前列腺素E2激活YAP正反饋回路促進小鼠結腸炎后結腸再生及癌變的分子機制

陶英歌 付高潔 國向東 劉 磊

(牡丹江醫學院第二附屬醫院消化內科，黑龍江 牡丹江 157000)

前列腺素E2激活YAP正反饋回路促進小鼠結腸炎后結腸再生及癌變的分子機制

陶英歌 付高潔 國向東 劉 磊

(牡丹江醫學院第二附屬醫院消化內科，黑龍江 牡丹江 157000)

目的 研究前列腺素(PGE2)激活Yes信號通路相關蛋白(YAP)正反饋回路促進小鼠結腸炎后結腸再生及癌變的分子機制。方法 將DLD1結腸癌細胞株或基因穩定敲除細胞株，在有/無信號通路特異性抑制劑的條件下，采用重組PGE2或PBS孵育，采用免疫印跡法、免疫熒光法、定量PCR、轉錄和增殖法進行比較分析。采用DSS法誘導C57/BL6小鼠結腸炎模型(對照鼠)，同時構建羥基前列腺素脫氫酶基因敲除鼠(15- PGFH- KO)、YAP基因敲除鼠(YAP- KO)、和雙基因敲除(DKO)小鼠，采用吲哚美辛抑制PGE2合成信號通路，檢測下游基因表達及結腸再生和癌變功能。結果 PGE2處理結腸癌細胞株導致YAP mRNA轉錄及蛋白表達水平升高，15- PGDH- KO組鼠結腸組織中PGE2的表達水平較對照敲除細胞(WT)組增長了2.5倍，吲哚美辛處理后15- PGDH- KO組鼠YAP的表達水平及下游靶基因水平均較WT鼠顯著升高。吲哚美辛處理顯著降低PG過氧化物合成酶(COX)- 2及PGE受體4基因(EP4)的轉錄水平，轉染YAP持續激活突變體(5SA)可顯著增加 COX- 2和EP4的蛋白表達水平和轉錄水平，敲除YAP后上述現象消失。對照鼠口服葡聚糖硫酸鈉(DSS)導致結腸炎，注射PGE2促進小鼠發生結腸再生；YAP敲除鼠并未發生結腸再生，同時口服DSS后迅速死亡；15- PGFH敲除鼠結腸組織再生比對照鼠更快，且體重恢復更快、結腸長度和結腸炎組織學得分更高。上述現象可以被注射吲哚美辛逆轉。YAP敲除鼠或15- PGFH敲除鼠誘導結腸炎后未發現自發性腫瘤，YAP/15- PGDH雙基因敲除鼠出現息肉并最終發展成原位癌?？诜胚崦佬量捎行Х乐闺p敲除鼠自發性腫瘤的形成。結論 PGE2可增加YAP的表達水平和轉錄活性，從而促進 COX- 2及EP4的表達水平增加，這一信號回路可促進擴散的結腸癌細胞系增殖和結腸炎小鼠結腸組織再生，持續性激活進一步可導致息肉和小鼠結腸腫瘤的形成。

前列腺素E2；信號通路；結腸炎；結腸再生；腫瘤形成

結腸癌(CRC)全球發病率極高，尤其老年CRC患者往往難以耐受化療不良反應〔1〕。目前研究表明，前列腺素(PG)E2和Yes信號通路相關蛋白(YAP)信號通路與CRC形成高度相關，而PGE2通過環氧合酶(COX)- 2合成，成為機體組織再生的重要炎性介質〔2〕，但其持續的激活已與癌變有關〔3〕，但這一信號通路如何促進腫瘤新生及其下游效應物尚未研究清楚，對這一信號通路的深入研究有助于結腸癌的預防和治療，延長老年患者的生存期，提高其生活質量。研究表明，YAP可參與組織再生的調節，與PGE2表型高度類似，因此兩者之間是否存在相互作用也亟待研究〔4〕。本研究通過分子生物學和藥理學研究，闡明PGE2和YAP的相互作用對小鼠結腸炎后結腸再生及癌變的分子機制的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 DLD1結腸癌細胞株采用含10%FBS的DMEM(Gibco)培養基培養，細胞長至70%～80%時加入藥物處理。PGE2，CAY10598，葡聚糖硫酸鈉(DSS)，GW627368X和AZD6244(Selumetinib)購自Pierce，FR- 180204購自Selleck，LY294002，IKK16和維替泊芬(Verteporfin)購自Sigma Aldrich。6～8周齡SPF級C57BL/6小鼠購自黑龍江省實驗動物中心，合格證SYXK(黑)2016- 0014。

