VR-2332菌株豬繁殖與呼吸綜合征病毒活疫苗功效的相關研究

張玲妮，李岑岑（編譯）

（華中農業大學，湖北 武漢 430070）

VR-2332菌株豬繁殖與呼吸綜合征病毒活疫苗功效的相關研究

張玲妮，李岑岑（編譯）

（華中農業大學，湖北 武漢 430070）

薦語：來自VR-2332菌株（2型PRRSV的原型）的減毒疫苗（IngelvacPRRS MLV）已顯示能有效抵抗異源病毒分離物，并在許多國家都被廣泛使用。然而，據報道，HP-PRRS的病毒株表現出不同的毒力，這可能影響疫苗功效的評估。最近，Lager等人報道說，2007年分離的越南HP-PRRSV和中國的HP-PRRSV在用IngelvacPRRS MLV免疫的豬中具有不同的致病性潛力。Thuy等人比較了2007年至2010年間分離株中ORF5的基因突變并發現其存在一些差異。這些研究結果表明，需要進一步評估目前可用的活疫苗的療效。

李岑岑，女（1989-），山東淄博人，畢業于華中農業大學動物科技學院，博士。

自20世紀80年代后期出現以來，豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）已經在大多數養豬國家流行起來。PRRS的病原體是PRRS病毒（PRRSV），它是單股正鏈RNA病毒。2006年，中國出現了導致所有年齡的豬高熱和死亡的高致病性PRRS（HP-PRRS）。高毒性2型PRRSV已被檢測到，并鑒定了非結構蛋白2（nsp2）中常見的缺失位點。HPPRRS由具有共同遺傳特征的病毒引起，現在已經迅速蔓延到東南亞各國。在這里，我們以無特定病原體（SPF）仔豬作為試驗對象，通過評估臨床特征，血清、唾液和器官中的病毒載體及肉眼和微觀病變來評估越南2010年分離株的體內致病力和毒力以及IngelvacPRRS MLV的有效性。

1 材料和方法

1.1 動物

4周齡的雜交SPF豬，在進行試驗之前，用市售的ELISA試劑盒檢測發現這些豬為PRRSV陰性豬。這些豬被飼養在一個封閉的環境中。

1.2 病毒

2010年，在越南1頭感染了HPPRRS的豬體內分離并經MARC-145細胞傳代培養三代后獲得此病毒（10186-614菌株）。這個隔離株是由豬的肺泡巨噬細胞（PAMs）培養并傳了三代之后得到的。

1.3 試驗設計和尸體剖檢

將25頭豬隨機分為3組：第1組（n=10）肌肉注射2 mL 2型PRRSV減毒活疫苗，并在接種4周后，用含有PRRSV 10186-614菌株1×105．550%組織感染劑量（TCID50/mL）的鼻噴霧裝置對其進行人工感染。第2組（n=10）僅被感染了病毒，未免疫疫苗；第3組（n=5）作為對照組，未感染PRRSV病毒也未免疫疫苗。在試驗過程中監測豬的體溫、臨床癥狀和體重。所有的豬在接種病毒14 d（dpi）后進行剖檢，并收集其組織用于病理、病毒學和細菌學的檢測。

1.4 血清學和PRRSV RNA的數量

采集接毒前28、21、14、7 d和接毒0、1、2、3、5、8、11和14 d豬只的血清，并檢測PRRSV的抗體和PRRSV RNA的數量。用棉簽來收集接毒0、1、2、3、5、8、11和14 d時每頭豬只的唾液，以便來定量PRRSV的RNA。在解剖時，收集肺、扁桃體、支氣管淋巴結、肝、腎和脾臟，并檢測這些組織中PRRSV的RNA含量。

1.5 開放閱讀框5區域的序列分析

在HP-PRRSV接毒前7 d和接毒0 d、3 d和8 d的血清中提取的病毒RNA中隨機挑選3個RNA樣本。為了檢測ORF5基因，使用已發表的PCR引物對（P420：5’-CCATTCTGTTGGCAATTTGA-3’和P620：5’-GGCATATATCATCACTGGCG-3’）提取的RNA進行一步法RT-PCR。

