腌臘肉制品中乳酸菌的篩選鑒定及其在臘腸中的應用

潘曉倩，成曉瑜，張順亮，趙 冰，喬曉玲，陳文華，李家鵬，曲 超，王守偉*

腌臘肉制品中乳酸菌的篩選鑒定及其在臘腸中的應用

潘曉倩，成曉瑜，張順亮，趙 冰，喬曉玲，陳文華，李家鵬，曲 超，王守偉*

（中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

為篩選適合傳統腌臘肉制品的優良乳酸菌菌株，從多種農家自制傳統腌臘肉制品中分離純化出9株優勢乳酸菌。通過發酵特性篩選，得到一株性狀優良菌株10M-7，并制備該菌株的干粉發酵劑，以未接種發酵劑臘腸為對照，分析此發酵劑對臘腸感官品質和微生物變化的影響。結果表明，10M-7菌株具有良好的產酸特性和抑菌性能。根據形態學、生理生化特征和16S rRNA序列分析，鑒定其為植物乳桿菌，采用冷凍干燥法制備純種發酵劑，并制作人工發酵臘腸。發酵劑組pH值在初期便迅速下降，且始終低于對照組；發酵劑組乳酸菌迅速生長繁殖，且葡萄球菌和大腸桿菌數量與對照組相比明顯降低。感官評價表明，當添加量為104CFU/g原料肉時，能夠很好地保持和改善產品風味，使產品整體感覺更好。

發酵劑；腌臘肉制品；乳酸菌；鑒定；應用

傳統腌臘肉制品具有高鹽和低水分活度的特點，便于貯藏，風味獨特，營養價值高，是中國肉制品幾千年制作經驗與智慧的結晶。它屬于自然條件下，經內源酶及特定有益微生物的作用，發生一系列生化變化而制成的一類發酵肉制品[1-2]。現階段，我國傳統腌臘肉制品生產仍然存在一些不可忽視的問題，如傳統農家方式生產的腌臘肉制品周期長，其中微生物來源復雜，難以保障產品質量穩定，易受雜菌污染，而工業化生產腌臘肉制品為了提高生產效率，多采用快速烘干成熟法，喪失了腌臘肉制品的獨特風味[3-4]。篩選優良發酵劑菌種并制備適用于腌臘肉制品發酵劑，實現對腌臘肉制品發酵過程的人工控制及工業化生產，不僅提高了產品食用安全性和風味質量，而且克服了自然發酵過程時間過長，難以控制的缺點。

早在20世紀30年代，美國就報道了發酵劑在香腸制作中的應用，如今，發酵肉制品在歐美有著廣泛的消費市場，且在肉類工業中占據著獨特的地位[5-6]。乳酸菌是最早從發酵肉制品中分離出來的微生物，是傳統腌臘肉制品中重要的優勢菌群，與產品品質有著密切的關聯[7-8]，近幾年，也有一些從腌臘肉制品中篩選肉用乳酸菌發酵劑菌株的相關報道[4,9]。研究發現，乳酸菌可降低產品pH值，賦予產品特殊的發酵風味，改善組織質構，促進色澤與風味的形成[10-11]。同時，某些乳酸菌能產細菌素，抑制腐敗菌和致病菌生長繁殖[12-14]；降低產品中某些特定生物胺含量[15-17]；降低膽固醇，抗氧化作用[18]等。但并非所有乳酸菌都適合做發酵劑菌種，研究發現不同種及不同菌株乳酸菌之間的性能差異對產品品質具有很大影響[5,19-20]，因此真正適用于我國傳統腌臘肉制品的性狀優良菌株的選育是采用人工發酵方法提升腌臘肉制品產品品質的重要前提。本研究從多種農家自制，具有良好風味的傳統腌臘肉制品中分離、篩選優勢乳酸菌，旨在篩選出性狀優良的野生乳酸菌菌種，并將篩選出的乳酸菌接種到臘腸中，制作人工接種發酵臘腸制品，對整個發酵成熟過程的微生物特性進行分析，并進行感官評價，為優良發酵劑的研制及優質腌臘肉制品的生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株分離材料：農家自制傳統腌臘肉制品采集自廣西、湖南和四川3 個省區共20 種樣品，包括臘肉、臘腸、酸肉等腌臘肉制品。