1.2 基因敲除細胞株(小鼠)的構建 將15- PGDH、YAP(5SA)、YAP(5SA- S94A基因克隆進pMSCV- puro載體中，同時將YAP shRNA cDNA構建到pSuperRetro- puro載體中，利用Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉染至293T細胞培養24 h后收取病毒上清，用于感染DLD- 1結腸癌細胞，并采用嘌呤霉素(5 μg/ml)篩選穩定細胞株，同時采用隨機序列對照敲除質粒Vector shRNA構建對照敲除細胞株(WT細胞)。

羥基前列腺素脫氫酶基因敲除鼠(15- PGFH敲除鼠)、YAP基因敲除鼠(YAP敲除鼠)、雙基因敲除鼠(DKO)及對照敲除鼠(WT鼠)的構建由吉瑪公司制備并驗證。正常培養上述小鼠1年，并觀察是否存在息肉、自發腫瘤的發生。

1.3 免疫熒光法 取對數生長期的人結腸癌細胞系DLD- 1細胞，接種于24孔板中，分為兩組，實驗組采用PGE2處理，對照組采用磷酸鹽緩沖液(PBS)處理，各組細胞處理8 h后，采用4%多聚甲醛溶液室溫固定30 min，PBS清洗3次；然后用0.5% TritonX- 100破膜10 min，加入山羊血清室溫封閉1 h；加入1∶500稀釋鼠抗人YAP多克隆抗體，4℃孵育過夜；再加入1∶100稀釋的山羊抗鼠熒光二抗4℃避光孵育30 min；經DAPI染色洗滌后，用萊卡臺式激光共聚焦熒光顯微鏡觀察結果。

1.4 CCK- 8檢測細胞增殖 取對數生長期的人結腸癌細胞系DLD- 1細胞，接種于96孔板中，分為兩組，實驗組采用PGE2處理，對照組采用PBS處理，各組細胞處理8 h后，每孔加入100 μl CCK- 8，37℃繼續孵育2 h，用Bio- Red多功能酶標儀測定450 nm處各孔的D值，比較細胞增殖情況。

1.5 DSS誘導小鼠結腸炎模型 取30只C57/BL6小鼠，自由飲用無菌水溶解的5% DSS，每24 h更換一次，培養7 d，第8天評價結腸炎造模情況，并給藥處理小鼠。造模后每天觀察小鼠毛色變化、活動情況、大便性狀及出血等情況。

1.6 DSS誘導結腸炎組織學評價 取小鼠結腸并沿腸系膜縱軸緣剪開腸腔，生理鹽水沖洗后取炎癥最明顯處長約1 cm的組織，10%中性甲醛固定后石蠟包埋切片。結腸炎的組織學評價采用蘇木精- 伊紅的組織切片染色，測定潰瘍和糜爛的數量和面積。黏膜隱窩損傷的程度(隱窩炎評分從0～4分：0級，無損傷；1級，1/3的基底層損傷；2級，基底層2/3的損傷；隱窩受損且暴露上皮層表面；4級，整個隱窩受損且表面上皮層全部暴露。對樣本同時測量相同區域，并根據其損傷程度從0～4級評分，最終得分通過損傷分級乘以整個結腸隱窩損傷面積得到。

1.7 qPCR分析轉錄情況 使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)從培養的細胞和結腸組織中分離總RNA，取1～2 μg用Gene Amp RNA PCR Core Kit(Applied Biosystems)進行逆轉錄，使用2倍SYBR Green Pre- mix(Elpisbio)在7500 Fast Real- Time PCR machine(Applied Biosystems)定量PCR儀上進行qPCR分析。靶基因的Ct值通過β- actin或GAPDH進行均一化。qPCR引物序列如下：β- actin：5′- TCCTGTGGCATCCACGAAACT- 3′，5′- GAAGCATTTGCGGTGGACGAT- 3′；GAPDH:5′- ATCCTGCACCACCAACTGCT- 3，5′- GGGCCATCCACAGTCTTCTG- 3;YAP:5′- TGGGAGATGGCAAAGACATCTTCTG- 3′,5′- ACACTGGATTTTGAGTCCCACCATC- 3′;COX- 2:5′- GAATCATTCACCAGGCAAATTG- 3′,5′- TCTGTACTGCGGGTGGAACA- 3′;EP4:5′- GACCTGTTGGGCACTTTGTT- 3,5′- AGGTAGCGCTCGACACTCAT- 3′;CTGF:5′- AAAAGTGCATCCGTACTCCCA- 3′,5′- CCGTCGGTACATACTCCACAG- 3′。

1.8 免疫印跡檢測 SDS- PAGE膠的配制和電泳檢測細胞(組織)中提取蛋白及電泳、PAGE膠轉印、封閉、一抗孵育、二抗孵育及曝光后，采用Image J對膠片灰度進行定量分析。

