乙酸與鉀離子強度對聚唾液酸合成及過程分子質量變化的影響

付旭東，吳劍榮，蔣蕓，馬旭，鄭志永，張麗敏，詹曉北

(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

研究報告

乙酸與鉀離子強度對聚唾液酸合成及過程分子質量變化的影響

付旭東，吳劍榮，蔣蕓，馬旭，鄭志永，張麗敏，詹曉北

(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

聚唾液酸是由大腸桿菌K235合成的一種Group II型胞外多糖。發酵液中有機酸積累、pH控制方式和K2HPO4對聚唾液酸合成和分子質量有較大影響。該研究發現，代謝累積有機酸及外源乙酸脅迫使得聚唾液酸產量和分子量降低；相比搖瓶所需100 mmol/L的K2HPO4，在發酵罐控制pH發酵時，20 mmol/L左右的K2HPO4可以獲得較高的聚唾液酸分子量和產量；在發酵16 h后把氨水變成KOH流加來控制pH，并補入適量胰蛋白胨作為有機氮源，聚唾液酸產量有所提高，而且在發酵結束前較長時間內聚唾液酸的產量和分子質量維持穩定狀態。

大腸桿菌K235；聚唾液酸；乙酸；鉀離子；分子質量

唾液酸(Sialic acid)是一類含有9個碳原子并具有吡喃糖結構的酸性氨基糖，又稱為神經氨酸，按照5號位碳原子上取代基的不同，唾液酸主要分為3類：N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)，N-羥乙酰神經氨酸(Neu5Gc)和3-脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖(Kdn)。聚唾液酸(Polysialic acid，PSA)則是由N-乙酰神經氨酸以α-2,8糖苷鍵鏈接的線性同聚物，聚合度通常在8～400之間[1]。PSA在動物和人體中主要存在于神經黏附分子上，參與細胞遷移、突觸形成以及神經導向，在神經系統發育中起著重要作用[2]。在腫瘤發生過程，聚唾液酸與多種腫瘤細胞的黏附性、遷移性和侵襲性等特性密切相關[3]。另外，聚唾液酸也存在于少數幾種病原菌的胞外莢膜中，能協助病菌在入侵宿主時候起到“分子模擬”作用而躲避宿主攻擊[4]。由于聚唾液酸具有良好非免疫原性、生物可降解性和生物相容性，是優良的生物材料。目前，有研究把聚唾液酸替代聚乙二醇用于修飾藥物蛋白如L-天冬酰胺酶、銅鋅超氧化物歧化酶等，修飾后蛋白穩定性普遍提高，半衰期延長，免疫原性降低，生物利用度提高[5-6]。另外，有報道將聚唾液酸與其他材料如殼聚糖、聚己內酯、透明質酸等進行共混、交聯或共聚形成復合材料，用作藥物緩釋或組織工程的生物材料[7-8]。

當前聚唾液酸的制備方法是通過大腸桿菌發酵和純化獲得，主要研究集中在溫度、pH、碳源、氮源、磷酸鹽、補料工藝等對聚唾液酸發酵的影響。最近，ZHENG等[9]采用兩階段氨水流加進行pH控制來生產聚唾液酸，即前段pH 6.4、后段pH 7.4，可以使得PSA分子量可達260 kDa。陳芳等[10]利用基因工程獲得產聚唾液酸工程菌，雖然搖瓶產量1.0 g/L，但在7 發酵罐中通過氨水控制pH為7.0并流加葡萄糖以維持其濃度在1.0 g/L，使得聚唾液酸達到16.0 g/L，分子量為113 kDa。對于大腸桿菌發酵生產聚唾液酸過程，一般在搖瓶中采用高濃度(100 mmol/L)磷酸氫二鉀進行緩沖或在發酵罐采用pH控制在pH 6.4～7.0并降低K2HPO4用量，這樣才能達到高產PSA目的。當大腸桿菌以葡萄糖和山梨醇為碳源時會積累大量乙酸，尤其是利用葡萄糖時；當利用木糖為碳源時則積累大量丙酮酸[11]。有機酸積累會造成PSA不穩定性，發酵液中還能檢測到唾液酸單體[11]。另外，PSA分子線性結構中唾液酸單元都含有-COOH，解離時候有-COO-和H+的電荷平衡，也會形成內酯結構有利于穩定[12]；而在酸性條件下，H+容易對α-2,8糖苷鍵產生攻擊，造成PSA降解和分子量降低。

