牡蠣酶解液美拉德反應體系優化及產物營養評價

劉海梅，安孝宇，陳 靜，王 靜，趙 芹，郭青君，車欣欣，崔 云

牡蠣酶解液美拉德反應體系優化及產物營養評價

劉海梅，安孝宇，陳 靜，王 靜，趙 芹，郭青君，車欣欣，崔 云

（魯東大學食品工程學院，山東 煙臺 264025）

以牡蠣酶解液為氨基來源，與葡萄糖發生美拉德反應，以感官評分和褐變程度為指標，優化美拉德反應的工藝條件，并通過氨基酸評分、化學評分、必需氨基酸指數（essential animo acids index，EAAI）評價美拉德反應產物的營養品質。結果表明，葡萄糖美拉德反應的最佳工藝參數為葡萄糖添加量8%、反應溫度110 ℃、pH 7.5、反應時間90 min；美拉德反應產物中18 種氨基酸齊全，必需氨基酸含量占總氨基酸含量的32.99%，EAAI為71.568，營養品質較高。鮮味氨基酸含量豐富，Glu含量最高。

牡蠣酶解液；美拉德反應；葡萄糖；營養評價

美拉德反應是指羰基化合物（如還原糖、醛、酮）的羰基和氨基化合物（如氨基酸、肽、蛋白質）的氨基之間發生的復雜反應，美拉德反應產物種類繁多，對食品的風味、色澤、抗氧化性等品質有著至關重要的影響[1-6]。美拉德反應已廣泛應用于肉味、海鮮調味料的制備[7-8]，如利用豬骨酶解液、雞骨泥酶解液、鱈魚皮蛋白與氨基酸制備肉味調料[9-12]；利用文蛤、蝦頭等海鮮酶解產物與還原糖組成美拉德反應體系，制備風味濃郁的海鮮調味料[13-15]。關于美拉德反應產物抗氧化性的研究也越來越受到關注。盧彬等[16]發現，溫度對金帶細鲹魚肉美拉德反應產物的抗氧化性具有重要影響，120 ℃條件下獲得的美拉德反應產物還原力和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率較100 ℃的大幅度提高，而羥基自由基清除率和Fe2+螯合能力明顯下降。張陸霞等[17]也采用美拉德反應制備了鱈魚排水解蛋白美拉德反應產物，產物具有較強的抗氧化能力。肖軍霞等[18]采用木瓜蛋白酶水解牡蠣得到酶解液，與葡萄糖反應生成美拉德反應產物，該產物還原能力強。這些研究都是基于食品酶解后產生的游離氨基酸和小肽作為美拉德反應氨基來源。美拉德反應除了受溫度、時間、pH值、還原糖種類影響外，反應體系中肽、游離氨基酸含量與種類是影響美拉德反應的重要因素，底物肽、氨基酸的產生與所使用的蛋白酶密切相關，不同的蛋白酶其酶解效力不同，生成的酶解產物也存在差異。因此，研究不同蛋白酶的酶解產物對美拉德反應產物的色澤、風味、抗氧化性等品質的影響具有重要的意義。

本實驗通過復合蛋白酶水解牡蠣獲得牡蠣酶解液，以牡蠣酶解液為研究對象，與葡萄糖組成美拉德反應體系，通過感官評定和褐變程度篩選美拉德反應的適宜工藝參數，并對美拉德反應產物進行營養品質評價，為后續美拉德反應產物抗氧化、降血壓等生理功能研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

太平洋牡蠣（Crassostrea gigas） 市購；復合蛋白酶Protamex（1.5 AU/g） 諾維信憶諾聯創生物科技（北京）有限公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

721G可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；DF-2集熱式恒溫磁力攪拌器（油浴鍋） 金壇市白塔金昌實驗儀器廠；TDL-5-A離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 牡蠣酶解液的制備

將復合蛋白酶按30 AU/kg的加酶量加入牡蠣肉勻漿（牡蠣肉與水質量比1∶5）中，自然pH值、50 ℃恒溫酶解4 h，置于100 ℃沸水中滅酶15 min，酶解產物于5 000 r/min離心15 min，所得上清液即為牡蠣酶解液。