臘腸加工用豬后腿肉、豬背脂 北京二商大紅門肉類食品有限公司；輔料：食鹽、白砂糖和香辛料 中國肉類食品綜合研究中心香辛料部。

培養基：MRS培養基、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（violet red bile agar，VRBA）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基（mannitol and sodium chloride agar medium，MSA）、營養肉湯（nutrient broth，NB）、MRS肉湯 北京陸橋技術有限責任公司。改良MRS培養基：MRS培養基中添加質量分數6%NaCl和150 mg/kg的亞硝酸鈉。

細菌基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix 天根生化科技有限公司；DNA Marker、溶菌酶 寶生物工程（大連）有限公司；通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGyTACCTTGTTACGACTT-3’） 上海立菲生物技術有限公司（北京）；pH值精密試紙（pH 5.4～7.0）；葡萄糖、亞硝酸鈉、NaCl、KCl均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

生物安全柜 新加坡Esco公司；PB-10型數顯酸度計、BSA822-CW型電子天平 賽多利斯科學儀器有限公司；G154DWS高壓滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；SCIENTZ-11L型無菌均質器 寧波新芝生物科技股份有限公司；VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定儀及配套CBC鑒定卡片 北京威泰科生物技術有限公司；Primo Star生物顯微鏡 德國Zeiss公司；T100 Thermal Cycler聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、Gel Doc? XR+凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；WH82絞肉機 德國賽德曼機械制造公司；OSCAR 20真空灌腸機 德國海因里希弗雷機械制造有限公司；DZ-600/2S型真空包裝機 山東小康機械有限公司；水分活度儀 瑞士Novasina公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌分離純化

在無菌條件下，取各樣品25 g，剪碎，放入無菌均質袋中，加入225 mL無菌生理鹽水，放于無菌均質器中拍打均質后根據需要進行梯度稀釋[21]。取1 mL樣品稀釋液于無菌平板中，倒入改良的MRS培養基，混勻，凝固后置于37 ℃培養48 h，根據菌落形態、大小、透明度等挑取單菌落并反復劃線純化直至獲得單菌株，挑取平板單菌落接種于MRS肉湯中，37 ℃、200 r/min振蕩培養24 h，將培養液滴加到pH 5.4～7.0精密試紙上，選取試紙顏色變黃（pH值小于5.4）對應菌株進行革蘭氏染色觀察菌體形態，并保藏菌株[22]。

1.3.2 乳酸菌的篩選

根據發酵劑乳酸菌篩選標準進行以下篩選實驗[4,23-24]：產酸特性實驗、發酵葡萄糖產氣實驗、產黏實驗、產H2S實驗、牛津杯法抑菌實驗（金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）。

1.3.3 乳酸菌的鑒定

1.3.3.1 生理生化鑒定

用無菌棉簽蘸取平板上純菌落，制備2.7～3.3麥氏單位濃度的菌懸液，用VITEK 2 Compact及其配套CBC鑒定卡進行鑒定。

1.3.3.2 16S rRNA分子生物學鑒定

采用細菌基因組提取試劑盒提取細菌基因組DNA，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量和片段大小。采用通用引物27F和1492R，以基因組DNA為模板擴增16S rRNA序列。PCR體系（50 μL）：DNA模板2 μL、引物27F和1492R各1 μL、2×Taq PCR MasterMix 25 μL、重蒸水21 μL；PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35 個循環，72 ℃延伸10 min。PCR產物經凝膠電泳分析后，送英濰捷基貿易有限公司（北京）測序，應用BLAST程序將測序結果在GenBank基因數據庫中進行同源性比較以鑒定菌種歸屬。

1.3.4 生長曲線及產酸能力測定

[22]的方法測定生長曲線及產酸能力。

1.3.5 干粉發酵劑的制備及活性測定

將新鮮菌液（濃度108～109CFU/mL）按2%的接種量轉接至MRS肉湯培養基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養18～24 h，5 000 r/min離心15 min，棄上清液，加無菌生理鹽水洗滌一次，離心棄上清液，加入原液體培養基體積1/10的生理鹽水將菌體懸浮，備用。凍干小瓶中加入1 mL菌體懸浮液和質量分數10%的脫脂乳4 mL，混合均勻后，經過真空凍干制得菌粉。采用梯度稀釋平板法測定凍干粉活性。

1.3.6 添加發酵劑臘腸的制備

加工工藝：原料肉（剔除結締組織等）→絞肉（瘦肉與脂肪均使用8 mm孔徑孔板）→加調味料和發酵劑攪拌混合（添加量分別為102、104、106、108CFU/g肉）→膠原蛋白腸衣灌制→23 ℃、相對濕度80%條件下發酵24 h→15 ℃、相對濕度85%條件下風干成熟→成品