我們在利用發酵法生產PSA時，發現在后期營養不足、細胞停止生長后，PSA分子量急劇下降且PSA產量也減少，這給在PSA生產過程中獲得穩定可靠的PSA分子量提出重要挑戰。本實驗主要研究乙酸和鉀離子強度對PSA發酵過程中分子量變化的影響，可為PSA發酵生產提供指導。

1 材料與方法

1.1菌株與培養基

大腸桿菌K235(保藏號CCTCC M208088),由江南大學糖化學與生物技術教育部重點實驗室保藏。

固體培養基(g/L)：NaCl 5，胰蛋白胨10，牛肉膏3，酵母粉2，瓊脂20，pH 7.2～7.4(滅菌前)。

一級種子培養基(LB培養基，g/L)：NaCl 10，胰蛋白胨10，酵母粉5，pH 7.0(滅菌前)。

二級種子培養基(g/L)：NaCl 5，胰蛋白胨10，牛肉膏3，酵母粉2，pH 7.2～7.4(滅菌前)。

發酵培養基 (g/L)：山梨醇40，(NH4)2SO44.94，K2HPO4蛋白胨1.5，MgSO40.9，pH 7.8(滅菌前)。

上罐培養基(g/L)：山梨醇40或20，(NH4)2SO44.94，K2HPO45，胰蛋白胨1.5，MgSO40.9，pH 7.8(滅菌前)。

1.2培養方法

種子制備：用接種環從培養12 h的瓊脂平板挑取單菌落，接種在裝有10 mL的LB培養基(50 mL三角瓶)，置于搖床中，于37 ℃、200 r/min培養12 h。之后，按5%的接種量接種于500 mL帶擋板的三角瓶中(二級種子培養基，裝液量為50 mL)，于37 ℃、200 r/min培養12 h。

搖瓶培養：將上述制備好的二級種子培養液按5%的接種量接種到500 mL帶擋板的三角瓶中(發酵培養基，裝液量40 mL)，于200 r/min、37 ℃培養60 h。

發酵罐分批發酵：7 L發酵罐(NBS)裝入4 L上罐培養基，接種量為8%，初始山梨醇質量濃度為40 g/L，發酵溫度為37 ℃，通氣量為1 vvm，攪拌轉速為400 r/min，通過流加體積分數為30%的氨水和2 mol/L的HCl溶液控制pH在6.4。

1.3pH控制方式對PSA發酵的影響

在7 L發酵罐中，起始K2HPO4為5 g/L， pH控制方式為發酵前16 h流加體積分數為30%的氨水溶液，后面用2 mol/L KOH控制pH在6.4。實驗組A：在16 h一次性流加400 mL的200 g/L的山梨醇溶液，從16 h后每隔5 h(即發酵16，21，26，31，36 h)流加10 mL的120 g/L的胰蛋白胨溶液以補充不流加氨水造成的氮源減少情況。實驗組B：其他情況和對照組一樣，分別在16h和24 h一次性流加200 mL的包含有200 g/L的山梨醇和15 g/L的胰蛋白胨溶液。

1.4分析方法

菌體濃度的測定：測定發酵液OD600值，根據OD600吸光度與細菌干重的標準曲線計算菌體濃度，1.0 OD600相當于0.4 g/L細菌的干重。

聚唾液酸濃度的測定采用間苯二酚-鹽酸法[13]。聚唾液酸平均聚合度的測定采用熒光法[14]。采用水楊酸鈉-次氯酸鈉的比色法測定發酵液中的(NH4)2SO4的濃度[15]。

碳源和有機酸含量的測定：采用HPLC法，使用島津高效液相色譜進行測定。利用高效液相色譜儀(LC-2010A，島津)測定，色譜柱為 Aminex HPX-87H(9μm，300 mm×7.8 mm，Biorad)；流動相為5 mmol/L 硫酸；流動相流速為0.6 mL/min；示差檢測器；柱溫35 ℃；進樣量10 μL[16]。

