基于高通量測序的郫縣豆瓣后發酵期真菌演替變化分析

趙紅宇，徐煒楨，楊國華，劉元福，岳 鵬，張 良,*

基于高通量測序的郫縣豆瓣后發酵期真菌演替變化分析

趙紅宇1，徐煒楨1，楊國華2，劉元福3，岳 鵬2，張 良1,*

（1.西華大學食品與生物工程學院，食品生物技術四川省高校重點實驗室，四川 成都 610039；2.四川省丹丹郫縣豆瓣集團股份有限公司國家企業技術中心，四川省豆瓣釀制技術工程實驗室，四川 成都 611732；3.四川友聯味業食品有限公司，四川 成都 611732）

為研究郫縣豆瓣后發酵過程中真菌群落變化規律，揭示其特有“日曬夜露”工藝的發酵本質，采用MiSeq測序分析其從后發酵1 周至后發酵6 a期間一共7 個時間點的真菌群落演替變化情況。結果表明，郫縣豆瓣后發酵過程中共有3 個門類群、20 個綱類群、47 個目類群、77 個科類群、106 個屬類群的真菌參與演替變化；后發酵時間對郫縣豆瓣的真菌群落組成具有重要影響，隨著后發酵的進行格孢菌科和黑霉科真菌持續減少，而酵母科、類酵母科和畢赤酵母科的真菌則呈現先增加后減少的趨勢，其峰值大多出現在3～6 個月之間，但后發酵6 a的郫縣豆瓣真菌群落較其他樣品呈明顯偏低。該方法發現了大量的非培養真菌和未報道真菌，所得真菌多樣性更接近于樣品微生態，更能夠全面解析自然發酵調味品郫縣豆瓣的真菌多樣性，為傳統產業的現代化改造和食品質量安全控制提供科學支撐。

郫縣豆瓣；真菌演替；高通量測序

郫縣豆瓣屬中國傳統發酵食品，迄今為止已有300多年的歷史，被列為中國非物質文化遺產。郫縣豆瓣不僅生產工藝獨特，也以其味辣香醇、黏稠絨實、紅棕油亮、醬香濃郁等特點在我國醬類產品中獨樹一幟，堪稱川菜之魂[1-2]。截止2015年末，“郫縣豆瓣”品牌價值已達607.16億 元，位列“加工食品類地理標志產品”全國第一；當年產品總產量達到110萬 t，實現工業產值102億 元，出口世界絕大部分國家和地區，創匯超過4 000萬 美元[3]。

郫縣豆瓣的生產包括前期發酵和后熟發酵2 個階段，前期發酵主要是指蠶豆霉瓣子的制曲和辣椒坯的預處理[2]。后熟發酵主要是將成熟霉瓣子和成熟辣椒坯按比例配料混合，加入適量食鹽和水，進入發酵池發酵，經過一定時期的翻曬和陳化，即是郫縣豆瓣特有的日曬夜露工藝[4-5]。因此，郫縣豆瓣的生產是以蠶豆瓣制曲、辣椒坯和環境微生物等復雜的物質能量代謝過程為前提，通過獨特的“日曬夜露”開放發酵工藝，使得棲息在曲藥、辣椒坯、環境中的龐大微生物體系在發酵醅固、液、氣三相界面發生復雜的物質轉換、能量代謝和信息傳遞作用，并最終形成郫縣豆瓣獨特的成分構成和風味特征。

真菌在郫縣豆瓣發酵過程中發揮了非常重要的作用，在制曲階段，霉菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、糖化酶等多種酶類，這些酶作用于辣椒和蠶豆不僅生成了大量的風味物質，也為后發酵期其他微生物生長創造了條件。但是，由于郫縣豆瓣后發酵階段的生產處于開放環境，少則半年多則2 a以上的“日曬夜露”后發酵期不僅決定了郫縣豆瓣獨特的成分構成和風味特征，也存在巨大的食品安全風險，如毛霉菌和青霉菌會產生霉臭味，產毒黃曲霉和部分寄生曲霉還可能產生黃曲霉毒素B1，帶來潛在的食品安全隱患。因此，研究郫縣豆瓣后發酵期的真菌演替變化顯得非常必要。

