近紅外漫反射光譜法快速檢測(cè)谷子蛋白質(zhì)和淀粉含量

田 翔，劉思辰，王海崗，秦慧彬，喬治軍*

近紅外漫反射光譜法快速檢測(cè)谷子蛋白質(zhì)和淀粉含量

田 翔1,2,3，劉思辰1,2,3，王海崗1,2,3，秦慧彬1,2,3，喬治軍2,3,*

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所，山西 太原 030031；2.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031；3.雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031）

建立近紅外漫反射光譜法測(cè)定谷子中的蛋白質(zhì)和淀粉含量，提供一種快速、簡(jiǎn)便、無(wú)損的分析方法進(jìn)行谷子品種資源鑒定和篩選。以191 份山西核心谷子種質(zhì)為材料，采用近紅外漫反射光譜法建立谷子蛋白質(zhì)和淀粉含量的快速檢測(cè)模型。結(jié)果表明，采用一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化光譜預(yù)處理，分別建立谷子蛋白質(zhì)和淀粉含量的校正模型，模型的校正決定系數(shù)（R2cal）分別為0.977 0和0.907 3，交叉驗(yàn)證均方根誤差分別為0.203%和0.466%，外部驗(yàn)證決定系數(shù)（R2val）分別為0.989 6和0.977 2，預(yù)測(cè)均方根誤差分別為0.225%和0.368%。對(duì)于谷子蛋白質(zhì)和淀粉的預(yù)測(cè)，化學(xué)法和近紅外儀器法測(cè)定間無(wú)顯著差異，近紅外測(cè)定結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的。說(shuō)明采用近紅外漫反射光譜分析技術(shù)能夠滿(mǎn)足對(duì)谷子蛋白質(zhì)和淀粉含量的檢測(cè)。

谷子；近紅外漫反射光譜；蛋白質(zhì)；淀粉

谷子起源于黃河流域，是我國(guó)古老的栽培作物，在我國(guó)北方居民生活中占有重要的地位，其淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素及硒等微量元素營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，可平衡膳食促進(jìn)人體健康[1]。早在《本草綱目》中有記載，谷子“治反胃熱痢，消渴口感，益丹田，補(bǔ)虛損，開(kāi)腸胃”。谷子中蛋白質(zhì)含量一般為8%～12%，蛋白質(zhì)含量是評(píng)價(jià)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高低的重要方面，對(duì)谷子蛋白質(zhì)含量的測(cè)定就成為谷子種質(zhì)資源鑒定以及選育優(yōu)良谷子品種和改良谷子品質(zhì)的重要項(xiàng)目之一[2-3]。目前測(cè)定谷子中蛋白質(zhì)和淀粉含量主要使用凱氏定氮法和旋光法，這些化學(xué)法可靠性高，但測(cè)定步驟繁瑣、費(fèi)用高，故不適宜對(duì)樣品進(jìn)行批量分析和無(wú)損檢測(cè)[4]。在谷子品質(zhì)育種過(guò)程中，需要對(duì)大量種質(zhì)資源、突變體、雜交后代材料快速鑒定和篩選，且無(wú)損檢測(cè)以便種子更新和繁殖。研究組利用MPA型傅里葉變換近紅外光譜儀建立了谷子中蛋白質(zhì)和淀粉含量的檢測(cè)模型[5]，為谷子品種資源品質(zhì)評(píng)價(jià)提供一種快速、簡(jiǎn)便、無(wú)損的分析方法。

