N-糖基化對β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中異源表達的影響

馬 清，蔡 瑞，姜風超，馬立娟,2,*，杜麗平,2，肖冬光,2

N-糖基化對β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中異源表達的影響

馬 清1，蔡 瑞1，姜風超1，馬立娟1,2,*，杜麗平1,2，肖冬光1,2

（1.天津科技大學生物工程學院，工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457；2.天津食品安全低碳制造協同創新中心，天津 300457）

為研究N-糖基化對里氏木霉β-甘露聚糖酶（β-mannanase，Man1）在畢赤酵母GS115中異源表達的影響，采用定點突變的方法，將Man1上3 個N-糖基化修飾位點（N131、N158和N329）上的天冬酰胺用中性谷氨酰胺取代。結果發現，N-糖基化位點的突變對Man1的轉錄水平無明顯影響，突變后獲得的Man1表觀分子質量有輕微下降，與Man1相比，3 個突變體N131、N158和N329的甘露聚糖酶活力分別降低了85.43%和79.48%和16.3%；而熱穩定性分別提高了7.87%、13.5%和15.37%。由此可見，N-糖基化修飾對于β-甘露聚糖酶的高效表達是必需的，其中N131和N158糖基化位點尤為重要，但是會稍微降低β-甘露聚糖酶的熱穩定性。

β-甘露聚糖酶；N-糖基化；定點突變；酶活力；熱穩定性

β-甘露聚糖酶（β-1,4-mannanase，EC3.2.1.78）能夠水解β-1,4-D-甘露糖苷鍵連接的葡萄甘露聚糖、甘露聚糖、半乳葡萄甘露聚糖及半乳甘露聚糖等底物[1]，是一種僅次于木聚糖酶的第二大半纖維素酶類，在飼料、食品、造紙、制藥等各個領域均具有廣闊的應用前景[2-6]，近年來對于它的研究也逐漸成為了國內外的研究熱點。β-甘露聚糖酶在自然界的來源比較廣泛，包括動物[7]、植物[8-10]和微生物[11-12]，其中主要的來源是微生物。由于微生物具有生長周期短、易于培養和產酶能力強等優點[13]，其已成為工業化生產β-甘露聚糖酶的主要“加工廠”。里氏木霉（Trichoderma reesei）作為生產纖維素酶與半纖維素酶的優良菌種[14]，目前對其分泌的β-甘露聚糖酶Man1在畢赤酵母（Pichia pastoris）中表達的研究不多。

畢赤酵母表達系統作為一種高效的外源蛋白真核表達系統，通常存在蛋白質的糖基化修飾[15]，N-糖基化是真核生物所特有的糖基化修飾。N-糖基化修飾是β-構型的N-乙酰葡糖胺異頭C原子與天冬酰胺（Asn）的γ-酰胺N原子共價連接而成的N-糖苷鍵的修飾[16]。β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中表達的主要翻譯后修飾為N-糖基化修飾，氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr（Xaa是除了脯氨酸的任意氨基酸、Ser為絲氨酸、Thr為蘇氨酸）被認為是N-糖基化的特征序列[17]。研究表明，N-糖基化修飾既可增加也可減少糖蛋白的穩定性，這取決于糖基化修飾發生的位置，當糖基化修飾發生在折疊有序的區域時，會減少其穩定性，而當糖基化修飾發生在混亂無序的位置時則會増加蛋白質的穩定性[18]。例如，Guo Meijin等[19]研究發現畢赤酵母重組肌醇六磷酸酶在90 ℃條件下處理10 min可維持40%的酶活力，而去糖基化后在40 ℃條件下處理10 min酶活力劇烈下降；Xi Hongxing等[20]也發現N-糖基化修飾的亮氨酸氨基肽酶具有較高的熱穩定性和催化效率。此外，Wang Changqing等[21]的研究也表明糖蛋白的去N-糖基化修飾雖然不會改變蛋白質的二級結構，但會降低蛋白質熱失活過程的可逆性，導致熱變性過程中蛋白質的聚集，這也進一步闡明了N-糖基化修飾可提高蛋白質穩定性的原因。但是，也有文獻報道糖基化修飾不會顯著影響酶的熱穩定性甚至會使其熱穩定性降低。齊飛飛[22]發現里氏木霉纖維二糖水解酶Ⅰ的不同位點上的糖基化對酶分子的熱穩定性的影響不同，N384位的糖基化能顯著提高酶的熱穩定性，N45和N270位點的糖基化對熱穩定性無顯著影響。Han Minghai等[23]通過定點突變用Asn-Xaa-Thr取代了Asn-Xaa-Ser氨基酸序列，增強了重組彈性蛋白酶的N-糖基化程度，結果發現N212和N280位點突變使彈性蛋白酶活力分別提高了43%和25%，而N36位點突變則降低了31%。而Vaquero等[24]發現在酯酶成熟肽的N-糖基化修飾對酶的活性沒有任何影響。謝春芳等[25]利用生物信息學方法涉及并引入N-糖基化突變位點對假蜜環菌來源的β-甘露聚糖酶進行了分子改造，發現N-糖基化對該酶的熱穩定性、酸堿穩定性和蛋白酶抗性均有改善。因此，有必要研究N-糖基化修飾對β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中表達的影響，以便進一步優化重組β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中的高效表達，滿足其在各個領域的應用。