1.3.2 美拉德反應產物褐變程度的測定

以美拉德反應產物在波長420 nm處的吸光度表示褐變程度[7]。

1.3.3 感官評定

感官評定小組由10 人（5 男5 女）組成，對美拉德反應產物進行描述性感官鑒評，描述統計其色澤和風味[19-20]，評價標準見表1、2。

表1 美拉德反應產物風味評分標準Table 1 Criteria for flavor evaluation of Maillard reaction products (MRPs)

表2 美拉德反應產物色澤評分標準Table 2 Criteria for color evaluation of MRPs

1.3.4 美拉德反應條件優化設計

依據單因素試驗結果，設計正交試驗L9（34），對美拉德反應條件進行優化，如表3所示。

表3 美拉德反應正交試驗因素與水平Table 3 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in orthogonal array design

1.3.5 氨基酸組成的測定

樣品用6 mol/L鹽酸溶液在110 ℃水解24 h，調制上機濃度，用氨基酸自動分析儀測定除色氨酸外的17 種氨基酸[21]，色氨酸采用可見分光光度法[22]測定。

1.3.6 酶解液中氨基酸品質的評價

根據聯合國糧食與農業組織（Food and Agriculture Organization，FAO）/世界衛生組織（World Health Organization，WHO）1973年建議的氨基酸評分（animo acids score，AAS）標準模式[23]和全雞蛋蛋白質的氨基酸模式[24]分別按公式（1）～（3）計算化學評分（chemical score，CS）、AAS和必需氨基酸指數（essential animo acids index，EAAI）[25]。

式中：aa為樣品每克蛋白質中氨基酸含量/%；AA為FAO/WHO評分模式中同種氨基酸含量/%；n為比較的氨基酸個數；a、b、c、…、j為酶解液中的必需氨基酸含量/（mg/g）；ae、be、ce、…、je為全雞蛋蛋白質的必需氨基酸含量/（mg/g）。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖添加量對美拉德產物色澤和風味的影響

于牡蠣酶解液中依次加入不同質量分數的葡萄糖（2%、4%、6%、8%、10%），自然pH值、100 ℃加熱60 min，冷卻后于5 000 r/min離心15 min，取上清液，于波長420 nm處測定吸光度，品評其感官特性，如圖1所示。還原糖（葡萄糖）添加量的增加提高了美拉德反應速度，美拉德反應產物生成量增加，褐變程度增加[26]，增強了MPRs的整體風味，但同時葡萄糖添加量過大也會使反應液產生焦糖味，掩蓋了其他風味，而使整體的風味受到一定的影響。當葡萄糖添加量達到8%時，美拉德反應產物具有濃郁的糖香味，鮮味較濃，整體風味良好，且褐變程度增加趨勢趨于平緩，褐變程度達到最大。因此，葡萄糖添加量為8%是參與牡蠣酶解液美拉德反應的適宜添加量。

圖1 不同葡萄糖添加量條件下美拉德反應產物褐變程度、感官評分和感官評分雷達圖Fig. 1 Browning degree and sensory evaluation and sensory evaluation radar graph of MRPs obtained at different glucose concentrations

2.2 反應溫度對美拉德反應產物色澤和風味的影響

在一定的反應時間內，反應溫度每升高10 ℃，美拉德反應速率提高3～5 倍[27]。反應溫度的高低會促使美拉德反應沿著不同的反應途徑進行，從而形成不同風味的產物[28]。研究表明，在80～120 ℃的反應溫度范圍內，褐變速率會隨著反應溫度的上升而增大，而超過120 ℃后，褐變速率下降[29]。調整牡蠣酶解液中葡萄糖添加量為8%，pH 7.0，分別在80、90、100、110、120 ℃條件下加熱60 min，冷卻后5 000 r/min離心15 min，取上清液，于波長420 nm處測定吸光度，品評其感官特性，如圖2所示。反應溫度低于100 ℃時，美拉德反應液的褐變程度較低，糖香味不足，鮮味較淡，且有明顯的腥味和苦味，不易被接受；反應溫度高于100 ℃時，美拉德反應液的褐變程度增強，褐變速率線性增加，且整體風味增強，感官評分增加，但當反應溫度達到120 ℃時，出現焦糖味影響整體風味。因此，適宜的反應溫度選擇110 ℃。