近紅外漫反射光譜[6]是利用有機(jī)物在近紅外光譜區(qū)的特征振動(dòng)吸收信息而快速測(cè)定樣品中多種化學(xué)成分含量，如蛋白質(zhì)、脂肪、糖類(lèi)等。與常用的化學(xué)分析方法不同，近紅外光譜分析法是一種間接分析技術(shù)，是用統(tǒng)計(jì)的方法在樣品待測(cè)屬性值與近紅外光譜數(shù)據(jù)之間建立一個(gè)關(guān)聯(lián)模型（或稱(chēng)校正模型），之后通過(guò)驗(yàn)證完成模型的建立，利用近紅外光譜儀器測(cè)得的樣品光譜數(shù)據(jù)即可通過(guò)軟件模型預(yù)測(cè)被測(cè)組分含量，近紅外法具有操作簡(jiǎn)單、分析速度快、無(wú)損傷、環(huán)保等特點(diǎn)。近紅外漫反射光譜技術(shù)對(duì)小麥、大豆、玉米等大宗作物品質(zhì)分析的報(bào)道較多，在小宗雜糧品質(zhì)分析上應(yīng)用很少[7]。在蔬菜的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)評(píng)價(jià)方面，王多加等[8]用近紅外光譜法非破壞性檢測(cè)了西紅柿、草莓、南瓜中蔗糖、葡萄糖、果糖、檸檬酸、蘋(píng)果酸等營(yíng)養(yǎng)成分，結(jié)果都表明近紅外光譜分析法可滿(mǎn)足實(shí)際應(yīng)用所需的測(cè)定精度。張帆等[9]利用近紅外光譜檢測(cè)西瓜干粉中纖維素和可溶性糖。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)谷子蛋白質(zhì)和淀粉含量的真實(shí)值建立近紅外光譜分析模型，利用該模型快速定量檢測(cè)谷子品質(zhì)。為建立谷子常規(guī)品質(zhì)近紅外光譜分析模型，首先用化學(xué)測(cè)定方法測(cè)定了170 份谷子蛋白質(zhì)和淀粉的含量，利用德國(guó)Bruke公司生產(chǎn)的MPA型傅里葉變換近紅外光譜儀和OPUS建模軟件，建立谷子蛋白質(zhì)近紅外光譜分析模型，并用21 份驗(yàn)證集進(jìn)行預(yù)測(cè)，此法為谷子育種與品質(zhì)分析提供一種方便有效的分析方法[10]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

供試的191 份谷子資源由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所育種專(zhuān)家提供，其粒形多樣，產(chǎn)地不同，色澤分黃、白、紅、綠、黑和灰色，因此該模型品質(zhì)特性具有廣泛的代表性。170 個(gè)樣品作為建立濃度定標(biāo)方程的定標(biāo)樣品。21 個(gè)樣品做為驗(yàn)證集。

DHG-9140AS電熱鼓風(fēng)干燥箱 寧波東南儀器有限公司；8400型全自動(dòng)凱氏定氮儀 丹麥福斯公司；MPA型傅里葉變換近紅外光譜儀 德國(guó)Bruke公司；AP-300旋光儀 日本奧拓公司。

1.2 方法

1.2.1 谷子蛋白質(zhì)含量測(cè)定

參考GB/T 5511—2008《谷物和豆類(lèi)氮含量測(cè)定和粗蛋白質(zhì)含量計(jì)算 凱氏法》，實(shí)驗(yàn)室利用全自動(dòng)凱氏定氮儀進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)校正樣品集谷子脫殼磨碎，稱(chēng)取0.5 g試樣2 份置于250 mL消化管，再加入消化片5 g，然后加入12 mL濃硫酸，輕輕搖動(dòng)消化管，使試樣被硫酸濕潤(rùn)。將消化管放入420 ℃的消化爐上，約90 min樣品消化至透明藍(lán)綠色液體，取出冷卻至室溫。把消化管放入全自動(dòng)凱氏定氮儀，設(shè)定分析程序后儀器依次進(jìn)行自動(dòng)蒸餾、滴定、結(jié)果計(jì)算和清洗。結(jié)果為蛋白質(zhì)含量（%），蛋白系數(shù)6.25。兩次測(cè)定的相對(duì)誤差小于1%。

1.2.2 谷子淀粉含量測(cè)定

參照GB 5006—1985《谷物籽粒粗淀粉測(cè)定法》，重復(fù)稱(chēng)取同一個(gè)脫殼磨粉的谷子樣品兩份，每份2.5 g，放在250 mL錐形瓶中，加入氯化鈣-乙酸溶液高溫水解25 min，迅速冷卻，再加入1 mL 30%硫酸鋅溶液和1 mL 15%亞鐵氰化鉀溶液沉淀蛋白，過(guò)濾后，在室溫（20±1）℃條件下進(jìn)行旋光度測(cè)定，取2 次讀數(shù)平均值，計(jì)算淀粉含量，2 個(gè)平行測(cè)定結(jié)果的相對(duì)誤差不得大于1.0%[11]。