本研究采用NetNGlyc 1.0 Server軟件在線分析里氏木霉β-甘露聚糖酶Man1中易發生N-糖基化修飾的位點，利用定點突變技術，將里氏木霉β-甘露聚糖酶N-糖基化修飾位點上的Asn用中性谷氨酰胺（Gln）取代。比較突變體表達的酶與非突變體表達的酶的轉錄水平，酶活力水平和熱穩定性等特性，進而探討N-糖基化對里氏木霉β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中異源表達的影響，為β-甘露聚糖酶的定向改造提供理論依據從而有利于對其進一步研究。

1 材料與方法

1.1 菌株與載體

里氏木霉（T. reesei Rut）C30、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、畢赤酵母GS115由天津科技大學天津市工業微生物重點實驗室保藏；重組載體pPIC9K-Man1為本實驗室構建并保存，其中Man1基因來源于里氏木霉。

1.2 試劑與培養基

3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）國藥集團化學試劑有限公司；刺槐豆膠、十二磺基磺酸鈉 美國Sigma公司；考馬斯亮藍R-250、山梨醇、生物素、無氨基酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，yNB） 北京Solarbio公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、甲醇、甘油 天津市化學試劑一廠；咪唑 天津市化學試劑三廠；D-甘露糖 上海藍季科技發展有限公司；酵母提取物、蛋白胨 英國Oxoid公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑、限制性內切酶、Marker大連寶生物公司。

LB培養基：蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、NaCl 1%；yPD培養基：酵母提取物1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%；BMGy培養基：酵母提取物1%、蛋白胨2%、yNB 1.34%、甘油1%、生物素4×10-5%；BMMy培養基：酵母提取物1%、蛋白胨2%、yNB 1.34%、甲醇0.5%、生物素4×10-5%。

1.3 儀器與設備

HE-120多功能水平電泳槽、HE-120多功能垂直電泳槽 上海天能科技公司；hS-1300-V型超凈臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；PCT-200型PCR基因擴增儀美國Bio-Rad公司；全自動凝膠成像儀 美國Syngene公司；H1650-W臺式高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；5430R型4 ℃離心機 德國艾本德股份公司；H2Q-C搖床 哈爾濱市東明醫療儀器廠；ECM830電轉化儀 美國BTX公司；紅外激光成像系統 美國LI-COR公司；StepOne型熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）儀 美國ABI公司；DK-8D型電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 軟件分析β-甘露聚糖酶Man1中易發生N-糖基化的位點

采用NetNGlyc 1.0 Server軟件在線分析里氏木霉β-甘露聚糖酶Man1中易發生N-糖基化修飾的位點并選擇其中閾值超過0.5的位點進行下一步研究。

1.4.2 突變載體的構建

利用定點突變試劑盒將N-糖基化位點上編碼天冬酰胺Asn的位點（AAT或AAC）突變為編碼中性Gln的位點（CAA）。以大腸桿菌擴增后的重組質粒pPIC9K-Man1為模板，通過上游引物MF和下游引物MR對質粒進行擴增。本實驗所用引物見表1，均利用oligo7軟件設計并由金唯智公司合成。PCR擴增程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸9 min，30 個循環；72 ℃終延伸5 min。取擴增產物40～50 μL加入1 μL DpnⅠ，混勻后在37 ℃恒溫反應1～2 h，以去除模板質粒，用瓊脂糖凝膠電泳檢測消化后的產物并進行切膠回收。

