冠心病患者血液循環miR- 126表達及與阿司匹林抵抗的關系

劉 卓 趙艷晶 汪 晶 陶英歌

(牡丹江醫學院第二附屬醫院心血管內一科，黑龍江 牡丹江 157000)

冠心病患者血液循環miR- 126表達及與阿司匹林抵抗的關系

劉 卓 趙艷晶 汪 晶 陶英歌

(牡丹江醫學院第二附屬醫院心血管內一科，黑龍江 牡丹江 157000)

目的 探討冠心病(CHD)患者血液循環微小RNA(mi)- 126的表達及與阿司匹林抵抗(AR)的關系。方法 收集牡丹江醫學院第二附屬醫院2015 年3月至2017年1 月的CHD患者106例，選擇同期在院內的健康體檢志愿者51例作為對照。檢測所有受試者的血小板聚集率并判斷是否存在AR，采用RT- PCR法檢測血小板的miR- 126表達，并分析miR- 126與AR的相關性。結果 與對照組比較，CHD組AR的發生率較高(P=0.005)，血小板的miR- 126明顯降低(P=0.000)。與對照組的AR和非AR(NAR)亞組比，CHD的AR和NAR亞組miR- 126水平均明顯降低(P=0.000)。結論 CHD患者血小板 miR- 126 水平低于健康人，與AR存在相關性，血小板 miR126 水平降低可能會增加健康人群發生CHD的發生。

冠心病；miR- 126；阿司匹林抵抗

臨床常采用具有抗血小板聚集的阿司匹林預防冠心病(CHD)血栓事件發生。近年來，人們發現不同CHD患者對于阿司匹林的治療反應或效果存在差異，致使血栓事件發生頻繁，這種現象被稱為阿司匹林抵抗(AR)〔1〕。流行病學統計顯示AR在心血管病患者的發生率高達40%。目前所發現的人類基因組30 億個核苷酸堿基對內，非編碼 RNA 基因，即微小 RNA(miR) 僅占整個基因組 1%，但人類基因組中約有1/3的基因受到miR調控。miR可調控血小板內 mRNA 表達，影響血小板的活性。miR- 126〔2〕、miR- 34a〔3〕和miR- 92a〔4〕常作為血管疾病的生物學標志，其中miR- 126與血小板的活性密切相關。本課題擬考察CHD患者血液循環miR- 126表達及AR的關系。

1 對象和方法

1.1 對象 經牡丹江醫學院第二附屬醫院倫理委員會批準，并經過患者簽署知情同意書，收集2015 年3月至2017年1 月經WHO臨床命名標準化聯合專題組提出的《缺血性心臟病的命名及診斷標準》中對CHD的診斷標準〔5〕并結合冠脈造影確診的CHD患者106例，主訴反復胸部悶痛，氣短，頭暈，時伴有心悸，疲勞時可加劇，經休息可緩解。其中男67例，女39例，年齡(73.16±9.87)歲。患者均服用小劑量阿司匹林100 mg/d超過3個月，無胃腸出血跡象或者癥狀。納入標準：符合CHD診斷標準，冠狀動脈造影檢查提示左冠脈主干、右冠脈、左前降支和回旋支中有任意一支直徑狹窄程度>50%者；無阿司匹林過敏史者；未接受過血運重建治療者；預計生存期>6個月；配合檢查和治療。排除標準：存在家族或個人出血史，如原發性血小板減少性紫癜、肝膽疾病和血管硬化性出血；合并血液系統疾病或惡性腫瘤患者；存在嚴重的肺、肝和腎功能障礙者；存在阿司匹林口服禁忌證者。選擇同期在院內的健康體檢志愿者51例作為對照，其中男35例，女16例，平均年齡(72.65±10.32)歲。對照組在入選前2 個月內未服用過影響血小板活性的藥物。

1.2 主要儀器及試劑 ABI QuantstudioTMDX定量PCR儀(美國 ABI 公司)；5400型全自動生化分析儀(美國貝克曼公司)；700型全自動血小板聚集儀(上海博士儀器有限公司)；LBY- NJ4A型全自動血小板聚集儀(北京普利生儀器有限公司)。Trizol 總RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)，逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；內參引物和miR- 19a(美國 Invitrogen公司)，花生四烯酸(AA) (美國 Invitrogen公司)。