2 結果與分析

2.1不同碳源代謝對PSA合成及過程分子量變化的影響

聚唾液酸發酵生產主要利用大腸桿菌K1株及其衍生的K235株，文獻報道主要利用山梨醇、葡萄糖和木糖為碳源進行PSA發酵[17]。研究發現，不同碳源、氮源的組合會顯著影響PSA的合成[17]。利用不同碳源時，發酵液中有機酸有很大不同，如以木糖為碳源時會產生大量丙酮酸，而利用葡萄糖時則產生大量乙酸，并在利用木糖和葡萄糖的發酵液中甚至檢測到唾液酸單體，推測PSA可能受有機酸影響降解[18]。為探索不同碳源條件下發酵過程的PSA分子量變化情況，分別以山梨醇、葡萄糖和木糖為唯一碳源在7 L發酵罐進行PSA發酵，結果如圖1所示。以山梨醇為碳源的發酵作為對照，發現E.coliK235都可以利用這些碳源并合成PSA；其中以木糖為碳源時，生物量最高為13.0 g/L，以山梨醇、葡萄糖為唯一碳源時，生物量分別為10.4 g/L和6.3 g/L。在以山梨醇為碳源時，PSA產量最高為1.96 g/L；以葡萄糖和木糖為碳源時，PSA的最高產量分別僅為0.72 g/L 和0.89 g/L。在以山梨醇為碳源時PSA的最高分子量為53.2 kDa，而以葡萄糖和木糖為碳源時，最高PSA分子量分別為10.1 kDa和13.2 kDa，發酵40h后分子量和PSA產量迅速下降。

發酵過程產生的乙酸如圖1D所示，可以看出，以葡萄糖作為碳源時，大腸桿菌整個生長過程中乙酸的含量都比其他兩種碳源要高，最高可以達到150.3 mmol/L，這與GREGORY等人的結論是一致的[19]。以木糖作為碳源時，乙酸的含量最低，最高只有10.0 mmol/L，但是實驗中檢測到較高濃度丙酮酸(最高可以達到54.2 mmol/L)。而以山梨醇為碳源時，乙酸隨著發酵過程逐漸升高，在20 h補入20 g/L山梨醇后乙酸迅速下降，之后又逐漸升高，最高可達109.6 mmol/L。在已有PSA發酵報道中，大部分發酵過程使用pH控制在中性或弱酸性(6.4～7.0)。因為發酵過程產酸造成發酵液pH下降，而PSA在酸性條件下容易降聚，使分子量下降[18]。從圖1可以看出，隨著有機酸的積累，后期PSA分子量迅速下降。PSA在堿性條件下相對穩定，ZHENG等控制pH為7.4，能避免有機酸對分子量的影響，提高PSA分子量到260 kDa[9]，但是pH控制在偏堿性會抑制菌體生長，PSA產量有所下降。

A：山梨醇； B：葡萄糖；C：木糖；■DCW；●PSA；▲分子量；○碳源pH控制在6.4，初始碳源20 g/L，20 h流加碳源20 g/L圖1 以山梨醇、葡萄糖和木糖為碳源的PSA發酵過程曲線Fig.1 Time course of PSA fermentation with sorbitol, glucose or xylose as sole carbon source

2.2乙酸脅迫對PSA生物合成及過程分子量的影響

為了進一步探索有機酸對PSA合成和分子量的影響，在搖瓶發酵0 h和12 h(對數中期)分別添加不同濃度的乙酸，考察外源乙酸脅迫對PSA發酵的影響。如圖2A所示，在0 h添加不同濃度的乙酸后，菌體生長受到抑制，在添加超過90 mmol/L的乙酸時菌體不生長，而添加30 mmol/L和60 mmol/L乙酸時，PSA合成和分子量明顯下降。在培養12 h后添加乙酸，結果如圖2B所示。同樣乙酸添加超過90 mmol/L時；則菌體生長完全受抑制，乙酸添加超過60 mmol/L時PSA合成量很少；而添加30 mmol/L乙酸時，雖然PSA產量接近1.5 g/L，但是其分子量低于20 kDa。 這表明在發酵過程中加入乙酸，會嚴重干擾菌體生理活性，影響PSA合成和分子量；而在一開始添加60 mmol/L乙酸時，細菌通過延滯期調整適應，菌體能夠生長并合成PSA，但是分子量下降不少。因此，在PSA發酵過程中，盡量控制乙酸生成則有利于PSA積累和PSA分子量(聚合度)增加，如CHEN等[10]以葡萄糖為碳源時，控制葡萄糖在1.0 g/L以避免有機酸產生，最終達到較高PSA濃度。

