加替沙星膠聯羊膜藥膜治療細菌感染性角膜炎模型兔的療效

劉燕霞 趙 敏

(重慶醫科大學附屬第一醫院，重慶 400050)

加替沙星膠聯羊膜藥膜治療細菌感染性角膜炎模型兔的療效

劉燕霞 趙 敏

(重慶醫科大學附屬第一醫院，重慶 400050)

目的 探討加替沙星膠聯羊膜藥膜治療細菌性角膜炎兔模型的效果。方法 參照常規方法制作加替沙星膠聯羊膜藥膜。新西蘭大白兔25只中隨機取5只，左眼為對照眼，右為實驗眼。待動物完全麻醉后，將制成的藥膜片覆蓋于眼球表面后揭去表層的硝酸濾紙，并用尼龍縫線間斷縫合固定于角膜緣淺層鞏膜。對照眼結膜囊內滴入配制的3 mg/ml加替沙星溶液50 μl，并于12 h后重復滴眼一次。分別于術后和首次滴眼后1 d、2 d、3 d、4 d、5 d雙眼同時抽取房水。利用高效液相色譜法檢測實驗眼和對照眼房水中加替沙星濃度。制作金葡球菌性角膜潰瘍動物模型，將潰瘍形成后的動物分為4組，每組4只，分別為A組：生理鹽水組，B組：加替沙星滴眼液組，C組：加替沙星膠聯羊膜藥膜組，D組：單層羊膜組。取各組潰瘍愈合的兔眼作細菌培養，檢查各組金葡球菌性角膜潰瘍的細菌陰轉情況。取潰瘍組織石蠟包埋、切片，HE染色。同時對各組角膜潰瘍動物的療效進行判定。 結果 實驗眼各時間點房水中均可測出加替沙星，濃度0.036～0.274 μg/ml，實驗組第1、2、3天房水中加替沙星濃度與第4、5天相比明顯較高；對照眼僅在第1天和第2天檢測出加替沙星，且濃度顯著低于實驗眼(P<0.05)。角膜潰瘍，加替沙星滴眼液和藥膜均療效顯著，且藥膜在干預3 d和7 d后評分均顯著低于加替沙星滴眼液干預(P<0.05)；加替沙星滴眼液和藥膜在干預后細菌培養情況均出現一定程度的陰轉，而另外兩組僅生理鹽水干預7 d后出現1例陰轉。角膜切片HE染色觀察加替沙星滴眼液和藥膜干預角膜上皮及基質有輕微水腫，炎癥細胞浸潤大量減少；加替沙星滴眼液和藥膜均療效顯著，痊愈率及好轉率分別為(75.00% vs 87.50%)和(100.00% vs 100.00%)。結論 加替沙星膠聯羊膜藥膜對金葡球菌性角膜潰瘍具有良好的治療作用，開辟了治療細菌性角膜潰瘍的另一途徑。

加替沙星膠聯羊膜藥膜；細菌性角膜炎

細菌性角膜炎是世界性的常見致盲眼病，多因細菌感染而致角膜上皮缺損及相關基質壞死，嚴重損害視力〔1〕。目前在臨床上多以抗生素為主進行局部的抗感染治療。感染角膜的細菌對某種抗生素敏感，但該種抗生素可能會因其滲透力弱或在局部保留時間較短等原因，僅有少量的藥物透過角膜發揮藥效，其他大部分在結膜被吸收或流入鼻腔，難以達到較好的治療效果〔2〕。羊膜可促進上皮形成，抑制炎癥、減少新生血管形成，抑制纖維化〔3～5〕。纖維蛋白膠是近年來廣泛應用于臨床手術過程中發揮止血、封閉局部組織的生物制劑，具有生物相容性、可吸收性、無毒性等特點。我室在已有的實驗基礎上，將加替沙星與纖維蛋白膠混合，并研究了加替沙星纖維蛋白膠的體外緩釋作用及持續抑菌作用，將加替沙星纖維蛋白膠與羊膜膠聯，制成一種新型復合生物學材料——加替沙星膠聯羊膜藥膜(GFBAM)。本文擬對GFBAM在體內的緩釋作用進行初步的實驗研究。