圖2 不同反應溫度條件下美拉德反應產物褐變程度、感官評分和感官評分雷達圖Fig. 2 Browning degree, sensory evaluation and sensory evaluation radar graph of MRPs obtained at different temperatures

2.3 pH值對美拉德反應產物色澤和風味的影響

圖3 不同pH值條件下美拉德反應產物褐變程度、感官評分和感官評分雷達圖Fig. 3 Browning degree and sensory evaluation and sensory evaluation radar graph of MRPs obtained at different pH values

pH值影響美拉德反應中某些途徑的反應速率，從而改變風味物質形成的平衡。當pH值在3～10之間時，美拉德反應會隨著pH值的升高而呈上升趨勢[27]，色澤也會相對加深。在酸性條件下，美拉德初始反應產物N-葡萄糖胺易水解，而其是美拉德反應特征風味形成的前體物質[27]，因此，酸性條件下反應速率低。偏堿性的環境有利于美拉德反應的進行，且堿性越高，反應越強烈，速度越快[30-31]。調整牡蠣酶解液中葡萄糖添加量為8%、反應溫度為110 ℃，并調節反應液pH值分別為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，冷卻后于5 000 r/min離心15 min，取上清液，于波長420 nm處測定吸光度，品評其感官特性，如圖3所示。隨著pH值的升高，美拉德反應速率不斷增大，且在pH 7.5時色澤和感官評分基本達到最大值，繼續升高初始反應pH值，焦糖香氣越來越明顯，鮮味減弱，苦味增強，影響整體美拉德反應產物的風味。由此可見，pH值為7.5是適宜的反應pH值。

2.4 反應時間對美拉德反應產物色澤和風味的影響

圖4 不同反應時間條件下美拉德反應產物褐變程度、感官評分和感官評分雷達圖Fig. 4 Browning degree and sensory evaluation and sensory evaluation radar graph of MRPs obtained at different reaction times

調整牡蠣酶解液中葡萄糖添加量為8%，在pH 7.5、反應溫度100 ℃條件下分別加熱反應30、60、90、120 min和150 min，冷卻后5 000 r/min離心15 min，取上清液，于波長420 nm處測定吸光度，并評價感官特性，如圖4所示。隨著反應時間的延長，反應液中的氨基酸和還原糖不斷發生反應，形成大量類黑精色素和含氮雜環化合物[16]。反應初期，美拉德反應的褐變程度隨反應時間的延長而增強，當反應時間達到120 min后，褐變程度基本趨于平緩。而反應時間達到90 min時，感官評分基本達到最高，繼續反應，美拉德反應產物風味降低。因此，適宜的反應時間為90 min。

2.5 美拉德反應條件的優化與驗證

表4 美拉德反應正交試驗設計與結果Table 4 Orthogonal array design with experimental results

采用正交試驗L9（34），對美拉德反應條件進行優化，正交結果如表4所示。用極差法分析各因素對美拉德反應的影響。對吸光度而言，各因素對美拉德反應影響的大小順序為葡萄糖添加量＞反應溫度＞反應時間＞pH值。對感官評分而言，各因素對美拉德反應影響的大小順序為反應溫度＞葡萄糖添加量＞反應時間＞pH值。根據正交試驗結果，綜合4 種因素對美拉德反應產物的色澤與風味的影響，得出最佳工藝條件為葡萄糖添加量8%、反應溫度110 ℃、pH 7.5、反應時間90 min。在此優化條件下，得到的美拉德反應產物感官評分為4.67，吸光度為0.798，感官評分高于正交試驗所有組別，證明優化結果優于各正交試驗組，所得產物腥味降低、口感醇厚、柔和，色澤為淺褐色。