表1 PCR引物序列Table 1 Sequences of primers used in this study

重組反應體系（20 μL）為：ddH2O 2 μL、5×CEⅡ Buffer 4 μL、DpnⅠ消化產物12 μL、ExnaseⅡ 2 μL。將各組分混勻后置于37 ℃水浴鍋中反應30 min，反應結束后立即置于冰浴中冷卻5 min，所得到的產物即為突變質粒。用得到的質粒轉化大腸桿菌DH5α感受態，用含有氨芐的LB培養基篩選陽性克隆，挑取陽性單克隆到液體LB培養基中，37 ℃、200 r/min搖床培養過夜后提取質粒并進行測序，將測序結果與pPIC9KMan1比對以確定是否突變成功。

1.4.3 畢赤酵母重組菌株的構建與篩選

將經過測序后確認構建成功的突變載體經限制性內切酶SacⅠ線性化后各取20 μL與80 μL畢赤酵母GS115感受態混合，混勻后，轉入冰預冷的0.2 cm電轉杯，冰上放置5 min后電擊（1 500 V、25 μF、200 Ω、6 ms）轉化，結束后迅速加入1 mL冰預冷的無菌1 mol/L山梨醇至杯中，于超凈臺內將所有溶液轉至滅菌離心管中，30 ℃條件下靜置培養1 h后取200 μL涂布于MD平板，30 ℃培養48～72 h至單克隆產生。

挑取MD板轉化子依次點于含不同質量濃度G418（1、2、4 mg/mL）的yPD培養基平板上，30 ℃分別培養48 h，以篩選多拷貝轉化子。將篩選到的陽性轉化子挑取到5 mL yPD液體培養基中，30 ℃、240 r/min培養16～18 h后提取重組酵母基因組DNA進一步鑒定。

1.4.4 甲醇誘導培養

挑取篩選得到并驗證正確的高拷貝單克隆，接種至含25 mL BMGy的250 mL搖瓶中，30 ℃、240 r/min培養至OD600nm為2～6（約16～18 h）。用滅菌離心管，4 ℃、3 000 r/min離心5 min收集細胞，用BMMy重懸細胞至OD600nm為1.0進行誘導。每24 h取樣，4 ℃、5 000 r/min離心5 min，收集上清液進行酶活力測定。為補償甲醇的揮發損失，每24 h補加甲醇至體積分數為0.5%，直至達到最佳的誘導時間。

1.4.5 突變體轉錄水平的測定

本實驗通過qRT-PCR方法比較3 種重組突變體與重組pPIC9K-Man1產甘露聚糖酶轉錄水平的差異。

將3 種重組突變體與重組pPIC9K-Man1在同一條件下進行甲醇誘導培養，72 h后提取重組菌體，用RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒分別提取4 種菌體的RNA并反轉錄為cDNA，以此為模板通過qRT-PCR進行定量比較。

qRT-PCR體系（20 μL）為：SyBR Premix Ex TaqⅡ（2×）10 μL、10 μmol M F 0.8 μL、10 μmol M R 0.8 μL、50×ROX reference dye 0.4 μL、cDNA 2 μL、H2O 6 μL。以3-磷酸甘油醛脫氫酶基因GAP為內參基因，不加入模板為陰性對照以排除其他成分污染的影響，重組pPIC9KMan1（甲醇誘導2 h的甘露聚糖酶）表達量為陽性對照，即定義為1。所有的PCR樣品進行3 次重復，重復水平的方差作為誤差。PCR擴增程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃延伸30 s，60 ℃ 20 s，40 個循環；程序循環95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。