1.2.3 近紅外漫反射光譜采集與光譜分析

利用MPA傅里葉變換近紅外光譜儀，以鍍金的漫反射體作參比，樣品杯為容積25 cm3的圓柱形石英杯，每次裝樣滿(mǎn)2/3為宜。掃描光譜區(qū)選用3 594.9～12 790.3 cm-1，分辨率采用16 cm-1，每隔2 nm采集反射強(qiáng)度，重復(fù)對(duì)樣品進(jìn)行近紅外光譜掃描采集64 次后形成一條反射光譜儲(chǔ)存[12]。每份樣品掃描2 次取平均值，并將反射光譜信息轉(zhuǎn)換成吸光度儲(chǔ)存[13]，使用OPUS建模軟件對(duì)光譜進(jìn)行優(yōu)化處理、數(shù)學(xué)分析和回歸統(tǒng)計(jì)。如圖1所示，校正集合中170 份谷子近紅外掃描圖譜區(qū)域范圍較寬，選擇的谷子差異性明顯，有利于建模。先用谷子校正樣品集建立校正模型，并做內(nèi)部交叉驗(yàn)證，再將驗(yàn)正樣品集進(jìn)行外部驗(yàn)證，根據(jù)交叉驗(yàn)證決定系數(shù)（R2cv）、交叉驗(yàn)證均方根誤差（root mean square errors of cross-validation，RMSECV）、外部驗(yàn)證決定系數(shù)（R2val）、預(yù)測(cè)均方根誤差（root mean square errors of prediction，RMSEP）等指標(biāo)確定最優(yōu)模型[14]。對(duì)于同一樣品集所構(gòu)建的回歸方程而言，校正決定系數(shù)R2cal越大，近紅外分析結(jié)果與化學(xué)分析結(jié)果越吻合，可信度越高；交叉驗(yàn)證決定系數(shù)R2cv越大，RMSECV越低，定標(biāo)建模過(guò)程中進(jìn)行交叉驗(yàn)證時(shí)得到的近紅外預(yù)測(cè)值與化學(xué)分析值越接近，定標(biāo)模型的準(zhǔn)確度越高[15-16]。

圖1 谷子近紅外漫反射光譜掃描圖譜Fig. 1 Near infrared spectra of foxtail millet samples

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的化學(xué)分析結(jié)果

由表1可知，構(gòu)建定標(biāo)模型的谷子資源蛋白質(zhì)含量范圍為9.82%～16.63%，平均值為13.05%，高于玉米、接近小麥。谷子淀粉含量范圍為70.13%～82.15%，平均值為76.27%。其中蛋白質(zhì)含量高于谷子一級(jí)優(yōu)質(zhì)米鑒定標(biāo)準(zhǔn)12.5%以上的優(yōu)異資源有91 份，高于16.00%的優(yōu)異資源共計(jì)10 份。經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)種皮的顏色與蛋白含量無(wú)顯著相關(guān)性，高蛋白含量的谷子普遍粒形中等偏大。谷子顏色、形態(tài)和大小各不同[17]，數(shù)據(jù)變幅較大，建立的模型有較好的適用性。通過(guò)對(duì)上述谷子種質(zhì)資源的鑒定評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，谷子種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性[18]。

表1 191 份山西谷子樣品中蛋白及淀粉含量Table 1 Contents of crude protein and starch in 191 foxtail millet samples from Shanxi province

2.2 近紅外定標(biāo)模型的建立

本實(shí)驗(yàn)利用MPA傅里葉變換近紅外光譜儀，通過(guò)OPUS/QUANT軟件中的自動(dòng)優(yōu)化功能，分別對(duì)谷子蛋白和淀粉建模的最佳光譜預(yù)處理方法進(jìn)行篩選，得到對(duì)原始近紅外漫反射圖譜的數(shù)學(xué)預(yù)處理方式均為一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化法，譜區(qū)范圍均選擇3 594.9～12 790.3 cm-1，通過(guò)對(duì)谷子蛋白和淀粉建標(biāo)模型的交叉驗(yàn)證，比較RMSECV和主因子數(shù)等參數(shù)，確定最優(yōu)校正模型[19]。

2.3 定標(biāo)模型的驗(yàn)證

2.3.1 內(nèi)部交叉驗(yàn)證

根據(jù)樣品的近紅外的特征，利用軟件的自動(dòng)驗(yàn)證功能，軟件每次在170 份建標(biāo)谷子樣品中隨機(jī)選取2 份樣品作為檢驗(yàn)樣品，用其余的谷子樣品（168 份）建立定標(biāo)模型，并對(duì)檢驗(yàn)樣品做預(yù)測(cè)，自動(dòng)重復(fù)至所有樣品均被作過(guò)檢驗(yàn)樣品[20]。谷子蛋白質(zhì)和淀粉含量的交叉檢驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，其R2cal分別為0.977 0和0.907 3，RMSECV分別為0.203%和0.466%。