1 材料與方法

1.1 一般資料 加替沙星、纖維蛋白膠、1%熒光素鈉溶液(與注射用水以1∶3的比例稀釋成0.25%濃度，避光保存待用)。新西蘭大白兔25只，雌雄不分，體重2～2.5 kg，無眼疾，均由本校動物實驗中心提供。動物手術顯微鏡：上海醫用光學儀器廠，眼科顯微器械：蘇州醫療器械廠，羊膜壓貼器：自制。

1.2 方法

1.2.1 GFBAM的制備 羊膜的制備參照Grueterich 等〔6〕方法。加替沙星膠聯羊膜的制備方法：精密稱取15 mg加替沙星，溶于2.5 ml纖維蛋白膠催化液中，并與2.5 ml纖維蛋白膠主體液分別注入混合注射器中備用。取貼載于硝酸纖維素濾紙甘油保存后的羊膜片，0.9%生理鹽水充分復水30 min，平整鋪放于超凈臺上，紗布輕拭去表面水分，噴涂槍將加替沙星纖維蛋白膠均勻噴涂于羊膜上，用自制羊膜壓貼器輕壓于表面2～3 min，確保加替沙星纖維蛋白膠與羊膜黏合緊密，制成GFBAM。大體觀察藥膜的直徑為20 mm，厚度0.1～0.3 mm，加替沙星纖維蛋白膠濃度為3 mg/ml。

1.2.2 加替沙星膠聯羊膜移植后兔房水藥物濃度測定 從25只新西蘭大白兔中隨機取5只進行實驗，左眼為對照眼(n=5)，右眼為實驗眼(n=5)。用速眠新Ⅱ(長春軍事醫學科學院軍事獸醫研究所)肌肉注射，0.15 ml/kg全麻動物，鹽酸奧布卡因滴眼液(參天制藥)實驗眼表面麻醉。術中如有必要速眠新Ⅱ可以再次給藥，給藥劑量為首次減半。待動物完全麻醉后，常規消毒鋪巾，開瞼，剪除第三眼瞼。將方法1.2.1制成的藥膜片覆蓋于眼球表面后揭去表層的硝酸濾紙，并用8/0的尼龍縫線8針間斷縫合固定于角膜緣淺層鞏膜。手術結束同時，對照眼結膜囊內滴入3 mg/ml加替沙星溶液50 μl，并于12 h后重復滴眼一次。分別于術后和首次滴眼后1 d、2 d、3 d、4 d、5 d雙眼同時抽取房水。取樣時，采用速眠新Ⅱ肌肉注射(劑量同前)，全麻動物，取下實驗眼的藥膜，鹽酸奧布卡因滴眼液雙眼表面麻醉，于角膜緣內9點位抽取房水0.2 ml，各組每個時間點取5只眼，所有樣品注明標號置于-20℃冰箱中冷凍保存，待測。參考丁文婷〔7〕測定房水中加替沙星的高效液相色譜法(HPLC)，檢測實驗眼和對照眼房水中加替沙星濃度。

1.2.3 金黃色葡萄球菌(金葡球菌)液的制備〔8〕實驗前2 d將4℃冰箱保存的金葡球菌接種在瓊脂平板上，置于37℃常規培養24 h，取一環細菌接種于2 ml肉湯培養基內37℃ 8 h，再吸取1 ml菌液傳代于50 ml肉湯培養基內37℃16 h，用無菌生理鹽水將細菌菌液稀釋成3×109個/ml濃度，保存于EP管中備用。

1.2.4 金葡球菌性角膜潰瘍模型制備及分組 參考1.2.2所用的麻醉方法麻醉后，用微量注射器定量將5 μl金葡球菌液注射兔的角膜中央基質中。接種9 h后，將潰瘍形成且炎癥發展一致的兔分為4組，每組各4只，8只眼。A組：生理鹽水組，B組：加替沙星滴眼液組，C組：GFBAM組，D組：單層羊膜組。A組：予以生理鹽水滴眼，qid，每次4滴；B組：予以3 mg/ml加替沙星滴眼液滴眼，qid，每次4滴。C組：行藥膜移植術，藥膜的制備按照“1.2.1”操作，在制備藥膜時加入3 d量的加替沙星，由于加替沙星纖維蛋白膠和藥膜中藥物的釋放以1～3 d更顯著，所以每3 d更換一次藥膜。D組：在整個角膜表面覆蓋一單層羊膜并縫合固定于角膜緣淺層鞏膜。定時在干預1、3、7 d后在大體和裂隙燈下觀察角膜潰瘍情況，并參考相關文獻〔9,10〕潰瘍評分標準進行相應的癥狀評分。