1.4.6 突變體酶活力的測定

將3 種重組突變體與重組pPIC9K-Man1在同一條件下進行甲醇誘導培養，每隔24 h補甲醇至0.5%并取樣，5 000 r/min離心5 min取上清液作為粗酶液。用DNS法[26]測酶活力：取誘導上清液200 μL與1.8 mL底物0.5%刺槐豆膠溶液（50 mmol/L pH 5.0的檸檬酸鈉緩沖液配制）于試管中混勻，以200 μL檸檬酸鈉緩沖液作空白對照，置于60 ℃水浴反應5 min，流水冷卻，加入3 mL DNS溶液，加熱煮沸5 min。冷卻后在540 nm波長處測吸光度，以D-甘露糖標準溶液做標準曲線，酶活力定義：在pH 5.0、60 ℃的條件下，以每分鐘生成相當于1 μmol/L D-甘露糖所需的酶量為一個酶活力單位，用IU/mL表示。

1.4.7 突變體和非突變體重組甘露聚糖酶的純化

在誘導168 h后，將4 種重組體的發酵液4 ℃、5 000 r/min離心5 min取上清液并用Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒純化蛋白質。將上清液用0.22 μm濾膜過濾后加載到柱上，用含有pH 7.9 Tris-HCl和0.5 mmol/L NaCl的不同濃度咪唑溶液進行梯度洗脫，洗脫梯度為40、60、80、100、200、300、500 mmol/L。最后得到的純化樣品置于8～14 kD透析膜中用50 mmol/L檸檬酸緩沖液進行透析以置換出咪唑。將得到的蛋白質存于4 ℃條件下進行后續分析。

取部分純化后的樣品通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）[27]進行分析。

1.4.8 突變體熱穩定性的測定

將純化的4 種甘露聚糖酶適當稀釋后，分別在70 ℃保溫15、30、45、60 min，用DNS法測定3 種突變體和重組pPIC9K-Man1表達的β-甘露聚糖酶Man1的剩余酶活力，以最高甘露聚糖酶活力為100%，其他條件下的酶活力占最高酶活力的百分比為該酶在溫度處理后的相對酶活力。

2 結果與分析

2.1 糖基化位點的預測

用NetNGlyc 1.0 Server軟件在線分析里氏木霉β-甘露聚糖酶Man1中易發生N-糖基化修飾的位點。由圖1、表2可知，Man1中共有5 個天然N-糖基化位點（Asn-Xaa-Ser/ Thr），其中閾值超過0.5的分別是N131、N158和N329，對其進一步研究。

圖1 N-糖基化位點預測Fig. 1 Predicted N-glycosylation sites

表2 Man1序列N-糖基化位點預測結果Table 2 Predicted N-glycosylation sites of Man1

2.2 突變載體的構建與鑒定

2.2.1 突變載體的構建

圖2 定點突變PCR擴增Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products of mutant genes obtained by site-directed mutation

以重組pPIC9K-Man1為模板進行PCR擴增后得到線性的目的質粒，由圖2可知，條帶1～3可能是所需的目的基因片段。然后通過瓊脂糖凝膠回收試劑盒對目的條帶進行純化回收后，用DpnⅠ消化去除甲基化模板pPIC9K-Man1，用ExnaseⅡ催化使目的基因環化，即得到3 種突變重組質粒pPIC9K-N131、pPIC9K-N158和pPIC9K-N329。經大腸桿菌DH5α擴增后的重組質粒pPIC9K-Man1是經過甲基化修飾的，而PCR擴增產生的DNA片段不帶甲基化修飾，DpnⅠ酶的識別位點被甲基化后才能被識別切割，即DpnⅠ酶只能識別甲基化的模板鏈而不能識別PCR產物鏈，因此通過DpnⅠ酶消化就能把模板DNA鏈和新合成的PCR產物鏈區分開[28]。然后在ExnaseⅡ催化下擴增產物5′末端和3′末端由于存在15～21 bp反向互補區域可以發生同源重組，完成擴增產物的環化過程，即得到了環狀的突變重組載體。

2.2.2 重組質粒的驗證

用構建成功的3 種突變重組載體轉化大腸桿菌DH5α感受態，經氨芐抗性篩選后提取陽性轉化子，挑取單克隆培養并提取質粒后將質粒進行測序。測序結果與pPIC9KMan1序列進行比對，結果如圖3所示。N-糖基化修飾的特征氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr中編碼Asn的位點（AAT或AAC）均已突變為編碼中性的谷氨酰胺的位點（CAA），其他序列均與模板保持一致，這一結果說明3 個糖基化位點均已成功突變，3 種突變重組載體已構建成功。