近年來，國內利用變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、溫度梯度凝膠電泳[6]、DNA克隆文庫[7]、末端限制性片段長度多態性分析[8]、16S rRNA基因文庫[9]等非培養技術，在分析研究發酵食品生產過程中微生物的功能作用方面，做出了大量卓有成效的成績，其直接從分子水平上研究微生物資源，避免了傳統基于微生物分離培養分析方法的局限，在分析復雜環境微生物群落結構中具有優勢。但這些方法也都存在一些問題，如測序通量低、操作復雜、干擾因素多、準確率不高等。高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）技術又稱為第2代基于宏基因組深度測序技術，具有檢測通量更高、用時更少、準確度更高以及檢測費用更低等優點，能更可靠、更全面、更直接地反映微生物的群落構成、功能特性、變化演替和多樣性[10]。

目前，HTS技術在發酵調味品研究中得到了一定的應用，如韓國學者對海鮮醬（jeotgal）[11]、醬粉（meju）[12]、泡菜（kimchi）[13]、魚醬（fish sauce）[14]和豆瓣辣醬（doenjang）[15]的發酵微生物多樣性已經進行了解析；歐洲學者更是從宏基因組的角度評述了該技術給食品微生物群落變化研究帶來的重大影響變化[16-18]。但是，國內外鮮見利用該技術分析郫縣豆瓣后發酵期真菌多樣性的研究報道。

本研究采用MiSeq測序，對郫縣豆瓣后發酵過程中從入池到發酵6 a合計7 個不同發酵階段的樣品進行分析，以期揭示郫縣豆瓣不同后發酵階段的真菌多樣性，加深對傳統本土調味品發酵機制的認識，為傳統產業的現代化改造和食品質量安全控制提供科學支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品取自郫縣當地知名郫縣豆瓣生產企業的生產車間。郫縣豆瓣實際生產中將后發酵6 個月的產品即視為傳統自然發酵產品，可進入市場銷售（主要用于菜肴的炒、拌）；同時，廠家也會根據市場需求適當延長后發酵期（該郫縣豆瓣用于火鍋底料和燒、燉等菜肴的制作）。因此，本研究選取后發酵1 周，3、6 個月，1、2、5 a及6 a的郫縣豆瓣樣品（共計7 個樣品，按發酵時間長短分別編號為1W、3M、6M、1Y、2Y、5Y、6Y）。每個時間節點的樣品選取同一后發酵時間的不同發酵池進行3 次重復取樣。郫縣豆瓣在后發酵時，每日需進行攪拌、翻曬，故取樣時從每個發酵池的上層（距表面0～20 cm）、中層（距表面30～50 cm）、下層（距池底0～20 cm）各取25 g左右，混合均勻后密封，低溫運至實驗室，于-70 ℃條件下保存備用。測序時選取每個樣品做3 次平行實驗并將數據進行合并以便后續分析。

土壤DNA提取試劑盒 上海Sangon Biotech公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs、通用引物ITS4及ITS3_KYO2寶生物工程（大連）有限公司；二代測序快速DNA建庫試劑盒 美國Illumina公司。

1.2 儀器與設備

NanoDrop 2000測定儀 美國Thermo公司；臺式離心機、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國Eppendorf公司；MiSeq測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

豆瓣基因組DNA采用土壤DNA提取試劑盒提取。DNA質量與濃度（A260nm/A280nm及A260nm/A230nm）采用NanoDrop 2000測定儀測定。PCR擴增采用rDNA-ITS序列的通用引物ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）和ITS3_KYO2（5’-GATGAAGAACGYAGYRAA-3’）并在引物5’端加不同的barcode。

1.3.2 PCR擴增及MiSeq測序

根據提取的樣品基因組DNA的濃度配制PCR體系（25 μL）：1×PCR buffer、1.5 mmol/L MgCl2、0.4 μmol/L dNTP、1.0 μmol/L上下游引物、0.5 U Taq DNA聚合酶以及10 ng豆瓣基因組DNA。PCR擴增條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性40 s，56 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，30 個循環；最后72 ℃再延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，試劑盒回收純化PCR產物，按等摩爾比例混合成測序文庫后，用MiSeq測序儀進行雙端測序。

1.3.3 HTS數據前處理

采用QIIME pipeline去除低質量原始測序數據，使用Uchime去除嵌合體序列[19]。以rDNA-ITS序列97%相似度作為操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）的劃分標準。

1.4 數據統計分析

使用QIIME平臺計算Chao1、Shannon-Wiener和Simpson多樣性指數[20]。

2 結果與分析

2.1 郫縣豆瓣不同后發酵階段真菌多樣性分析

微生物群落生態學可通過樣品的OTUs、Chao1、Shannon-Wiener和Simpson指數來反映微生物群落的豐度和多樣性。不同后發酵階段的樣品真菌多樣性指數如表1所示。

