肺癌患者癌旁組織中上皮-間質轉變相關蛋白表達對其預后的影響

卓 越 梁 冬

(海南省農墾三亞醫院，海南 三亞 572000)

肺癌患者癌旁組織中上皮-間質轉變相關蛋白表達對其預后的影響

卓 越 梁 冬

(海南省農墾三亞醫院，海南 三亞 572000)

目的 探討肺癌患者癌旁組織中上皮- 間質轉變(EMT)相關蛋白表達對其預后的影響。方法 采用免疫組化法檢測81例肺癌患者癌組織和配對癌旁組織中的EMT相關蛋白(E- cadherin、β- catenin和Vimentin)，觀察E- cadherin、β- catenin和Vimentin在癌組織和癌旁組織中表達差異，并比較癌旁組織中E- cadherin、β- catenin和Vimentin表達差異下患者的預后情況，以患者的病理資料和EMT相關蛋白表達差異納入Cox回歸模型，預后因子采用多因素分析。結果 ①肺癌組織中E- cadherin和β- catenin陽性表達率(49.38%和14.81%)明顯低于癌旁組織(72.84%和51.85%)，而Vimentin陽性表達率(55.56%)明顯高于癌旁組織(23.46%)(均P<0.05)。②癌旁組織中E- cadherin陽性、β- catenin陽性和Vimentin陰性患者預后較E- cadherin陰性、β- catenin陰性和Vimentin陽性患者預后好(P<0.05)。③Cox回歸分析發現臨床分期、腫瘤分期、EMT- L和腫瘤分化程度是獨立的風險預后因子。結論 EMT相關蛋白在癌旁組織中的表達異常對肺癌患者的預后有一定的影響，在癌癥早期階段及癌旁組織未發生明顯組織形態學異常時，EMT相關蛋白的檢測對患者的預后情況分析具有一定的參考價值。

肺癌；癌旁組織；E- cadherin；β- catenin；Vimentin

調查顯示2008年我國肺癌發病率約為54.75/10萬，死亡率約為46.07/10萬，占全部惡性腫瘤死亡總數的24.95%〔1〕。肺癌的發病率和死亡率在全部腫瘤中增長最快〔2〕，屬于高致病性疾病，并增加了醫療負擔〔3〕。目前我國主要通過影像學、CT引導肺穿刺活檢及支氣管鏡等診斷肺癌，但在確診時75%患者都為晚期或發生轉移〔4〕。近年來診治技術不斷提高，但肺癌患者的生存率卻并未得到明顯提高，復發轉移是導致患者死亡的重要原因〔5〕，了解患者的預后有及其重要的意義。上皮- 間質轉變(EMT)是指細胞由上皮表型向間質表型轉化的現象，以上皮標志物E- cadlherin下降和間質標志物Vimentin上升為主要生物學特征，是一種基本的生理病理現象，是多數腫瘤侵襲轉移早期的重要過程〔6〕。目前關于肺癌癌旁組織中EMT相關蛋白的表達差異對患者的預后有無影響并無明確定義。本研究探討肺癌患者癌旁組織中EMT相關蛋白的表達情況對其預后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取海南省農墾三亞醫院2012年12月年至2014年1月在腫瘤科確診的81例肺癌患者的癌組織、癌旁組織(距癌病灶距離≥5 cm)。男38例，女43例；年齡35～80(中位41)歲。TNM分期Ⅰ期25例、Ⅱ期19例、Ⅲ期23例、Ⅳ期14例。納入標準：①患者術前未經過放療和(或)化療；②經過病理學確診為肺小細胞癌；③臨床資料完整；④組織標本經石蠟包埋切片HE染色評估確定腫瘤細胞含量>50%；⑤標本取材過程中RNA完整評分>6.0；⑥簽署知情同意書及獲得醫院倫理委員會批準。排除標準：①無明確病理診斷；②沒有完整的隨訪資料；③預計生存期<6個月；④合并心、肝、腎和造血系統疾病；⑤妊娠期和精神疾病患者。