圖3 突變序列的比對Fig. 3 Sequence alignment between mutant strains and pPIC9K-Man1

2.3 3 種重組突變體與重組Man1的比較

2.3.1 轉錄水平的比較

圖4 甘露聚糖酶轉錄水平的比較Fig. 4 Comparison of transcriptional expression levels of recombinant mannanases

通過進行qRT-PCR比較3 種畢赤酵母重組突變體與重組Man1在甲醇誘導72 h后產甘露聚糖酶轉錄水平的差異，結果如圖4所示。4 種重組菌體甘露聚糖酶的轉錄水平無明顯差異，卻均比重組Man1甲醇誘導2 h后產甘露聚糖酶轉錄水平高7～9 倍，說明N-糖基化修飾對重組甘露聚糖酶的轉錄水平表達無明顯影響，而甲醇誘導時間對重組甘露聚糖酶的影響較大。

2.3.2 酶活力水平的比較

圖5 4 種重組體產甘露聚糖酶活力和菌體生長曲線Fig. 5 Time-courses for mannanase production and the growth of recombinant strains

將篩選正確的3 種畢赤酵母重組突變體pPIC9K-N131、pPIC9K-N158和pPIC9K-N329與重組pPIC9K-Man1在同等條件下進行甲醇誘導，結果如圖5所示。隨著誘導時間的延長，甘露聚糖酶活力和菌體OD600nm也逐漸升高，然而在4 種重組體的菌體量與上清液中總蛋白質量濃度（1.2 mg/mL左右）均無顯著差異的條件下，重組甘露聚糖酶活力卻有很大不同，即去N-糖基化修飾的3 種突變體分泌的甘露聚糖酶活力與重組Man1相比均有所下降，其中N131、N158分泌的重組酶活力下降幅度比較大，分別為85.43%、79.48%，而N329與Man1相比酶活力下降幅度不大，僅為16.3%。突變后造成酶活力降低的原因可能是因為糖基化修飾可以通過改變蛋白質的整體構象從而影響構象決定的所有功能，如蛋白質的正確折疊，如果糖基化受到抑制，那么蛋白質不能正確折疊因而達不到應有的功能狀態[29]。

2.3.3 純化后的SDS-PAGE分析

圖6 突變體和原重組酶的SDS-PAGE分析Fig. 6 SDS-PAGE analysis of recombinant mannanases

pPIC9K-N131、pPIC9K-N158和pPIC9K-N329與重組pPIC9K-Man1分泌的4 種β-甘露聚糖酶經鎳柱純化后，進行進一步SDS-PAGE分析，結果如圖6所示，4 種重組甘露聚糖酶均呈單一條帶，再一次驗證了3 種畢赤酵母突變體已成功構建并成功表達了目的蛋白。3 種重組突變體與重組pPIC9K-Man1表達的蛋白質相比表觀分子質量略有下降，這可能是因為畢赤酵母分泌的蛋白質大多數為N-連接糖基化高甘露糖型，蛋白質轉錄后會一定程度上增加寡糖鏈長度。而增加的長度約為平均每個支鏈8～14 個甘露糖殘基，即去N-糖基化修飾后分子質量約降低1～3 kD[30]。因此從圖中可以看出3 種突變體與原重組體Man1相比，表觀分子質量僅有輕微的下降。

2.3.4 熱穩定性的比較

將3 種重組突變體和原重組體Man1在70 ℃分別處理不同時間，DNS法測相對酶活力，結果如圖7所示，4 種重組甘露聚糖酶（Man1、N131、N158和N329）的相對酶活力均隨處理時間的延長而劇烈下降，處理60 min后分別下降至13.82%、21.69%、27.32%和29.19%。而與原重組體Man1相比，3 種突變體（N131、N158和N329）熱穩定性分別提高了7.87%、13.5%和15.37%。酶在某一溫度條件下的半衰期是指將酶在某個溫度保存不同時間，測其在不同時間的剩余酶活力，當剩余酶活力為初始酶活力50%時對應的時間。從圖7可知，4 種重組甘露聚糖酶（Man1、N131、N158和N329）在70 ℃的半衰期的大小順序為：N329＞N158＞Man1＞N131，但是在相對酶活力下降到50%之后Man1的下降速率明顯高于N131，所以1 h后Man1的剩余活力最小。由此可見，這3 個位點的N-糖基化位點突變可以在一定程度上增強畢赤酵母中異源表達的β-甘露聚糖酶的熱穩定性，即這3 個位點的糖基化會降低該重組酶的熱穩定性，這可能是因為這3 個位點的糖基化影響了酶的局部結構的改變，使其變為相對不耐熱的結構，因而降低了它的熱穩定性。