1.9 統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1 PGE2正向調控YAP信號通路 采用免疫印跡和免疫熒光法檢測人結腸癌細胞系DLD- 1中PGE2對YAP信號通路的調控，發現饑餓處理的細胞經過PGE2處理后，YAP的表達水平顯著增加(圖1A，1B)。通過對YAP mRNA和YAP下游調控蛋白(CTGF，CYR61和ANKRD1)水平的檢測發現，PGE2可顯著增強YAP轉錄水平和下游信號通路(圖1C)。

為了檢測PGE2是否在體內同樣能調節YAP信號通路，檢測了吲哚美辛預處理15- PGDH- KO組和WT組鼠PGE2的表達水平。結果顯示，15- PGDH- KO組鼠結腸組織中PGE2的表達水平較WT組增長了2.5倍，吲哚美辛處理10 d后，兩組鼠結腸組織中PGE2表達水平幾乎均無法檢測出(圖1B，1D)。15- PGDH- KO組鼠YAP的表達水平及下游靶基因水平均較WT鼠顯著升高，采用吲哚美辛處理后均顯著降低(圖1E,1F)，表明PGE2在體內和體外均可以正向調控YAP的表達水平。

2.2 YAP通過上調EP4和 COX- 2形成正向反饋回路 通過檢測轉染YAP持續激活突變體(5SA)和對照質粒(WT)的結腸癌細胞系DLD- 1，發現了持續性激活YAP可顯著增加 COX- 2和EP4的蛋白表達水平和轉錄水平(圖2A，2B)。采用shRNA敲除YAP導致 COX- 2和EP4的蛋白表達水平和轉錄水平顯著下降(圖2C)，同時敲除YAP也阻止PGE2處理上調 COX- 2和EP4的表達(圖2D)。

圖1 PGE2正向調控YAP信號通路

2.3 YAP調控PGE2介導的結腸再生 PGE2是前列腺腫瘤細胞最常見的促細胞分裂素，通過shRNA敲除前列腺癌細胞系DLD- 1的YAP基因(圖3A)，檢測了PGE2處理前后細胞的增殖情況。結果發現，PGE2處理可促進對照敲除組細胞的增殖，對YAP敲除細胞系則無顯著影響(圖3B)。通過構建不同15- PGDH和YAP表達水平的小鼠，并采用DSS處理構建結腸炎小鼠模型，發現15- PGDH- KO組鼠的結腸再生較對照組增多，且體重恢復更快、結腸長度和結腸炎組織學得分更高。進一步對15- PGDH- KO組鼠敲除YAP異源基因(YAP- Het)，同樣產生了與WT鼠相似的結腸再生情況(圖3D，3E，3F)。

2.4 PGE2異常增加促進結腸癌發生 為了驗證PGE2異常的回路是否可以導致細胞的異常增殖和腫瘤的發生，構建了15- PGDH- KO鼠、YAP- KO和DKO鼠。經過長達1年的飼養和觀察，發現他們均未發生自發腫瘤，而DKO鼠在培養12～16 w時出現了息肉，并在培養6個月后進展成為原位癌(圖4A，4B)。同時發現，DKO鼠結腸部位原位癌和較高的PGE2的表達水平可以顯著被YAP敲除或注射吲哚美辛干擾并消除(圖4C，4D)。進一步對原位癌部位的YAP，COX- 2和EP4進行轉錄水平檢測，發現DKO鼠中上述基因的表達水平顯著高于YAP- KO，也顯著高于吲哚美辛處理的DKO鼠(圖4E)。

1.Con；2.YAP WT；3.YAP 5SA；4.YAP 5SA/S94A；5.shScrb；6.shYAP圖2 YAP通過上調EP4和 COX- 2形成正向反饋回路

圖3 YAP調控PGE2介導的結腸再生

圖4 PGE2異常增加促進結腸癌發生

3 討 論

PGE2是一種G蛋白耦聯受體(GPCR)配體，通過COX- 2的作用從花生四烯酸合成，并且作為關鍵的炎癥細胞因子〔6〕，在結腸再生和腫瘤發生中起重要作用，因此，PGE2是再生醫學和癌癥預防的重要藥物靶標〔7〕。例如，最近，15- PGDH抑制劑(SW033291)顯示通過增加PGE 2促進組織再生〔8〕；另一方面，長期使用降低PGE2的COX抑制劑降低PGE2水平，抑制結腸炎后的結腸再生，但可降低結腸直腸癌發展的風險〔9〕。同時有研究發現EP4(PGE2受體拮抗劑)加劇DSS- 誘導的結腸炎，但可預防結腸腫瘤發生〔10〕。然而，PGE2介導的上述生物學功能的下游效應物尚未被清楚了解。