1.6 病理學檢查

在剖檢時，對每頭豬的所有器官進行外觀檢查，并將肺部總體的損傷從0到100進行評分。分別給7個肺葉（左右兩側的前端、中間和尾部，還有副葉）標記一個數字并對其進行評分，從而反映可見性肺炎的嚴重程度，最后對所有肺葉的總得分進行評估。對上述7個肺葉以及肝臟、腎臟、脾臟、心臟、腦和淋巴器官做了組織切片并用顯微鏡進行觀察。顯微鏡下對肺損傷進行評分，以此來反映間質性肺炎的嚴重程度，然后計算整體的平均值。

1.7 細菌分離

在試驗開始時收集每頭豬的鼻拭子，并從每個尸體上收集組織（肺、肝臟、腎臟、脾臟、心臟和腦）用于細菌實驗。

1.8 數據分析

使用R語言里的“EZR”軟件包對數據進行多重比較和各自之間的兩兩比較分析，P＜0．05被認為具有統計學意義。

2 結果

2.1 體溫

在感染PRRSV病毒之前，3組在平均直腸溫度方面沒有顯著差異。在接毒后的第2天到第14天，第1組和第2組的平均直腸溫度顯著高于對照組。在接種第9天到第13天之間，第1組的體溫顯著低于第2組。

2.2 臨床癥狀

在接毒2 d或3 d一直到接毒第8天，兩組都出現食欲不振和呼吸急促的癥狀，且第1組的大部分豬都在恢復中。相比之下，接毒第9天后，第2組的豬仍然出現食欲不振和呼吸急促的癥狀，并伴有嚴重的咳嗽和腹式呼吸。這些臨床癥狀一直持續到實驗結束。從接毒第9天到第14天，第1組的臨床評分顯著低于第2組。在未感染的豬中沒有觀察到臨床癥狀。

2.3 日增重

在接毒第3天后，3組之間的平均日增重明顯不同。在感染病毒后，第2組中平均日增重沒有增加。在接毒第8天后，第1組和第2組之間的平均日增重存在顯著差異。

2.4 血清與唾液里的病毒載量

兩個接毒組從接毒第1天到第5天血清病毒載量大幅度上升，在接毒第5天到達高峰。從接毒第5天到第14天，第2組血清中的病毒載量始終居高不下，而第1組的血清病毒載量迅速下降。兩個接毒組在接毒第1天到第14天，在口腔液中都可以檢測到病毒，并在病毒攻擊后的第5天到達高峰。但在接毒第11天到第14天，這兩個接毒組的病毒釋放存在顯著差異。在第3組豬的血清或者口腔液中都沒有檢測到病毒RNA。

2.5 ORF5區域序列分析

為了證實RT-PCR的產物是由第1組和第2組在接毒1天后的病毒RNA擴增而來，每個RT-PCR產物的序列都與疫苗株和HP-PRRSV進行了比較。對于接毒前7天和接種0天擴增的PCR產物而言，ORF5與疫苗株享有99．5%～99．7%的核苷酸同一性，與HP-PRRSV則是88．6%～89．1%。

2.6 PRRSV抗體

第1組的一些豬在免疫疫苗7天后檢測到了PRRSV抗體，在免疫第14天除了1頭豬（S/P=0．38）以外其他所有豬都超過了分界線（S/P=0．4）。這個S/P比值是逐漸上升的，在免疫第8天時觀察到一個瞬時增加。在第2組中，在接毒第8天觀察到PRRSV抗體的陽性轉化，而且病毒抗體的S/P比值呈逐漸上升趨勢。相反的，在第3組中沒有觀察到抵抗PRRSV的抗體。

2.7 組織中的病毒RNA

檢測第1組和第2組中所有檢測器官（肝臟、腎臟、肺、脾臟、扁桃體和支氣管淋巴結）的PRRSV的RNA含量。第1組中肺臟、肝臟、腎臟和扁桃體中PRRSV的RNA的數量低于第2組。然而，第1組和第2組里脾臟和支氣管淋巴結里PRRSV RNA的數量之間無顯著差異。第3組沒有檢測到PRRSV的RNA。