1.3 指標檢測

1.3.1 一般指標 收集所有受試者的性別、年齡、體重指數、吸煙和喝酒情況，檢測血壓，抽取所有受試者空腹血5 ml，抗凝處理，離心獲得血漿，分別采用全自動生化儀檢測血脂和血糖及LBY- NJ4A型全自動血小板聚集儀檢測血小板計數。

1.3.2 血小板聚集率 參考血小板聚集儀說明書及文獻〔6〕，收集所有受試者的空腹靜脈血5.0 ml，平均分為兩份，分別置于取2.5 ml置于抗凝管(抗凝劑∶血液=1∶9)，500 r/min離心5 min，獲得富血小板血漿，3 000 r/min離心10 min，得乏血小板血漿(PPP)。以PPP為對照，采用全自動血小板聚集儀測定血小板聚集功能，將0.5 mmol/L AA為誘導劑，AA誘導的血小板聚集率≥20% 即為AR，20%為非CHD(NAR)。

1.3.3 RT- PCR法檢測血小板的miR- 126表達 收集所有患者的富血小板血漿，檢測血小板的miR- 126表達。血小板沉淀按miRcute miRNA 提取試劑盒提取miRNA。采用莖環引物行反轉錄反應：2.0 μl RT buffer，2 μmol/L Primer 0.5 μl，6.25 μl RNA，0.5 μl dNTP，0.5 μl M- MLV，0.5 μl Rnase inhibitor，RNase- Free dd H2O加入至20 μl。逆轉錄循環條件：16℃ 15 min，35℃ 60 min，80℃ 15min。 hsa- miR- 126 引物序列：正義5′- GCCCTCGTACCGTGAGTAAT- 3′，反義5′- GTGCAGGGTCCGAGGT- 3′。熒光定量PCR反應：miRNA PCR 反應終體積20 μl，包括2×Super Real Pre Mix 10 μl、上下游引物共 0.3 μmol/L、cDNA模板2.5 μl，同設陰性對照。PCR反應設置程序：95℃ 變性2 min，95℃變性20 s，6℃退火20 s，72℃延伸1 min，共40個循環。經軟件分析CT值，最終結果以2-ΔCT表示。

1.4 統計學方法 應用SPSS20.0軟件進行t及χ2檢驗。

2 結 果

2.1 兩組一般情況比較 兩組性別、年齡、體重指數、吸煙喝酒、舒張壓、血脂、血糖和血小板計數差異無統計學意義(P>0.05)，與對照組比較，CHD患者收縮壓較高(P<0.05)。見表1。

表1 兩組一般情況比較

2.2 兩組AR發生情況 對照組出現AR 10例(19.61%)，CHD組出現45例(42.45%)，兩組比較差異有統計學意義(χ2=7.895，P=0.005) 。

2.3 兩組miR- 126表達 對照組血小板miR- 126的相對表達(0.34±0.09)顯著高于CHD組(0.12±0.04，t=21.232，P=0.000)。

2.4 兩組AR和非AR(NAR)亞組血小板miR- 126水平比較 對照組AR亞組miR- 126水平(0.49±0.10)低于NAR亞組(0.30±0.12)，CHD組AR亞組miR- 126水平低于NAR亞組(0.14±0.04)，與對照組的AR和NAR亞組比，CHD的AR和NAR亞組miR- 126水平均明顯降低(P=0.000)。

3 討 論

血小板在CHD發生血栓栓塞事件的作用越來越明確，血小板與血管內皮釋放的黏連蛋白結合，啟動血栓形成，因此抗血小板治療成為CHD預防心血管事件發生的重要手段。阿司匹林是臨床最常用的抗血小板藥，病人應用常規劑量的阿司匹林仍會發生血栓事件，即不良心血管事件(MACE)，檢查標明血小板的活化及聚集功能未得到充分抑制，即AR現象，AR的發生率較高，臨床后果較嚴重，因此早期判斷患者是否存在AR，通過替換給藥方案則有望改善CHD患者預后〔7〕。本研究提示存在AR的患者如果仍然繼續使用阿司匹林，抗血小板聚集的功能降低，AR患者發生MACE的概率遠高于NAR患者，嚴重影響患者的生存質量，這也是CHD患者即使接受冠狀動脈介入治療(PCI)后繼發支架內血栓的重要原因。