對照組為未添加發酵劑的自然成熟臘腸，其他所有配方和加工工藝與添加發酵劑臘腸相同。

1.3.7 感官分析

臘腸成品真空包裝后于室溫（25 ℃）貯藏1 周平衡水分，再進行感官分析。選擇15 位專業人員組成感官評定小組，將2 組臘腸蒸煮20 min，切成1.0 mm左右的薄片，通過盲評計分，就臘腸色澤、氣味、滋味、組織結構和整體接受度5 方面打分，每項總分10 分，樣品評定之間用清水漱口[25]，評分標準見表1。

表1 感官評價標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of sausage

1.3.8 水分含量與水分活度的測定

水分含量測定參照GB/T 9695.15—2008《肉與肉制品水分含量測定》進行；水分活度采用水分活度儀，測定6組，取平均值。

1.3.9 鹽分測定

參照GB/T 9695.8—2008《肉與肉制品 氯化物含量測定》進行。

1.3.10 pH值和菌相變化分析

分別于臘腸制作第0、1、4、7、12天（成品）時取樣進行pH值和菌相變化分析。

取臘腸不同部位若干塊混合，均質，用pH計測定其pH值，每種樣品設6 次平行重復[26]。無菌條件下取臘腸不同部位樣品25 g放于225 mL無菌生理鹽水中，均質后梯度稀釋，接種于相應的選擇性培養基中進行乳酸菌、葡萄球菌和大腸桿菌平板計數，每個實驗設3 個重復。培養基和培養條件如表2所示[27]。

表2 菌相分析的培養基和培養條件Table 2 Selective media and incubation conditions used for bacterial isolation from sausages

1.4 數據統計分析

Excel 2007統計分析數據，計算標準差并制圖。感官評價結果采用SPSS 17.0顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化和篩選

表3 9 個分離菌株的發酵特性Table 3 Fermentation characteristics of nine isolated strains

通過梯度稀釋平板法和劃線分離，從樣品中分離出9 株耐受質量分數6% NaCl和150 mg/kg亞硝酸鈉，且經24 h液體搖床培養pH值小于5.4的優勢乳酸菌，其革蘭氏染色均為陽性。菌株編號依次為9M-1、9M-3、10M-7、13M-4、13M-8、22M-1、22M-2、01105和01107。如表3所示，分離純化得到的9株菌均不產黏，發酵葡萄糖不產氣；產H2S實驗中，只有22M-2菌株產H2S，因此22M-2菌株不適宜作為肉制品的發酵劑菌種。培養24 h的pH值由低到高依次為10M-7、22M-1、13M-8、22M-2、13M-4、01105、01107、9M-3、9M-1。這9 株乳酸菌對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑制作用的強弱程度差別較大，其中菌株10M-7效果最好。

2.2 菌株10M-7的鑒定

2.2.1 形態學及生理生化鑒定

圖1 10M-7的菌落形態（A）和革蘭氏染色圖（B）Fig. 1 Colony (A) and Gram-staining (B) of strain 10M-7

菌株10M-7來源于廣西三江地區農家自制臘肉樣品，觀察圖1發現，10M-7菌株在MRS培養基上生長良好，37 ℃培養24 h后形成直徑約1 mm大小的圓形菌落，乳白色突起，表面濕潤、有光澤，邊緣整齊；革蘭氏染色呈陽性，細胞桿狀，單個、成對或鏈狀排列，無芽孢，接觸酶陰性，需進一步選取CBC鑒定卡進行生理生化鑒定。

經VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定儀鑒定，10M-7株菌為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），鑒定可信度達到95%，置信水平極好，該菌株的理化及酶學特性如表4所示。

表4 菌株10M-7的生理生化鑒定結果Table 4 Identification of strain 10M-7 by CBC card

2.2.2 分子生物學鑒定

菌株10M-7的PCR產物凝膠電泳分析結果如圖2，得到一條約1 500 bp的DNA片段，符合細菌16S rRNA序列長度，測序比對后發現，菌株10M-7的16S rRNA序列與GenBank中L. plantarum MH19登錄號為FJ542291.1的序列同源性達到99%，因此，菌株10M-7的16S rRNA分子生物學鑒定結果為植物乳桿菌，這與生理生化鑒定結果一致。該菌株已于2015年9月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 11341。