表1 基于97%相似性水平所計算的多樣性指數Table 1 Diversity indices calculated based on a cutoff of 97%similarity

由表1可知，隨著發酵時間的延長，樣品當中的真菌多樣性總體呈現先下降后上升再下降的趨勢。但后發酵時間過長（6 a）的樣品真菌多樣性最低，與其他后發酵階段的真菌多樣性存在明顯差異。

圖1 豆瓣樣品的Rank-Abundance曲線Fig. 1 Rank-Abundance curves of samples

圖1 為7 個發酵階段郫縣豆瓣真菌的Rank-Abundance曲線，曲線越寬，表示物種的組成越豐富，曲線越平坦，表示物種組成的均勻程度越高，圖1展示的樣品所含物種的豐富程度和均勻程度也與表1相似。

結合實際生產，郫縣豆瓣后發酵期真菌演替變化的過程可以歸納為：郫縣豆瓣發酵啟動階段（1周）的真菌大多來源于霉瓣子曲的接種，而這些真菌在適應新生境過程中，出現了種類和構成的急劇變化；到發酵3 個月時，大量真菌由于不適應新的生境或完成其發酵代謝過程而消失；直至發酵6 個月時，“日曬夜露”過程當中大量環境真菌的進入，其真菌多樣性超過發酵1 周時樣品；這說明環境微生物可能對郫縣豆瓣的風味和品質產生了重要的影響。

2.2 郫縣豆瓣后發酵期真菌群落結構變化分析

圖2 門水平下郫縣豆瓣真菌群落變化Fig. 2 Changes in fungal community in Pixian soybean paste during fermentation at phylum level

對不同后發酵階段郫縣豆瓣的7 個樣品中的真菌群落，利用Illumina雙末端HTS，發現所有樣品中可以確認的有3 個門類群、20 個綱類群、47 個目類群、77 個科類群、106 個屬類群。

如圖2所示，真菌群落中門水平有子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、結合菌門（Zygomycota）和其他未識別真菌，分別占整個發酵階段總真菌數平均數的88.06%、3.67%、0.36%、3.93%，其中子囊菌門的數量在發酵的整個過程一直處于絕對優勢地位。

圖3 綱水平下郫縣豆瓣真菌群落變化Fig. 3 Changes in fungal community in Pixian soybean paste during fermentation at class level

如圖3所示，綱水平平均含量排名前10的分別是酵母菌綱（Saccharomycetes）、座囊菌綱（Dothideomycetes）、散囊菌綱（Eurotiomycetes）、傘型束梗孢菌綱（Agaricostilbomycetes）、錘舌菌綱（Leotiomycetes）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）、銀耳綱（Tremellomycetes）、傘菌綱（Agaricomycetes）、子囊菌門下類別不明真菌（incertae sedis）和未識別真菌（unidentified），分別占整個發酵階段真菌平均總數的63.21%、16.88%、3.89%、1.81%、1.74%、1.32%、1.0%、0.61%、0.38%和3.93%，其中酵母菌綱的數量一直處于絕對優勢地位。

圖4 目水平下郫縣豆瓣真菌群落變化Fig. 4 Changes in fungal community in Pixian soybean paste during fermentation at order level

如圖4所示，目水平平均相對含量排名前10的分別是酵母菌目（Saccharomycetales）63.21%、格孢腔菌目（Pleosporales）12.80%、散囊菌目（Eurotiales）3.24%、煤炱目（Capnodiales）2.81%、傘型束梗孢菌目（Agaricostilbales）1.81%、蠟釘菌目（Helotiales）1.66%、糞殼菌目（Sordariales）0.92%、座囊菌綱（Dothideomycetes）未識別目0.70%、銀耳目（Tremellales）0.32%。值得注意的是，隨著后發酵周期由3 個月延長至5 a，目水平相對含量排名前10的真菌總數逐漸變少，而多樣性明顯增多。后發酵5 a時未識別的真菌相對數量達到了20.14%，明顯高于其他階段，這時的發酵醅物質轉換、能量代謝和信息傳遞作用均接近尾聲。這與實際生產過程中，3～5 a的郫縣豆瓣鮮味物質最豐富，風味物質極為醇厚的經驗相符合。

圖5 科水平下郫縣豆瓣真菌群落變化Fig. 5 Changes in fungal community in Pixian soybean paste during fermentation at family level