圖2 蛋白質(zhì)含量（A）和淀粉含量（B）預(yù)測(cè)值與真實(shí)值的相關(guān)關(guān)系Fig. 2 Relationship between the predicted values and chemically measured values of crude protein (A) and starch content (B) for test set

2.3.2 外部驗(yàn)證

近紅外模型外部驗(yàn)證就是采用未參加模型建立的、化學(xué)成分已知的驗(yàn)證集樣品對(duì)所建模型的實(shí)際預(yù)測(cè)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)[21-22]。如圖3所示，研究用21 份獨(dú)立于建模的谷子樣品對(duì)上述谷子蛋白質(zhì)和淀粉模型分別檢驗(yàn)，結(jié)果蛋白質(zhì)和淀粉的R2val分別為0.989 6和0.977 2， RMSEP分別為0.225%和0.368%，斜率分別為1.010和0.913，蛋白含量預(yù)測(cè)值與真實(shí)值間絕對(duì)誤差小于0.28%，淀粉含量預(yù)測(cè)值與真實(shí)值間絕對(duì)誤差小于0.35%。對(duì)于谷子蛋白質(zhì)和淀粉的預(yù)測(cè)，化學(xué)法和近紅外儀器法測(cè)定間無(wú)顯著差異，近紅外漫反射光譜測(cè)定結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的。說(shuō)明采用近紅外漫反射光譜分析技術(shù)能夠滿(mǎn)足對(duì)谷子常規(guī)品質(zhì)成分的檢測(cè)。

圖3 谷子蛋白質(zhì)含量（A）和淀粉含量（B）真實(shí)值與近紅外預(yù)測(cè)值線(xiàn)性相關(guān)關(guān)系Fig. 3 Linear correlation between actually measured values and NIRS predicted values of protein (A) and starch content (B) in foxtail millet

研究選用山西省191 份谷子種質(zhì)資源，利用MPA傅里葉變換近紅外光譜儀，通過(guò)近紅外分析技術(shù)，借助于近紅外定標(biāo)軟件，分析譜區(qū)為3 594.9～12 790.3 cm-1，采用一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化光譜預(yù)處理[23-24]，初步建立谷子蛋白質(zhì)和淀粉含量的預(yù)測(cè)模型。谷子蛋白和淀粉定標(biāo)模型外部檢驗(yàn)決定系數(shù)達(dá)0.97以上、誤差在0.368%以下，在谷子資源品質(zhì)育種中能夠滿(mǎn)足大批量品種的快速、無(wú)損檢測(cè)要求，有效地提高谷子品質(zhì)育種效率，為谷子蛋白和淀粉含量分析鑒定提供了一種新的、有效的技術(shù)手段。通過(guò)對(duì)上述谷子蛋白質(zhì)和淀粉含量評(píng)價(jià)鑒定，篩選出高蛋白和高淀粉含量的優(yōu)異資源30 份，今后可利用初步建立的谷子品質(zhì)預(yù)測(cè)模型快速檢測(cè)更多的谷子資源，為育種和生產(chǎn)服務(wù)[25-27]。

3 討 論

采用MPA傅里葉變換近紅外光譜儀對(duì)191 份谷子種子樣本進(jìn)行光譜掃描，利用光譜定量分析軟件進(jìn)行光譜預(yù)處理、數(shù)學(xué)方法運(yùn)算及回歸統(tǒng)計(jì)分析，得到了谷子蛋白質(zhì)和淀粉的近紅外定標(biāo)模型。由于建標(biāo)的谷子樣本是完整帶殼的，也不會(huì)因脫殼造成水分或營(yíng)養(yǎng)流失，而且經(jīng)掃描后谷子籽粒不會(huì)破損，因此該模型既滿(mǎn)足了谷子品質(zhì)育種中的資源的快速檢測(cè)要求，也是一種無(wú)損檢測(cè)的方法。不僅為谷子品質(zhì)育種及資源評(píng)價(jià)提供有益的參考，而且對(duì)加快谷子品種資源研究，提供了十分方便的測(cè)試手段[28]。