圖2 10M-7菌株16S rRNA基因PCR擴增結果Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of PCR-amplified 16S rRNA gene of 10M-7

2.3 菌株的生長產酸特性

圖3 菌株10M-7的生長曲線（A）和產酸能力（B）Fig. 3 Growth curve and acid-producing capacity of strain 10M-7

將菌株10M-7在MRS肉湯中培養，其生長曲線見圖3A，0～2 h內為延滯期，時間較短；2～12 h內為對數生長期，此階段OD600nm由0.153增加至1.924，活菌數由7.49（lg（CFU/mL））增加至9.17（lg（CFU/mL））；12～30 h內是穩定期，之后為衰亡期。可見該菌株延滯期短，穩定期較長。產酸曲線見圖3B，該菌株產酸能力較強，24 h內pH值由5.8下降至4.1，其中主要是對數生長期產酸較多。菌株生長快、pH值的迅速降低有利于在肉制品中的快速定殖、生長及產酸，從而抑制其他腐敗微生物的生長，保證肉制品品質[28]。

2.4 乳酸菌10M-7制作人工發酵臘腸的應用效果

2.4.1 干粉發酵劑制備與活力測定

冷凍干燥法制得的干粉發酵劑為白色粉末，易溶于水，采用稀釋平板法測得該發酵劑活力為4.75×1010CFU/g。根據原料肉質量，計算實驗組中需添加的干粉發酵劑質量，使添加量依次為102、104、106、108CFU/g原料肉，未添加任何發酵劑的自然發酵臘腸為對照組。

2.4.2 感官分析

表5 感官評價結果Table 5 Results of sensory evaluation

如表5所示，發酵劑的添加對臘腸感官品質具有一定影響。對照組和添加發酵劑制作的人工發酵臘腸在色澤、氣味和組織結構方面差異不顯著，當乳酸菌添加量為104CFU/g時，產品滋味較好，不僅保持了傳統臘腸特有的臘味，還具有發酵肉制品特有的香味，咸淡適中，酸味柔和，香味濃郁，整體評價得分最高。當添加量增加至106、108CFU/g時，滋味越來越酸，影響其整體接受度。因此，選擇添加量為104CFU/g的發酵臘腸進行后續相關實驗。

2.4.3 水分及鹽含量變化

表6 臘腸制作過程中水分含量、水分活度和鹽含量變化Table 6 Variations in water content, water activity and salt content during sausage production

如表6可知，隨著臘腸發酵成熟過程的進行，水分含量和水分活度均呈持續下降的趨勢，降低幅度差異不大，但添加發酵劑組臘腸的水分含量略低于對照組，水分活度下降更快。這可能與乳酸菌發酵產酸導致產品pH值下降有關，pH值的降低導致肌肉蛋白質保水能力減弱，風干速率加快[27]。隨著水分的喪失，鹽含量在成熟過程中逐漸增加，對照組和實驗組差異不大，鹽含量的提高有利于病原菌及腐敗菌的抑制。

2.4.4 pH值變化

圖4 臘腸制作過程中pH值變化Fig. 4 Changes in pH value during sausage production

由圖4可知，對照組和添加發酵劑的實驗組pH值均呈現下降趨勢，但下降幅度不同。對照組臘腸的pH值在0～4 d略有上升，之后緩慢下降，這可能是因為自然發酵前期，乳酸菌生長緩慢，而此時內源蛋白酶降解肉蛋白產生非蛋白氮[29]，后期乳酸菌繁殖產酸導致pH值降低。添加發酵劑的臘腸pH值在發酵成熟初期便迅速下降，0～7 d其pH值由5.92下降至5.30，這是由于人工添加發酵劑后，乳酸菌在初期便具有生長優勢，經過短時間的適應后便大量繁殖產酸，后期7～12 d其pH值由5.30下降至5.18，降幅變緩，可能是因為隨著風干成熟過程的進行，其水分活度降低，抑制了乳酸菌的繁殖。

2.4.5 菌相變化分析

圖5 臘腸制作過程中菌相變化Fig. 5 Changes in bacterial populations during sausage production

圖5為添加發酵劑臘腸與對照組臘腸在整個制作過程中乳酸菌、葡萄球菌和大腸桿菌的數量變化情況。乳酸菌在0～7 d增長速率較快，7～12 d變化較平穩，且添加發酵劑的實驗組臘腸中乳酸菌在初期增加較快，其含量始終高于對照組。葡萄球菌和大腸桿菌的變化基本呈現先增加然后趨于穩定，后期略有下降的趨勢。且發酵劑組中葡萄球菌和大腸桿菌的增長幅度和總量都低于對照組，這主要是由于添加發酵劑組臘腸中乳酸菌增殖速率快，很快成為優勢菌種，競爭性抑制了其他微生物的生長，同時乳酸菌繁殖產生大量乳酸，產品pH值下降，也會抑制葡萄球菌和大腸桿菌的繁殖[30-31]。