1.2 試劑及儀器 E- cadherin兔、β- catenin鼠抗人單克隆抗體、Vimentin鼠抗人單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)；RT- PCR試劑劑盒和脂質體轉染試劑盒(Gibco公司)、二氨基聯苯胺(DAB，北京華越洋生物科技有限公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS Thermo Fisher Scientific)；二甲苯(河南八方化工原料銷售有限公司)；無水乙醇(蘇州市晶協高新電子材料有限公司)；切片石蠟(廊坊乾岡塑料制品有限公司)。脫水機(泰州海鷗洗滌機械有限公司)；包埋機(湖北泰康醫療設備有限公司)；切片機(無錫雙盛石化裝備有限公司)；切片漂烘溫控箱(中科美其北京科技有限公司)；全自動高壓鍋(日本SANYO公司)。

1.3 組織芯片制作與免疫組化染色 將81例患者癌組織和癌旁組織標本的HE切片，按照對應順序做好記號，將切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，以自來水沖洗1 min，清除內源性過氧化物酶，置于高壓鍋內高溫高壓修復抗原。滴加稀釋后的一抗，在37℃室溫下放置2～3 h，以PBS清洗，清洗后滴加二抗，37℃室溫下放置20 min后以PBS清洗。每張芯片加入100 μl的DAB顯色，用蘇木素復染，經過梯度乙醇脫水、中性樹膠封片后鏡檢。依據EnVision試劑盒說明書按照免疫組織化學染色步驟進行。

1.4 免疫組化結果判斷 染色強度：細胞中無著色計為1分，淡棕色為2分，棕黃色為3分，深棕色為4分；陽性細胞比例評分：陽性細胞計數≤10%計1分，11%～25%計2分，26%～50%計3分，≥51%計4分。將染色強度和陽性細胞比例積分相乘，≤2分者為陰性，>2分者為陽性。

1.5 隨訪 出院患者以電話或門診方式隨訪。隨訪5～36個月。中位隨訪時間為24個月。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗，χ2檢驗，Log- rank檢驗，Cox回歸模型分析。

2 結 果

2.1 EMT相關蛋白在癌旁組織和癌組織中的表達 E- cadherin與β- catenin蛋白陽性表達在細胞膜，Vimentin蛋白陽性表達在細胞質。肺癌組織標本中E- cadherin和β- catenin陽性表達為40例(49.38%)和12例(14.81%)，較癌旁組織表達明顯減少〔59例(72.84%)，42例(51.85%)，χ2=9.377,P=0.002;χ2=25.000,P=0.000〕；Vimentin在癌組織和癌旁組織中陽性表達分別為45例(55.56%)、19例(23.46%)，癌組織中陽性表達多于癌旁組織(χ2=12.393,P=0.000)。見圖1。

2.2 EMT相關蛋白在癌旁組織中表達與患者預后的關系 81例患者平均生存時間為24個月。根據Kaplan- Meier生存分析結果顯示：在癌旁組織中E- cadherin陽性、β- catenin陽性和Vimentin陰性患者預后較E- cadherin陰性、β- catenin陰性和Vimentin陽性患者預后好(P=0.000、P=0.001和P=0.041)。見圖2。

2.3 預后影響因素分析 以癌旁組織中E- cadherin、β- catenin和Vimentin復合體的表達進行分類，EMT- L1為1～2種表達異常，EMT- L2為3種表達異常。按照患者的年齡、性別、腫瘤直徑、臨床分期、腫瘤分化程度和EMT蛋白表達進行Cox回歸多元素分析。結果顯示：臨床分期、腫瘤分期、EMT- L和腫瘤分化程度是獨立的風險預后因子，見表1。

圖1 EMT相關蛋白在癌旁組織及癌組織中的表達(DAB，×400)