如圖5所示，科水平平均相對含量排名前10的分別有未分類真菌（incertae sedis）52.81%、格孢菌科（Pleosporaceae）10.56%、畢赤酵母菌科（Pichiaceae）3.97%、類酵母科（Saccharomycodaceae）3.27%、酵母菌科（Saccharomycetaceae）3.16%、煤炱目（Capnodiales）未識別科2.71%、發菌科（Trichocomaceae）2.15%、傘型束梗孢菌科（Agaricostilbaceae）1.81%、黑霉科（Sclerotiniaceae）1.39%。

3 討 論

汪先丁等[21]運用PCR-DGGE技術，發現郫縣豆瓣制曲階段和發酵初期米曲霉（Aspergillus oryzae）是優勢真菌，淀粉絲菌（Amylomyces rouxii）和米根霉（Rhizopus oryzae）是制曲階段的優勢真菌，異常畢赤酵母（Pichia anomala）和漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）是發酵初期的優勢真菌。董丹等[22-23]利用純培養的方法從發酵70 d、5 個月和10 個月的郫縣豆瓣中分離得到4 個屬的真菌，其中念珠菌（Candida）和威克漢姆酵母（Wickerhamomyces）為發酵5 個月的優勢真菌，曲霉和畢赤酵母為發酵5 個月的優勢真菌。

Kim等[24]利用PCR-DGGE技術研究韓國辣醬（doenjang）檢測出念珠菌、畢赤酵母、曲霉和畢赤酵母等屬合計20 株真菌；Ezeokoli等[25]也利用PCRDGGE技術從尼日利亞發酵豆醬（soy-daddawa）中發現了念珠菌、畢赤酵母、曲霉等屬，合計16 株真菌。劉春鳳等[26]通過構建真菌18S rRNA基因文庫，從成熟豆醬中發現5 個屬的真菌，分別為接合酵母、Rhizochaete、曲霉、紅酵母和Phaseoleae。

針對郫縣豆瓣后發酵期真菌演替變化的研究報道還不多，且并沒有形成學界和產業界一致公認的說法。李幼筠[1]在2008年就質疑，在郫縣豆瓣制曲時將米曲霉作為唯一功能菌并不符合生產實際。本研究發現，曲霉科真菌在郫縣豆瓣后發酵的各個階段的演替過程中相對含量并不占優勢，平均相對含量在科水平僅占0.46%。董丹等[22-23]從發酵5 個月的郫縣豆瓣分離出148 株微生物，其中鑒定出14 種真菌，但未發現發現曲霉屬微生物；從發酵10 個月的郫縣豆瓣分離出145 株微生物其中鑒定出20 種真菌，發現曲霉屬微生物含量為1%。

值得注意的是，黃曲霉毒素作為曲霉科的黃曲霉菌（Aspergillus flavus）和寄生曲霉菌（Aspergillus parasiticus）等產生的一類含有二氫呋喃環結構的次生代謝產物，長期困擾著郫縣豆瓣產業的發展。黃曲霉毒素B1含量是GB/T 20560—2006《地理標志產品 郫縣豆瓣》的食品安全關鍵控制指標。課題組對郫縣豆瓣中黃曲霉毒素B1污染的現狀進行了調研[27]，發現總體形勢不容樂觀，產品抽樣合格率僅為（92.74%）低于國家質檢總局公布的2012年度全國加工食品95.6%和醬類調味品96%的平均合格率[28]。汪先丁等[21]發現黃曲霉菌在制曲階段一直較弱地存在，但在發酵初期消失了，并認為這是黃曲霉毒素B1含量趨于穩定的原因，這與本研究的曲霉科真菌演替變化的研究結果相似。

另外，以往關于郫縣豆瓣真菌的報道無論是取樣追蹤的時間跨度，還是所得微生物菌群數據豐富程度，以及確定優勢菌群的全面性，與本結果相比都具有一定局限。這說明HTS技術可以快速、高效地對郫縣豆瓣中真菌結構進行精確的分析，尤其是為揭示其一些功能作用的機制提供了新的研究方法。但是，郫縣豆瓣長達5 a“日曬夜露”的開放發酵工藝造成了微生物區系極為復雜的狀況，且批次間組成差異較大，依靠HTS技術本身并不能全面地解析郫縣豆瓣的真菌發酵演替機制，還需要結合實際生產狀況和其他物理化學因子分析，才能夠更加全面地分析其真菌的作用機制，進一步加深對郫縣豆瓣復雜發酵過程的科學認識。