3 結 論

從多種農家自制的傳統腌臘肉制品中分離純化出9 株耐受質量分數6% NaCl和150 mg/kg亞硝酸鈉的優勢乳酸菌，通過研究其生長產酸特性及抑菌特性等，從中篩選得到1 株性狀優良的乳酸菌10M-7，通過形態學、生理生化和分子鑒定確定該菌株為植物乳桿菌（L. plantarum）。通過冷凍干燥制得該菌株的純種發酵劑，并制作人工發酵臘腸，以未添加發酵劑的傳統臘腸作為對照，實驗發現，該發酵劑的添加能迅速降低產品發酵初期pH值，有效減少發酵成熟過程中大腸桿菌和葡萄球菌數量；水分含量、水分活度和鹽含量與對照組相比無明顯變化。感官評價顯示，當添加量為104CFU/g原料肉時，臘腸成熟后，不僅保持了傳統臘腸特有的風味，還具有發酵肉制品特有氣味。產品色澤、風味、組織結構各方面的評分與對照相比均無顯著性差異，且滋味方面，發酵劑組被描述為咸淡適中，酸味柔和，香味濃郁，較好地保持和改善了產品風味，整體感覺更好。

因此，實驗中分離得到的植物乳桿菌適合作為傳統臘腸的發酵劑菌株，提高了產品的食用安全性，很好地保持和改善了產品風味，為傳統臘腸乃至傳統腌臘肉制品發酵劑的研制提供了一定的實驗基礎。關于該菌株在其他傳統腌臘肉制品中的應用及與其他菌種結合開發復配發酵劑還需進一步研究。

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Screening and Identification of Lactic Acid Bacteria from Cured Meat Product and Its Application in Sausage

PAN Xiaoqian, CHENG Xiaoyu, ZHANG Shunliang, ZHAO Bing, QIAO Xiaoling, CHEN Wenhua, LI Jiapeng, QU Chao, WANG Shouwei*
(China Meat Research Center, Beijing 100068, China)

In order to screen lactic acid bacterial strains (LAB) with good performance for the fermentation of traditional cured meat products, nine strains of LAB were isolated and purified from home-made cured meat products. Out of these nine isolates, strain 10M-7 was selected for its good fermentation properties and it was prepared into a starter culture by freezedrying method. Effects of the starter culture on sensory quality and microbial growth in fermented sausage were examined using naturally fermented sausage without any starter cultures as a control. The results showed that strain 10M-7 had good acid production performance and antibacterial properties, and it was identified as Lactobacillus plantarum according to its morphological, physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA sequence alignment. The pH value of LAB-fermented sausage decreased apparently during the early fermentation period, which was always lower than that of the control. LAB in artificially fermented sausage grew rapidly and the numbers of Staphylococcus and Escherichia coli were significantly lower than those in the control group. Addition of the starter culture at 104CFU/g raw meat could retain and improve the flavor of sausages so that the group exhibited better overall sensory acceptance.

starter culture; traditional cured meat products; lactic acid bacteria; identification; application

10.7506/spkx1002-6630-201716009

TS251.1

A

1002-6630（2017）16-0057-07

潘曉倩, 成曉瑜, 張順亮, 等. 腌臘肉制品中乳酸菌的篩選鑒定及其在臘腸中的應用[J]. 食品科學, 2017, 38(16): 57-63. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716009. http://www.spkx.net.cn

PAN Xiaoqian, CHENG Xiaoyu, ZHANG Shunliang, et al. Screening and identification of lactic acid bacteria from cured meat product and its application in sausage[J]. Food Science, 2017, 38(16): 57-63. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716009. http://www.spkx.net.cn

2016-11-03

公益性行業（農業）科研專項（201303082）

潘曉倩（1987—），女，工程師，碩士，研究方向為微生物與肉制品質量安全。E-mail：go_ahead123@163.com *通信作者：王守偉（1961—），男，教授級高級工程師，碩士，研究方向為肉品加工技術。E-mail：cmrcwsw@126.com