1.2.5 細菌培養 在干預前及干預1、3、7 d后，速眠新Ⅱ全麻后，用無菌棉簽蘸取生理鹽水后涂擦各組潰瘍兔眼角膜處，將涂擦的無菌棉簽的棉絮放入無菌試管中，蓋上軟塞，作細菌培養，定性判斷各組金葡球菌性角膜潰瘍的細菌陰轉情況。

1.2.6 組織病理學檢查 取各組潰瘍干預7 d后的角膜各一只，10%甲醛固定，石蠟包埋、切片，HE染色。

1.2.7 療效判定 痊愈：潰瘍愈合，形成白斑，其余角膜透明，無新生血管，細菌培養陰性，組織病理學檢查潰瘍面角膜上皮形成，實質層無或有個別中性白細胞浸潤。好轉：潰瘍愈合，形成灰白色混濁斑，其余角膜較混濁，有新生血管形成，細菌培養陽性，組織病理學檢查潰瘍面雖然形成角膜上皮，但不甚平整，實質層有中性白細胞浸潤。無效：角膜穿孔。

1.3 統計學處理 使用SPSS13.0軟件對各項資料進行統計分析，組間比較采用t或χ2檢驗。

2 結 果

2.1 加替沙星膠聯羊膜移植后兔房水藥物濃度測定結果 實驗眼各時間點房水中均可測出加替沙星，濃度0.036～0.274 μg/ml，實驗眼第1、2、3天房水中加替沙星濃度與第4、5天相比明顯較高(P<0.05)，說明藥膜在前3 d釋放較多。實驗眼在第1、2天房水中加替沙星濃度均顯著高于對照眼(P<0.05)，且對照眼在第3、4、5天的房水中已檢測不到加替沙星藥物濃度。見表1。

2.2 不同干預對模型動物角膜潰瘍的治療效果 A組和D組干預后，角膜潰瘍的癥狀評分均呈一定的增長，且D組癥狀評分均比A組高，可能與羊膜移植后眼瞼粘連嚴重而使膿液大量增加有關。而B組和C組經干預后癥狀評分均明顯下降(P<0.05)，且C組干預3 d和7 d后評分均顯著低于B組(P<0.05)。見表2。

2.3 四組分別干預后兔眼分泌物細菌培養陰轉率比較 B組和C組，細菌培養均出現一定程度的陰轉，陰轉率除B組干預1 d外，其他均顯著高于A組(P<0.05)；且C組的細菌培養陰轉率高于B組，但差異無統計學意義(P>0.05)。A組和D組干預后僅A組在生理鹽水干預7 d后出現1例陰轉，推測可能與角膜潰瘍自行修復愈合有關。見表3。

表1 加替沙星膠聯羊膜移植后房水藥物濃度

與對照眼比較：1)P<0.05

表2 不同干預對模型動物角膜癥狀評分的影響分)

與干預前比較:1)P<0.05；與A組干預后比較:2)P<0.05；與B組干預后比較:3)P<0.05

表3 四組干預后兔眼分泌物細菌培養陰轉率比較〔n(%)，n=8〕

與A組干預后比較:1)P<0.05

2.4 病理學檢查 A組兔眼角膜上皮及基質層腫脹，特別是基質的右上部位深度結構紊亂，可能由此部位乃注射部位所致，且大量炎癥細胞浸潤，角膜上皮缺損。B組和C組的角膜上皮及基質有輕微水腫，炎癥細胞浸潤減少，基質較完整。D組角膜上皮及基質層腫脹，整體深度結構均較為紊亂，大量炎癥細胞浸潤，角膜上皮缺損。見圖1。