2.3不同濃度磷酸氫二鉀對PSA發酵過程及分子量的影響

PSA在酸性條件下唾液酸上羧基解離形成電負性，造成整條PSA長鏈相互排斥，長鏈也容易受到H+的攻擊而降解；PSA在堿性條件下則相對穩定，容易形成內酯增強穩定性[20]。在一定濃度的聚唾液酸溶液中，加入20～50 mmol/L K2SO4溶液和10～25 mmol/L K2HPO4溶液進行溶解，采用端基法測定PSA分子量[21]時發現，PSA數均分子量增大5～8倍。由于端基法是測定還原端唾液酸單體含量，由此推測：一定濃度K+正電荷能夠掩蔽PSA上解離的-COO-，使PSA部分失去電負性而扭曲聚集，造成還原端唾液酸測定量減少。葉進富等[22]認為，溶液中無機鹽的加入將改變帶電微粒周圍的離子分布從而影響Zeta電位。采用Zeta電位測定也發現在一定濃度K+的時候，PSA溶液Zeta電位增大(數據未顯示)，表明PSA分子溶液行為發生變化。而K+濃度過高時，則PSA則可能都帶上正電荷，又形成PSA鏈相互的排斥性，端基法測定分子量時又和不添加K+時一樣。

搖瓶發酵A: 起始培養基添加乙酸-B： 發酵12 h 添加乙酸 ■ 0 mmol/L 乙酸；● 30 mmol/L 乙酸；▲ 60 mmol/L 乙酸；▼ 90 mmol/L 乙酸；◆ 120 mmol/L 乙酸圖2 乙酸添加對聚唾液酸發酵過程的影響Fig.2 Effect of acetateaddition on PSA fermentation

(7L 發酵罐中培養基添加 ■ 2.5 g/L，● 5.0 g/L，▲ 10.0 g/L K2HPO4 )圖3 K2HPO4 濃度對聚唾液酸發酵的影響Fig. 3 Effect ofdifferent K2HPO4 concentration on PSA fermentation

實驗組A：山梨醇補料/分次添加胰蛋白胨；實驗組B：兩次補料山梨醇-胰蛋白胨；圖例：■ DCW，● PSA，▲ MW圖4 氨水和KOH溶液組合流加控制pH對聚唾液酸合成和分子量的影響Fig.4 Effect of pH control with combination of ammonia water and KOH feeding on PSA fermentation

以往研究在搖瓶都使用90～100 mmol/L的K2HPO4進行PSA發酵，后來在發酵罐上采用pH控制后可以降低K2HPO4用量到2.5 g/L (10 mmol/L)[23]。但是這些研究沒有分析不同K2HPO4濃度下PSA的分子量變化。因此，我們在7 L發酵罐水平上，分別采用不同起始K2HPO4濃度進行PSA發酵，結果如圖3所示。在添加5.0 g/L K2HPO4的條件下，菌體的生物量可以達到11.9 g/L，聚唾液酸含量可以達到2.2 g/L，分子量最高可以達到52.3 kDa。添加2.5 g/L和10 g/L的 K2HPO4的PSA合成、分子量和生物量都比5 g/L K2HPO4發酵的參數低。尤其是分子量， K2HPO4為2.5 g/L時，PSA最高分子量僅為20 kDa左右。如同前期預實驗結果，溶于20 mmol/L(5.0 g/L)K2HPO4能夠改變PSA分子的溶液行為，同時也提高發酵過程的PSA分子量和發酵過程穩定性。