同時，該技術仍有一定的不足，如樣品測序前需利用真菌通用引物PCR對序列片段進行擴增，這無形間增加了序列合成的出錯率，基于Illumina MiSeq的橋式擴增的“邊合成，邊測序”也不太適合沒有基因組系列的全新測序[29]。另外，由于所得測序數據量巨大，經軟件拼接、過濾等處理后，難免出現冗余數據和有效數據丟失的情況。

目前，業內有一種片面的認識：認為后熟周期越長越好。因此常出現由于銷售制約而無限期延長后發酵周期的現狀。已有學者指出，在現有的發酵條件下，后熟完成后，各種有效成分將會從高峰降至低谷，綜合成分整體劣變，同時衛生指標和理化指標也會相應降低，因此應嚴格控制發酵周期為6 個月至1 a[1]。本研究結果發現后發酵期6 個月至2 a的郫縣豆瓣真菌群落演替變化相較于其他階段變化較小，為該觀點從微生物角度提供了一定理論支撐。

4 結 論

本研究利用HTS對郫縣豆瓣后發酵過程中的真菌群落進行了分析研究，結果表明該技術可以較為有效、快速、充分地評價郫縣豆瓣中的真菌群落演替情況。同時，豐富了對傳統本土調味品—郫縣豆瓣中真菌的認識，真菌群落的多樣性和豐度均顯著高于國外傳統發酵調味品，這可能與其獨特的長時間“日曬夜露”開放發酵工藝有關。發酵時間對郫縣豆瓣后發酵期的真菌群落組成有重要影響，無限期延長后發酵周期會帶來微生物群落豐度和多樣性的大幅度降低。

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Fungal Community Analysis by High-Throughput Sequencing in Pixian Soybean Paste during Post-Fermentation

ZHAO Hongyu1, XU Weizhen1, YANG Guohua2, LIU Yuanfu3, YUE Peng2, ZHANG Liang1,*
(1. Key Lab of Food Biotechnology of Sichuan Province, College of Food & Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China; 2. Soybean Paste Brewing Technology and Engineering Laboratory of Sichuan Province, National Enterprise Technology Center of Sichuan Dandan Pixian Soybean Paste Co. Ltd., Chengdu 611732, China; 3. Sichuan Youlian Condiment Food Co. Ltd., Chengdu 611732, China)

The changes in fungal communities in Pixian soybean paste during post-fermentation were analyzed using highthroughput sequencing method in order to reveal the essence of ‘being kept under sunlight in the daytime and being allowed to absorb moisture in the air at night during the fermentation process’. The results revealed that at the taxonomic levels of microbes, including phylum, class, order, family, and genus, high-throughput sequencing method could detect 3 phyla, 20 classes, 47 orders, 77 families and 106 genera. It was shown that the fungal community in Pixian soybean paste was highly diverse and abundant. The dominant microbes were greatly changed during the post-fermentation process; the quantities of Pleosporaceae and Sclerotiniaceae continued to reduce, while those of Saccharomycetaceae, Saccharomycodaceae and Pichiaceae increased firstly and then decreased. In addition, a large number of non-cultivated fungi and unclassified fungi were also found in this study. The observed fungal diversity was highly similar to the microbial ecology of the investigated samples. This study may provide scientific support for the modernization of the traditional Pixian soybean paste industry as well as food safety and quality control.

Pixian soybean paste; fungal community; high-throughput sequencing

10.7506/spkx1002-6630-201716008

Q939.97

A

1002-6630（2017）16-0051-06

2016-10-12

國家教育部春暉計劃項目（Z2015117）；四川省戰略性新興新產品項目（2015GZX0021）；四川省重點研發項目（2016NZ0093）；成都市科技惠民技術研發項目（2015-HM01-00003-SF）；成都市農業技術成果應用示范項目（2015-NY01-00001-NC）；成都市農業技術研發項目（2015-NY02-00097-NC）；成都市產學研聯合實驗室項目（2015-YF04-00047-JH）；西華大學食品生物技術重點實驗室建設項目（川教2006-313）

趙紅宇（1992—），男，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：redrain.z@foxmail.com

*通信作者：張良（1982—），男，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：zhang-liang@foxmail.com

趙紅宇, 徐煒楨, 楊國華, 等. 基于高通量測序的郫縣豆瓣后發酵期真菌演替變化分析[J]. 食品科學, 2017, 38(16): 51-56. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716008. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Hongyu, XU Weizhen, YANG Guohua, et al. Fungal community analysis by high-throughput sequencing in Pixian soybean paste during post-fermentation[J]. Food Science, 2017, 38(16): 51-56. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716008. http://www.spkx.net.cn