2.8 組織學病變

第2組豬只的主要嚴重病變為肺炎和胸腺萎縮。這些豬的肺部病變特征為全葉出現黃褐色腫脹或者前葉、中葉、副葉和尾葉的額部出現邊界清晰的深紅色肺炎癥狀。相反，第1組中大多數豬的肺部都出現輕微的變色腫脹。第2組的平均肺部病變評分為57．9±18．3，第1組為12．5±6．9，二者之間存在顯著差異。且在第1組中未觀察到胸腺萎縮。

顯微鏡下，第2組的肺炎病變特征是重癥壞死性間質性肺炎，還能觀察到II型肺細胞肥大增生，巨噬細胞間隔浸潤以及多灶性肺泡壁血管周圍組織淋巴細胞浸潤。相反，第1組的肺炎病變特征是多灶性肺泡壁血管周圍發生輕微到中度的組織淋巴細胞浸潤。第1組的微觀肺炎評分（1．2±0．5）顯著低于第2組（2．7±0．5）。值得注意的是，在第3組中沒有觀察到總體或微觀損傷。

2.9 細菌檢驗

在試驗開始前，從每組3頭豬的鼻拭子中分離出鏈球菌，但是這些豬的剖檢結果相對其他豬來說并不顯著。

3 討論

我們將越南2010年高致病性PRRSV的分離株通過對SPF豬鼻接毒再現了HP-PRRSV的病理狀況，并評估了市售的2型PRRSV疫苗的功效。與非免疫動物相比，用改良的PRRSV活疫苗免疫后，豬只的病毒復制量、唾液中病毒釋放、臨床癥狀和病變嚴重程度發生了顯著降低現象，而平均日增重明顯提高。

這項研究中未免疫疫苗的動物出現持續高熱和嚴重間質性肺炎的癥狀。這些發現與用高致病性PRRSV感染動物出現的病理特征相符。此外，未免疫疫苗的豬發生了胸腺萎縮，Guo等人提出這是HP-PSSRV感染的獨特病理特征。上述結果可能可以證實這種實驗模型可以用來評估HP-PRRSV感染后的結果。

雖然免疫組和未免疫組在感染病毒后直腸溫度都升高，但免疫組顯著降低了高燒的持續時間。在退熱的同時，免疫組的呼吸道癥狀也明顯減輕。組織學檢測顯示，免疫組豬只的肺炎病變范圍和程度均低于未免疫組的豬只。這些臨床癥狀和病理結果的改善可能會導致體重的增加。qRT-PCR的縱向數據表明免疫組豬只的病毒血癥增加，且與未免疫組相比其發生了迅速地下降。考慮到免疫組在早期會發生發熱現象，這種病毒的動力學變化可能表明在早期階段，疫苗免疫有助于清除感染組織中的病毒，而不是抑制病毒的增殖。這個研究的幾個限制因素值得一提。首先，雖然我們使用了對10186-614菌株有效的疫苗（Ingelvac PRRS?MLV），但是很難預測其是否對其他HP-PRRSV變異體是否有效。其次，我們沒有闡明體液免疫和細胞免疫是如何抑制豬中病毒的復制。

總之，我們發現免疫改進后的PRRSV活疫苗可以顯著降低病毒的復制能力和病變的嚴重程度。此外，它有助于改善感染了2010年越南HPPRRSV分離株的豬只的臨床癥狀。這些發現表明這種疫苗在控制HPPRRSV上具有潛在的廣泛應用。此外，PRRSV的繼發感染會造成經濟損失。免疫疫苗后，病毒對免疫系統器官的影響會減少，這可能會抑制繼發性感染，并有助于降低經濟成本。

（原文作者：Iseki H,Kawashima K,Tung N,Inui K,Ikezawa M,Shibahara T,Yamakawa M；原文鏈接：https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28239040）

2017-04-19）