2.4pH調控方式對PSA合成及發酵過程分子量的影響

由于K+存在可能影響PSA合成和發酵過程聚唾液酸分子量穩定性，因此在7 L發酵罐中，將氨水流加控制pH模式改成兩階段，即前18 h用體積分數30%的氨水控制pH，后期采用KOH溶液控制pH在6.4，并且在補料液中加入一定量胰蛋白胨以彌補不流加氨水可能造成的氮源不足，結果如圖4所示。以圖1A為對照，在起始 K2HPO4為5.0 g/L并后期用KOH流加進行pH控制補入K+后，2個實驗組的聚唾液酸分子量在發酵40 h之后較為穩定，沒有迅速下降，2組數均分子量在70～80 kDa之間；聚唾液酸含量在3.8～4.0 g/L之間，也穩定10 h左右，沒有迅速下降；最高菌體干重在13～14 g/L之間，變化不是太大。因此，可以看出，相比對照組(圖1A)中PSA合成和分子量在后期迅速下降，通過后期流加KOH溶液，強化發酵液中K+濃度，通過增強聚唾液酸的穩定性來提高分子量。

在可以合成聚唾液酸的E.coli中，控制聚唾液酸合成及后期轉運的基因主要位于kps基因簇中，它由3個區域組成。據STEENBERGEN等[24]報道，第2個區域中的neuDBACES基因可以用于唾液酸的合成、活化、聚合和可能的異位作用，其中neuS基因可以合成聚唾液酸轉移酶，使聚唾液酸長鏈達到延伸的目的，從而形成一定聚合度的聚唾液酸長鏈而轉運到細胞外膜。但是，針對PSA的鏈長控制機理上，還沒有分子生物學上的假設和結論。另外，大腸桿菌K1或K235都是來源于尿道的致病菌，其合成的PSA是大腸桿菌致病因子，在入侵宿主時候起到“模擬”作用而逃避宿主的攻擊。一般情況下尿道含乳酸菌等，環境成酸性，不利于大腸桿菌K1生長或合成PSA。而實際情況是，尿道中滲透壓較高，K+/Na+等正離子的存在另一方面也有利于PSA合成和穩定性，因此這里涉及環境H+與K+/Na+等離子之間的平衡關系。在應用此類大腸桿菌生產PSA時，應該盡量避免有機酸的積累，采用堿中和，同時適當提高發酵液的K+/Na+等離子濃度，這樣可以達到穩定PSA產量和分子量的效果。我們也發現，PSA保存于水溶液中很容易發生降聚，而以固體鈉鹽或鉀鹽形式存在有利于長久保存。另外，當PSA用作生物材料時，為了維持PSA的穩定性，可以考慮在系統中加入K+/Na+等離子，以避免PSA受到水溶液中質子的攻擊而降解。

3 結論

微生物代謝碳氮源形成有機酸積累，影響PSA合成和分子量，尤其是乙酸積累產生脅迫作用影響較大。適合濃度的K2HPO4有利于促進PSA合成和分子量的提高，但是細胞停止生長后PSA產量和分子量迅速下降；通過氨水和KOH溶液組合兩階段流加控制pH方式補入適量K+，使得在發酵后期PSA產量和分子量不會急劇下降，表明一價正電荷的K+對維持PSA穩定性具有促進作用。

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Effectofacetateandpotassiumionicstrengthonpolysialicacidsynthesisandmolecularweightchangeinfermentationprocess

FU Xu-dong, WU Jian-rong*, JIANG Yun, MA Xu ,ZHENG Zhi-yong, ZHANG Li-min, ZHAN Xiao-bei

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122，China)

Polysialic acid (PSA) belongs to group II extracellular polysaccharide produced byEscherichiacoliK235. Previous studies have shown that the accumulation of organic acids in the fermentation broth, pH control mode and K2HPO4have a great influence on the biosynthesis and molecular weight of polysialic acid. In this study, we found that the accumulation of organic acids and exogenous acetic acid addition reduced the production and molecular weight of polysialic acid. Compared with the 100 mmol/L K2HPO4required for shake flask cultivation, 20 mmol/L K2HPO4could obtain higher molecular weight and yield of polysialic acid in fermenter. After 16 h of fermentation, the ammoniawater was switched to KOH feeding to control the pH, and the appropriate amount of tryptone was added as the organic nitrogen source. As a result, the production of polysialic acid was increased and the molecular weight and yield of PSA remained stable. Results from this study can provide a good hint for industrial scale production of PSA with stable molecular weight.

Escherichiacoli; ploysialic acid; acetic acid; K+; molecular weight

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013824

碩士研究生(吳劍榮副教授為通訊作者，E-mail: kinowu@jiangnan.edu.cn)

國家“863”計劃項目(2012AA021505)

2017-01-13，改回日期：2017-03-09