圖7 突變體和原重組酶的熱穩定性比較Fig. 7 Comparison of thermal stability of recombinant mannanases

3 結 論

本實驗成功構建了畢赤酵母突變體N131、N158和N329，并且將它們所表達的β-甘露聚糖酶在表觀分子質量、酶活力、轉錄水平表達及熱穩定性等方面與重組Man1分泌的甘露聚糖酶進行了比較，結果發現，3 種突變重組甘露聚糖酶均能在畢赤酵母GS115中成功表達，且3 種突變體分泌的甘露聚糖酶純化后測得的表觀分子質量因其位點突變而有輕微的下降。突變后重組甘露聚糖酶在轉錄水平沒發生明顯變化，而在同一條件下3 種突變體（N131、N158和N329）的酶活力與重組Man1相比分別下降了85.43%、79.48%和16.3%，但熱穩定性卻分別提高了7.87%、13.5%和15.37%。可見N-糖基化修飾會在一定程度上增強畢赤酵母中異源表達的β-甘露聚糖酶活力，輕微降低它的穩定性，使表觀分子質量輕微增大，對酶轉錄水平表達無明顯影響。

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Effect of N-Glycosylation on the Heterologous Expression of β-Mannanase in Pichia pastoris

MA Qing1, CAI Rui1, JIANG Fengchao1, MA Lijuan1,2,*, DU Liping1,2, XIAO Dongguang1,2
(1. Key Laboratory of Industrial Microbiology, Ministry of Education, College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China; 2. Tianjin Food Safety & Low Carbon Manufacturing Collaborative Innovation Center, Tianjin 300457, China)

In order to investigate the influence of N-glycosylation on the expression of β-mannanase from Trichoderma reesei (Man1) in Pichia pastoris GS115, the asparagine (Asn) residues at three N-linked glycosylation sites (N131, N158 and N329) of Man1 were substituted by neutral glutamine (Gln) through site-directed mutagenesis. The results showed that mutations of the N-glycosylated sites had no significant effects on the expression of Man1 at the transcriptional level.

Compared with Man1, the apparent molecular mass of the mutant Man1 decreased slightly, and the activities of the mutants (N131, N158 and N329) decreased by 85.43%, 79.48% and 16.3%, respectively. However, the thermal stability of mutant N131, N158 and N329 increased by 7.87%, 13.5% and 15.37% compared to that of Man1. Therefore, N-glycosylation especially at N131 and N158 was essential for the high-level expression of Man1 in P. pastoris GS115, but led to a slight reduction in the thermal stability of Man1.

β-mannanase; N-glycosylation; site-directed mutagenesis; enzyme activity; thermal stability

10.7506/spkx1002-6630-201716013

Q55

A

1002-6630（2017）16-0086-06

馬清, 蔡瑞, 姜風超, 等. N-糖基化對β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中異源表達的影響[J]. 食品科學, 2017, 38(16): 86-91. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716013. http://www.spkx.net.cn

MA Qing, CAI Rui, JIANG Fengchao, et al. Effect of N-glycosylation on the heterologous expression of β-mannanase in Pichia pastoris[J]. Food Science, 2017, 38(16): 86-91. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716013. http://www.spkx.net.cn

2016-10-20

天津科技大學青年教師創新基金項目（2014CXLG10）；工業發酵微生物教育部重點實驗室暨天津市工業微生物重點實驗室（天津科技大學）開放基金項目（2014IM101）；天津市自然科學基金重點項目（16JCZDJC31800）

馬清（1993—），女，碩士研究生，研究方向為酶與分子生物學。E-mail：399491057@qq.com

*通信作者：馬立娟（1981—），女，助理研究員，博士，研究方向為生物質資源綜合利用、食品微生物發酵。

E-mail：malj@tust.edu.cn