2.5 四組分別干預后兔細菌性角膜潰瘍的療效評價 B組、C組痊愈率及好轉率差異無統計學意義(P>0.05)，但均要顯著高于A組(P<0.05)，主要表現為角膜潰瘍愈合，膿性分泌物消失，混合充血減輕，角膜水腫消退，潰瘍形成角膜白斑，其余角膜透明。A組有1例痊愈，可能是因為金葡球菌致病力弱，所以角膜潰瘍可以自行修復。D組在3 d時發現有大量膿液在羊膜下流動，而7 d時膿性分泌物明顯吸收減少，羊膜溶解脫落，角膜與A組相比更混濁，光滑透明度更差，故痊愈率和好轉率均低于A組。見表4。

圖1 兔角膜組織病理學切片檢查

組別痊愈好轉無效痊愈率(%)好轉率(%)A組1(12.50)3(37.50)4(50.00)12.5050.00B組6(75.00)2(25.00)0(0.00)75.001)100.001)C組7(87.50)1(12.50)0(0.00)87.501)100.001)D組0(0.00)2(25.00)6(75.00)0.0025.00

與A組干預后比較:1)P<0.05

3 討 論

細菌性角膜炎主要的致病細菌為革蘭陽性球菌和革蘭陰性桿菌。革蘭陽性球菌中的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)占較大比例〔11，12〕，革蘭陰性桿菌中的銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，P)和莫拉菌(moraxella，M)簡稱為SSPM感染。據日本橫濱大學近年來對120例細菌性角膜炎的統計，SSPM感染占72.5%(87例)，上述4種致病細菌分別為15%(18例)、11.7%(14例)、35.8%(43例)、10%(12例)；美國、加拿大也有同樣的統計結果。這種傾向不僅出現在工業發達國家，發展中國家也是如此。菲律賓最近對1 762例的統計，SSPM感染占92.2%(1 624例)，分別為4.7%(83例)、42.31%(745例)、26.6%(468例)及18.6%(328例)〔4,5〕。

體外生物力學性能實驗證明膠聯羊膜比單層羊膜具有更優越的彈性性能、柔韌性和可塑性，有足夠的強度以承受縫合力和眼表面張力，也有一定的彈性能夠彎曲和隨眼球運動時擴張而不壓迫眼球。動物體內實驗證明在深層角膜損傷和堿燒傷治療上，膠聯羊膜與單層羊膜相比，可以在創面保持更長時間以達到促進組織損傷修復的作用，因而用于眼表移植更具有優越性。纖維蛋白膠是一種具有三維結構的纖維蛋白多聚體，其形成的網架狀結構類似一塊海綿，其中的網眼形成儲藥庫，隨著凝膠的纖溶和吸收，藥物緩慢釋放。由于纖維蛋白膠在體內具有相對穩定性，一般在1～2 w內逐漸被機體降解吸收。這樣，纖維蛋白膠就起到暫時貯存和緩釋藥物的作用，能提高局部藥物濃度，延長藥物在局部的滯留時間〔13〕。有實驗研究證明，加替沙星對各種革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均具有較強的活性，且與頭孢唑林和妥布霉素聯合用藥相比針對潰瘍的愈合率更佳〔14,15〕，是目前治療角膜細菌感染的有效藥物之一。本研究主要對GFBAM進行了制備及部分臨床前的研究，主要結論如下：(1)將加替沙星與纖維蛋白膠混合后，與羊膜進行膠聯，可制成一種生物制品——GFBAM。(2)HPLC法顯示，隨著纖維蛋白膠的溶解，加替沙星纖維蛋白膠在體外具有緩釋作用。(3)體外抑菌試驗顯示加替沙星纖維蛋白膠具有持續抑菌作用，隨著時間的延長，抑菌作用緩慢減弱。(4)GFBAM移植到眼表后，在房水中可檢測出加替沙星濃度，說明該藥膜中的藥物能緩慢釋放并滲透到眼內。(5)GFBAM可以作為一種眼表移植物和組織創傷修復的良好材料，為治療細菌性角膜潰瘍提供了另一有效途徑。

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〔2016- 05- 17修回〕

(編輯 徐 杰)

重慶市衛生局科研資助項目(渝衛科教2008- 2- 114)

趙 敏(1956- )，男，主任醫師，碩士生導師，主要從事角膜及眼表疾病研究。

劉燕霞(1981- )，女，在讀碩士，主要從事膠聯羊膜治療角膜及眼表疾病研究。

R772.21

A

1005- 9202(2017)15- 3650- 04；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.005