圖2 E- cadherin、β- catenin及Vimentin表達差異患者的生存情況對比

病理學因素βSEWaldχ2值P值Exp(B)95.0%CI臨床分期0.7750.2757.9410.0052.1701.266～3.720腫瘤分期0.7430.2807.0330.0082.1021.214～3.639EMT-L1.5670.5258.9180.0034.7931.714～13.405腫瘤分化程度0.9300.4075.2340.0222.5351.143～5.623

3 討 論

EMT是由上皮表型向間質表型轉化的現象，以E- cadherin下降和Vimentin上升為生物學特征〔7〕。EMT發生與腫瘤細胞侵襲、轉移能力相關〔8〕，是細胞發生侵襲轉移的重要內在機制〔9～11〕。癌旁組織是指距離癌癥病灶2 cm的周圍組織，其組織在顯微鏡下細胞類型及形態呈現正常狀態。但目前關于癌旁組織的定義并不明確，多數癌組織周圍1～2 cm為癌組織定于較廣，但食道癌和頭頸癌中，癌癥組織外7 cm處也可檢測到分子水平的異常，因此在檢測癌組織中相關指標的檢測同時，對癌旁組織的檢測也同樣具有重要的意義。目前關于EMT研究都是針對癌細胞較多，晚期腫瘤的進展及預后相關研究也有了一定的發展，而關于癌癥早期階段及癌旁組織未發生明顯組織形態學異常時，EMT相關蛋白的表達的差異及意義并未出現相關研究。本研究顯示肺癌組織標本中E- cadherin、β- catenin陽性表達率低于癌旁組織，而Vimentin在癌組織中表達多于癌旁組織。且與相關研究〔12〕相似，EMT相關蛋白E- cadherin、β- catenin和Vimentin在癌旁組織中的異常表達對患者的預后也有重要的影響，臨床分期、腫瘤分期、EMT- L和腫瘤分化程度是獨立的風險預后因子。由此可見，臨床上針對肺癌患者的預后在注意臨床分期、腫瘤分期和分化程度外，癌旁組織中的EMT相關蛋白表達異常也值得引起重視。但由于本次研究存在樣本量較少、隨訪期較短的不足，且相關學者〔13〕認為腫瘤的預后與遺傳學和腫瘤微環境相關，主張EMT并非腫瘤發生遠處轉移的過程之一，因此具體的作用機制及預后價值還需進行大量的研究論證。

1 赫 捷，趙 平，陳萬青.2011中國腫瘤登記年報〔M〕.北京：軍事醫學科學出版社，2012：62.

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3 鮑俊屹，白亞娜，尚 慧，等.某職業隊列人群中老年肺癌患者分布特征10年變化趨勢〔J〕.中國老年學雜志，2014；34(21)：6166- 8.

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5 盛 旺，呂曉君，安漢祥，等.肺癌組織中水通道蛋白的表達及其與上皮- 間質轉化的相關性〔J〕.中國老年學雜志，2015；35(2)：362- 3.

6 Hui L，Zhang S，Dong X，etal.Prognostic significance of twist and N- cadherin expression in NSCLC〔J〕.PLoS One，2013；8(4)：e62171.

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12 陳清勇，嚴 杰，胡慧珍，等.埃茲蛋白的表達與非小細胞肺癌轉移和預后的關系〔J〕.中華腫瘤雜志，2012；34(6)：436- 40.

13 Chui MH.Insights into cancer metastasis from a clinicopathologic perspective：epithelial- mesenchymal transition is not a necessary step〔J〕.Int J Cancer，2013;132(7)：1487- 95.

〔2016- 05- 08修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

2014年海南省自然科學基金項目(No.814387)

梁 冬(1973- )，女，主任醫師，博士后，碩士生導師，主要從事呼吸內科及肺癌臨床研究。

卓 越(1979- )，男，主治醫師，主要從事肺癌的臨床研究。

R73

A

1005- 9202(2017)15- 3685- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.018