Yes信號通路相關蛋白(YAP，Hippo通路的下游致癌基因)被證明參與組織再生的調節，特別是YAP對于在DSS介導的結腸損傷后的組織再生是必需的，同時高度活化YAP將導致腸癌的發生，與PGE2表型高度類似〔11〕。文獻報道YAP信號通路激活可上調PTGS2(PGE2合成關鍵酶，又稱 COX- 2)和PTGER4(編碼EP4)表達，因此推測YAP信號通路也可促進促進PGE2信號通路的激活，與本研究的實驗結果一致。結直腸癌的形成與PGE2和YAP信號通路高度相關，且PGE2和YAP在腫瘤形成期間常被顯著上調〔5〕，

通過一系列的實驗，依次推理和證明了PGE2正向調控YAP信號通路，而YAP通過上調EP4和 COX- 2形成正向反饋回路，同時YAP可調控PGE2介導的結腸再生，異常的PGE2信號激活可促進息肉及結腸癌的發生和發展。本研究的結果清楚地顯示了PGE2通過激活YAP正反饋回路促進小鼠結腸炎后結腸再生及癌變的分子機制，表明PGE2在結腸炎和腫瘤發生后的再生期間起到關鍵作用，有助于結腸炎后的組織再生和結腸直腸腫瘤發生過程的預防和臨床治療。

本研究結果突出顯示了YAP在結腸再生過程中的重要調節轉錄功能，證明YAP的過度表達實際上是腫瘤發生的一個非常重要的風險因素，與文獻報道的YAP mRNA在人類結腸癌中增加相吻合〔12〕。以前的研究已經證明長期使用COX抑制劑可通過下調PGE2預防結腸直腸癌的發生和抑制結腸再生的風險〔13〕。本研究也發現，PGE2和YAP之間的正反饋回路是通過COX- 2作為橋接完成的，采用EP4受體拮抗劑可降低DSS介導的結腸炎后結腸再生，但可防止結腸腫瘤的發生，因此PGE2和YAP之間的正反饋回路在結腸再生和結腸直腸腫瘤發生中起著中心作用。

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2 Brown JR,DuBois RN.COX- 2:a molecular target for colorectal cancer prevention〔J〕.J Clin Oncol,2005;23(12):2840- 55.

3 Zhang Y,Desai A,Yang SY,etal.Tissue regeneration.Inhibition of the prostaglandin- degrading enzyme 15- PGDH potentiates tissue regeneration〔J〕.Science,2015;348(6240):aaa2340.

4 Kabashima K,Saji T,Murata T,etal.The prostaglandin receptor EP4 suppresses colitis,mucosal damage and CD4 cell activation in the gut〔J〕.J Clin Invest,2002;109(7):883- 93.

5 Johnson R,Halder G.The two faces of Hippo:targeting the Hippo pathway for regenerative medicine and cancer treatment〔J〕.Nat Rev Drug Discov,2014;13(1):63- 79.

6 Yu FX,Zhao B,Panupinthu N,etal.Regulation of the Hippo- YAP pathway by G- protein- coupled receptor signaling〔J〕.Cell,2012;150(4):780- 91.

7 Myung SJ,Rerko RM,Yan M,etal.15- Hydroxyprostaglandin dehydrogenase is an in vivo suppressor of colon tumorigenesis〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2006;103(32):12098- 102.

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9 Castellone MD,Teramoto H,Williams BO,etal.Prostaglandin E2 promotes colon cancer cell growth through a Gs- axin- beta- catenin signaling axis〔J〕.Science,2005;310(5753):1504- 10.

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11 Yang VW,Shields JM,Hamilton SR,etal.Size- dependent increase in prostanoid levels in adenomas of patients with familial adenomatous polyposis〔J〕.Cancer Res,1998;58(8):1750- 3.

12 Zeng Q,Hong W.The emerging role of the hippo pathway in cell contact inhibition,organ size control,and cancer development in mammals〔J〕.Cancer Cell,2008;13(3):188- 92.

13 Iglesias- Bartolome R,Torres D,Marone R,etal.Inactivation of a Gα(s)- PKA tumour suppressor pathway in skin stem cells initiates basal- cell carcinogenesis〔J〕.Nat Cell Biol,2015;17(6):793- 803.

〔2017- 01- 22修回〕

(編輯 李相軍)

付高潔(1983- )，女，主管護師，主要從事消化內科疾病研究。

陶英歌(1979- )，女，主管護師，主要從事消化內科疾病研究。

R57

A

1005- 9202(2017)15- 3681- 04；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.017