本實(shí)驗(yàn)使用定標(biāo)樣品較少，對(duì)我國(guó)的復(fù)雜多樣、品種繁多的谷子種質(zhì)來(lái)說(shuō)，不具備普遍代表性，另外谷子外殼的顏色、化學(xué)真值的準(zhǔn)確度和谷子的純度、谷子建標(biāo)資源數(shù)量都是影響模型的準(zhǔn)確度的重要因素。今后工作中需不斷補(bǔ)充新的谷子進(jìn)行模型補(bǔ)充矯正和升級(jí)優(yōu)化，進(jìn)一步保持模型的穩(wěn)定性和提高模型的準(zhǔn)確性。

今后可利用傅里葉變換近紅外漫反射技術(shù)測(cè)定物質(zhì)成分具有無(wú)損、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，探索其在谷子品質(zhì)測(cè)定方面的廣泛的應(yīng)用，如纖維素、脂肪、氨基酸等化學(xué)成分的定量研究[29-30]。

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Application of Near Infrared Diffuse Reflectance Spectroscopy in Rapid Detection of Crude Protein and Starch in Foxtail Millet

TIAN Xiang1,2,3, LIU Sichen1,2,3, WANG Haigang1,2,3, QIN Huibin1,2,3, QIAO Zhijun2,3,*
(1. Institute of Crop Germplasm Resources, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030031, China; 2. Key Laboratory of Crop Gene Resources & Germplasm Enhancement on Loess Plateau, Ministry of Agriculture, Taiyuan 030031, China; 3. Shanxi Key Laboratory of Genetic Resources and Genetic Improvement of Minor Crops, Taiyuan 030031, China)

This study aimed to establish a near infrared (NIR) diffuse reflectance spectrometry method for measuring the contents of crude protein and starch in foxtail millet for providing a fast, simple and non-destructive analytical method for the identification and screening of foxtail millet germplasm resources. For this purpose, a total of 191 samples of a foxtail millet core collection in Shanxi province were measured using NIR diffuse reflectance spectroscopy. The results showed that with the spectral preprocessing method of first derivative + vector normalization, calibration models were established to predict the contents of crude protein and starch in foxtail millet. The corresponding coefficients of determination for calibration (R2cal) were 0.977 0 and 0.907 3, and the root mean square errors of cross-validation (RMSECV) were 0.203% and 0.466%, the coefficients of determination for external validation (R2val) were 0.989 6 and 0.977 2, and the root mean square errors of prediction (RMSEP) were 0.225% and 0.368%, respectively. For the detection of crude protein and starch foxtail millet, no significant differences were seen between chemical analysis and NIR measurement, but the results obtained with NIR measurement were more accurate and reliable. NIR diffuse reflectance spectrometry technology can be useful for the detection of crude protein and starch in foxtail millet.

foxtail millet; near infrared (NIR) diffuse reflectance spectrometry; crude protein; starch

10.7506/spkx1002-6630-201716022

S515

A

1002-6630（2017）16-0140-05

2016-06-22

國(guó)家谷子高粱產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系谷子糜子生理崗位項(xiàng)目（CARS-06-13.5-A16）；國(guó)家農(nóng)作物種質(zhì)資源平臺(tái)山西作物子平臺(tái)項(xiàng)目（NICGR2016-02）；山西省農(nóng)作物種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)研究項(xiàng)目（2017ZZCX-17）；山西省省級(jí)財(cái)政支農(nóng)專(zhuān)項(xiàng)（2016ZYZX41）

田翔（1982—），女，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)作物品質(zhì)分析。E-mail：704193015@qq.com

*通信作者：?jiǎn)讨诬姡?964—），男，研究員，學(xué)士，研究方向?yàn)槊幼釉耘嗪唾Y源。E-mail：nkypzs@126.com.cn

田翔, 劉思辰, 王海崗, 等. 近紅外漫反射光譜法快速檢測(cè)谷子蛋白質(zhì)和淀粉含量[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(16): 140-144. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716022. http://www.spkx.net.cn

TIAN Xiang, LIU Sichen, WANG Haigang, et al. Application of near infrared diffuse reflectance spectroscopy in rapid detection of crude protein and starch in foxtail millet[J]. Food Science, 2017, 38(16): 140-144. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716022. http://www.spkx.net.cn