2.6 美拉德反應液的氨基酸組成及營養評價

表5 氨基酸組成Table 5 Amino acid composition of MRPs

由表5可知，美拉德反應產物中存在18 種氨基酸，氨基酸種類齊全，其中必需氨基酸8 種（Lys、Trp、Phe、Met、Thr、Ile、Leu、Val）、半必需氨基酸2 種（Cys、Tyr）、非必需氨基酸8 種（Asp、Gly、Ala、Ser、Glu、Pro、Arg、His）。總氨基酸含量為873.956 mg/100 mL，其中必需氨基酸總量為289.322 mg/100 mL，占總氨基酸含量的32.99%；鮮味氨基酸含量最為豐富，總含量為365.119 mg/100 mL，5 種鮮味氨基酸（Asp、Glu、Gly、Ala、Arg）齊全，其中Glu含量最高，含量為126.317 mg/100 mL。

表6 美拉德反應產物中必需氨基酸的營養評價Table 6 Nutritional evaluation of essential amino acids in MRPs

由表6可知，當以AAS為標準時，Trp評分最高，為標準的1.98 倍，其次為Tyr+Phe，為標準的1.25 倍，其余氨基酸的評分在60～89之間；當以CS為標準時，Trp評分最高，為標準的1.16 倍，其余氨基酸的評分在56～87之間。2 種評分標準下，第1、2限制性氨基酸相同，分別為Val和Leu。EAAI是評價蛋白質營養價值的常用指標之一，反映的是必需氨基酸與標準蛋白相接近的程度[14]。水解液EAAI為71.568，表明必需氨基酸含量豐富，營養價值較高。

3 結 論

以牡蠣酶解液為氨基來源，與葡萄糖發生美拉德反應，優化得到美拉德反應條件為葡萄糖添加量8%、反應溫度110 ℃、pH 7.5、反應時間90 min。美拉德反應產物的口感醇厚、柔和，色澤為淺褐色，腥味不明顯。美拉德反應產物中18 種氨基酸齊全，必需氨基酸占總氨基酸含量的32.99%，鮮味氨基酸含量豐富，Glu含量最高，主要限制性氨基酸為Val和Leu，其EAAI為71.568，營養品質較高。

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Optimization of the Maillard Reaction Conditions of Enzymatic Hydrolysate of Oyster and Nutritional Evaluation of Maillard Reaction Products

LIU Haimei, AN Xiaoyu, CHEN Jing, WANG Jing, ZHAO Qin, GUO Qingjun, CHE Xinxin, CUI Yun
(School of Food Engineering, Ludong University, Yantai 264025, China)

Oyster enzymatic hydrolysate and glucose were used to establish a Maillard reaction system. The reaction conditions were optimized based on sensory evaluation and browning degree, and the nutritional quality of Maillard reaction products was evaluated by amino acid score (AAS), chemical score (CS), and essential animo acids index (EAAI). The optimal reaction parameters were determined as follows: glucose concentration, 8%; temperature, 110 ℃; pH value, 7.5; and reaction time, 90 min. In the Maillard reaction products, 18 amino acids were detected with essential amino acids (EAAs) accounting for 32.99% of the total amino acids. EAA index (EAAI) was 71.568 indicating high nutritional quality. Umami amino acids, especially glutamic acid, were abundant.

oyster enzymatic hydrolyzate; Maillard reaction; glucose; nutritional evaluation

10.7506/spkx1002-6630-201716028

TS254

A

1002-6630（2017）16-0178-05

劉海梅, 安孝宇, 陳靜, 等. 牡蠣酶解液美拉德反應體系優化及產物營養評價[J]. 食品科學, 2017, 38(16): 178-182. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716028. http://www.spkx.net.cn

LIU Haimei, AN Xiaoyu, CHEN Jing, et al. Optimization of the Maillard reaction conditions of enzymatic hydrolysate of oyster and nutritional evaluation of Maillard reaction products[J]. Food Science, 2017, 38(16): 178-182. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716028. http://www.spkx.net.cn

2016-06-14

山東省自然科學基金項目（ZR2014BP016；ZR2015PC002）；山東省科技發展計劃項目（2012YD07013）

劉海梅（1979—），女，教授，博士，主要從事水產品加工與綜合利用研究。E-mail：hellen_79@aliyun.com