miR- 126的基因位于血管內皮細胞特異性表達基因的第7個內含子，最早在小鼠心臟和小腦中發現，miR- 126可調節內皮細胞的多種生理功能，對于造血、呼吸、消化、生殖甚至胚胎均有一定功能，尤其在心血管的功能備受關注。miR- 126在 CHD 的發生發展過程中扮演重要角色〔8〕。本課題結果提示血小板miR- 126與AR呈負相關，即miR- 126水平越低，AR的發生率越高，血小板miR126的減少不僅可增加健康人發生AR的概率，也可增加健康人發生CHD的風險。本文及文獻報道均顯示血小板miR- 126與AR關系緊密，可用于預測人群的AR發生，尤其可用于CHD用藥指導〔9〕。miR- 126水平與 CHD 病變的關系較為復雜，大致可分以下4 個方面〔9〕：(1)血管內皮生長因子(VEGF)參與 CHD及動脈粥樣硬化(AS)的發生發展，miR- 126通過直接抑制出芽相關蛋白1(SPRED1)和磷酸肌醇3激酶調控亞單位(PIK3R2)/p85- β的表達負性調節內皮細胞對VEGF的應答，下調的miR- 126失去了對 VEGF 的抑制，因此有學者認為miR- 126可作為抗AS的潛在靶點；(2) CHD的發生起始于血管內皮受損導致功能障礙，血管內皮受自始至終伴隨在CHD發展全過程，細胞黏附因子(VCAM)- 1是參與并促進CHD發展過程的AS早期斑塊形成的關鍵因子。VCAM- 1是miR- 126的靶基因，當敲除miR- 126反義寡核苷酸，VCAM- 1的表達增高；(3)CHD是慢性炎癥性疾病，許多炎癥細胞和炎癥因子參與其中，miR- 126可下調腫瘤壞死因子(TNF)- α表達，抑制TNF- α誘導的白細胞在血管內皮的黏附，促使動脈斑塊面積縮小，增高膠原蛋白，達到抑制內皮細胞炎癥反應的發生；(4)miR- 126是血管生成信號通路中的正調節因子，miR- 126可編碼類表皮生長因子域(EGFL)7基因內含子，EGFL7可編碼VEGF，因此上調miR- 126表達可促進血管生成，改善并修復損傷血管細胞，確保血管完整，敲除斑馬魚的miR- 126可抑制血管遷移，干擾生長信號，破壞血管內膜完整性。

CHD患者血小板miR- 126與AR具有明顯的相關性，提示miR- 126可能具有促進血小板的活化和聚集的作用，研究也顯示阿司匹林的應用可降低循環miR- 126水平，進一步為miR- 126參與CHD提供了證據〔10〕。雖然研究認為在血小板表達的miR可改變血小板基因表達，如血小板內Ago2免疫沉淀物可檢測到miR- 223，即P2Y12的 mRNA 在 3′端 UTR 可以被miR識別，miR- 223與3′ 端 UTR結合并形成 Ago2- miR- 223 復合體反過來調節 P2Y12的表達〔11〕。但miR- 126對血小板基因影響尚不明確，有待進一步探索。李娜〔12〕認為miR- 126在穩定型心絞痛的表達低于不穩定型心絞痛，是否提示miR- 126在不穩定型心絞痛水平增高是一種機體對心絞痛病理的代償性保護作用，仍需要提供更多數據支持。另外，除了miR- 126，血小板中有超過300個不同的 mRNA，這些miR均有可能不同程度地參與調控血小板基因表達，這些不同的 mRNA也存在不同程度地交互作用，如血栓素激活1 h的血小板中miR- 15a的表達下調，但miR- 365的表達上調〔3,4〕，可見不同的 mRNA的相互作用復雜多變，因此僅考察miR- 126或多個miRNA均可能存在不同程度的偏頗。

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12 李 娜.冠心病患者血小板相關microRNA的表達及其意義〔D〕.蚌埠：蚌埠醫學院,2014.

〔2017- 06- 11修回〕

(編輯 袁左鳴)

陶英歌(1979- )，女，主管護師，主要從事消化內科研究。

劉 卓(1983- )，女，主管護師，主要從事心血管疾病研究。

R741.02

A

1005- 9202(2017)15- 3707- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.028