，最后細胞密度為20 000個/μl。在瓊脂糖包裹之前用低聚甲醛將細胞固定作為陰性對照組，瓊脂糖包裹后未做任何處理的作為陽性對照組，實驗組分3組：BSA組、Ⅰ型膠原組、P-15肽組分別加入等重的牛血清蛋白(BSA)、Ⅰ型膠原、P-15肽。每組取10 μl混合液接種于24孔板，37度孵育2 h，在細胞周圍添加軟骨培養基，每2天換液一次，第12天取出細胞團用10%PBS沖洗1 h，然后70%乙醇固定、常規石蠟包埋、切片及堿性磷酸酶染色、定量。

1.3 免疫組織化學分析

將第6代細胞分為P-15肽組和空白對照組分別平鋪在含有P-15肽和空白培養皿內，結束后用PBS洗滌2次，再用95%乙醇脫水固定5 min，再用PBS洗滌3次后計入封閉液2 h，然后分別加入1∶50濃度的一抗：COLx、MMP-13、RUNx2，4℃環境中過夜后吸出一抗，PBS洗滌3次，加入帶有熒光標記的二抗室溫孵育1 h。

1.4 蛋白免疫印跡分析

培養12天的細胞用冰PBS洗滌后，2 000 g離心5 min，棄上清，加入細胞裂解液300 μl，室溫震蕩20分鐘，14 000 g離心15 min，取上清液進行蛋白免疫印跡分析。

1.5 統計方法

2 結果

2.1 細胞培養及染色結果MSCs進行阿辛藍染色和堿性磷酸酶染色，如圖1所示，與對照組相比實驗組呈現大量堿性磷酸酶陽性細胞，蛋白聚糖的合成較對照組明顯增加。

2.2 細胞團培養及染色結果

MSCs在瓊脂糖或混有膠原或P-15肽的瓊脂糖培養基中培養12天然后行堿性磷酸酶染色。結果如表1所示，實驗組的細胞堿性磷酸酶染色較對照組明顯升高(P<0.05)。

圖1 MSCs阿辛藍染色和堿性磷酸酶染色

表1 培養12天堿性磷酸酶定量(kDa)

P<0.05

2.3 免疫組織化學和蛋白免疫印跡

免疫組織化學結果如圖2所示P-15肽組COLX、RUNX2、MMP-13熒光強度明顯強于對照組。蛋白免疫印跡結果如表2所示，P-15肽組間充質細胞在成軟骨培養基培養12天后的COL X,Runx2,VEGF和MMP13水平較對照組明顯升高。

免疫組織化學和蛋白免疫印跡結果提示P-15肽能夠增強MSC向軟骨細胞的分化。

圖2 Runx2,COL X和MMP13免疫組織化學染色

ColXRunx2VEGFMMp?13對照組810．887±73．425498．717±48．369400．686±18．480573．867±21．286P?15組1131．652±102．34832．472±64．136732．751±119．7841348．441±119．784

P<0.05

3 討論

骨折愈合的過程也是骨的再生過程，骨折愈合期間軟骨內骨化在骨折修復和成骨過程當中發揮著至關重要的作用[12,13]。在軟骨內骨化成骨的過程中，軟骨細胞不斷增殖、分化成熟，肥大區軟骨細胞退化死亡，軟骨基質鈣化并被骨組織取代，從而完成軟骨內成骨的過程[14,15]。軟骨細胞在細胞外基質中的增殖與分化，依賴于細胞外基質的信號轉導[4,5]。

在細胞增殖與分化的過程中，人工合成的P-15肽被首次發現參與骨折修復與重塑過程當中[16]。有實驗研究發現，相對于對照組P-15肽能明顯增強鉆孔缺陷的皮質骨形成[17]。P-15肽調節細胞數目和組織結構可能的機制是增強活性細胞的貼附和調節細胞的凋亡[10]。

軟骨細胞的堿性磷酸酯酶水平是軟骨細胞鈣化的標志性酶，其活性和數量，可以被認為是軟骨鈣化程度高低的標志。蛋白聚糖是軟骨細胞外基質的重要組成成分，維持著軟骨的彈性和可塑性，蛋白聚糖的合成與分解代謝平衡能有效維持軟骨外基質結構與功能[18]。本研究對P-15肽促進間充質干細胞的成熟以及向軟骨細胞分化的假說進行驗證，結果表明P-15肽干預的鼠間充質干細胞，呈現堿性磷酸酶、蛋白聚糖的合成較對照組明顯增加，同時堿性磷酸酶定量結果也提示能明顯促進堿性磷酸酶的增加(P<0.05)，表明P-15肽可以顯著促進間充質干細胞的增殖，同時向軟骨細胞系轉化和軟骨內骨化。

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P15 peptide enhances Mesenchymal stem cells chondrocyte differentiation and formation：a experimental study in vitro

ZHANGJun,YANGLi-li,LIUQin-yi,etal.

(TheSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China)

Objective The purpose of the experiment is to clarify whether SyntheticpeptideP15 can promotes chondrogenic differentiation and formation in vitro.Methods Mesenchymal stem cells (MSCs) was cultured in differentiation media.Alkalinephosphatase and alcian blue staining was performed.Chondrogenic markers were measured by Western blot and fluorescent immunohistochemistry.Results Compared with the uncoated controlplates the P15 peptide cultured cells showed intense alkalinephosphatase(P<0.05) and alcian blue staining.Immunofluorescent staining indicatedthat there was a significant increase in the levels ofrunt-relatedtranscription factor-2 (RUNX2),matrix metalloproteinase-13(MMP13),and collagen X (COLX) proteins.Increased expression of RUNX2,COLX,MMP13 and vascular endothelial growth factor (VEGF)was also confirmed byWestern blot analysis(P<0.05).Conclusion P15 peptide enhances chondrocyte differentiation and formation in vitro.

P-15peptide;chondrocyte;Cartilage ossification;proliferation ;differentiation

1007-4287(2017)08-1425-03

Q813

A

2016-09-26)