胡蘿卜片中富集植物乳桿菌的工藝優化

崔 莉，牛麗影，黃家鵬，李大婧，張鐘元，劉春菊，劉春泉，劉瑩萍，肖麗霞,*

胡蘿卜片中富集植物乳桿菌的工藝優化

崔 莉1，牛麗影1，黃家鵬1，李大婧1，張鐘元1，劉春菊1，劉春泉1，劉瑩萍2，肖麗霞2,*

（1.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127）

為將植物乳桿菌富集到胡蘿卜中以制備含益生菌的果蔬功能食品，本研究首先通過單因素和正交試驗優化植物乳桿菌以真空浸漬和超聲浸漬的方式富集到胡蘿卜片中的工藝參數，然后以常壓浸漬為對照比較3 種浸漬方式下胡蘿卜片中富集的活菌數，以期獲得較優的胡蘿卜植物乳桿菌富集方式。結果表明，真空浸漬較優工藝參數為真空浸漬溫度35 ℃、真空浸漬時間15 min、復壓浸漬時間20 min；超聲浸漬較優工藝參數為超聲浸漬溫度30 ℃、超聲浸漬功率125 W、超聲浸漬時間12 min。比較真空浸漬、超聲浸漬和常壓浸漬3 種方式下胡蘿卜中活菌數可知，真空浸漬組活菌數最多，達到1010CFU/g以上；掃描電子顯微鏡結果顯示，在真空和超聲浸漬的胡蘿卜組織中均觀察到桿狀菌體，而在常壓浸漬樣品的組織內部未發現菌體。3 種浸漬方式下胡蘿卜組織表面均有大量菌體。本研究獲得了較優的胡蘿卜中富集植物乳桿菌工藝參數，為乳酸菌或其他菌通過真空浸漬富集到果蔬組織中提供實驗依據，也為含益生菌功能食品開發提供新思路。

益生菌；胡蘿卜片；真空浸漬；超聲浸漬

益生菌是指當攝入充足數量時，對宿主（人體）產生一種或多種經過論證的功能性健康益處的活微生物。乳酸菌是益生菌的一種，除了能改善胃腸道功能[1]外，還具有提高免疫力[2]、抗菌[3]、降膽固醇[4]、預防糖尿病[5]等功能。目前工業上的益生菌功能食品主要是乳制品，但其保質期有限，也不適合乳糖不耐癥和乳制品過敏消費者[6]，這促使研究者不斷開發新型益生菌產品，如含益生菌香腸[7]益生菌發酵果蔬汁[8]和富益生菌鮮切果蔬[9]、果蔬脆[10]等。Lapsley等[11]發現，當果蔬組織的間隙在21～35 nm之間時，可以將益生菌固定于果蔬細胞間隙中。胡蘿卜營養豐富，價格低、產量大、耐儲存，具有明目、護心、養顏、防癌等功能[12]，細胞體積為0.8×105～4.0×105μm3[13]，推測細胞間隙約為1～10 μm，是富集益生菌的理想原料。

在自然狀態下，溶液中的離子或活性物質很難富集到食品內部，且耗時較長。為了縮短生產周期，提高效率，研究者不斷嘗試新的手段來加速富集過程，其中應用較廣的為真空浸漬和超聲浸漬。真空浸漬是以一種可控方式使懸浮物質直接進入到產品的多孔結構中，通過真空可以將食品細胞間隙中的氣體和液體抽去，從而使其他物質如微生物、礦物質或其他生物活性物質進入到食品組織內[14]；超聲浸漬[15]則是利用超聲波的空穴作用擊穿食品內細胞的細胞膜，從而使外部物質浸入到食品內部。本研究以胡蘿卜片為富集益生菌的載體，分別采用真空浸漬及超聲浸漬進行菌富集處理，以活菌數為指標在單因素試驗的基礎上通過正交試驗設計優化富集工藝，再以常壓浸漬為對照，比較較優條件下真空浸漬和超聲浸漬的富集效果，獲得適宜的益生菌富集方式，以期為胡蘿卜片富集益生菌提供更優的條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胡蘿卜購于南京孝陵衛菜市場；蔗糖購于南京蘇果超市；植物乳桿菌SICC 1.376購于四川省工業微生物菌種保藏管理中心，經本實驗室檢測其具有抗氧化及耐酸耐膽鹽等益生功能。

MRS肉湯培養基 北京陸橋技術有限公司；瓊脂南京奧多福尼生物科技有限公司；氯化鈉 西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；超聲波清洗機 昆山禾創超聲儀器有限公司；SW-CJ-2D型凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械制造有限公司；BS224S電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；恒溫恒濕箱 上海新苗醫療器械制造有限公司；TG16-WS臺式高速離心機 湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司；HyG-A全溫搖瓶柜 太倉實驗設備廠；LGJ-12冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司；EVO-LS10掃描電子顯微鏡 德國蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 浸漬液制備

將4 ℃保藏的菌種活化2～3 代→轉接于裝有MRS液體培養基的三角瓶中→37 ℃擴大培養12 h→離心（4 800 r/min，10 min）→用10%蔗糖溶液稀釋沉淀菌種制成浸漬液，備用。

1.3.2 植物乳桿菌的富集工藝

工藝流程：挑選材料→清洗→瀝干→去皮→切片→燙漂→浸漬→瀝干→干燥→包裝。

操作要點：1）挑選材料：選取新鮮無機械損傷的胡蘿卜；2）切片：將清洗去皮后的胡蘿卜切成3～4 mm厚的薄片；3）燙漂：將胡蘿卜片放入沸水中燙漂90 s，快速取出放入冷水中冷卻；4）浸漬：真空浸漬和超聲浸漬均是將胡蘿卜片置于裝有浸漬液的容器內，料液比為1∶2，保持液面沒過胡蘿卜片，分別進行浸漬富集處理。1.3.3 單因素試驗設計

1.3.3.1 真空浸漬單因素試驗設計

真空浸漬溫度：真空浸漬時間15 min，復壓浸漬時間10 min，保持真空壓力0.09 MPa浸漬過程中的溫度分別為25、30、35、40、45 ℃時，測定胡蘿卜片中活菌數。真空浸漬時間：真空浸漬溫度30 ℃，復壓浸漬時間10 min，保持真空壓力0.09 MPa抽真空時間分別為5、10、15、20、25 min時，測定胡蘿卜片中活菌數。復壓浸漬時間：真空浸漬時間15 min，真空浸漬溫度30 ℃，抽真空結束，在常壓下的浸漬時間分別為5、10、15、20、25 min時，測定胡蘿卜片中活菌數。

1.3.3.2 超聲浸漬單因素試驗設計

超聲浸漬溫度：超聲浸漬功率150 W，超聲浸漬時間9 min，測定在超聲浸漬溫度25、30、35、40、45 ℃條件下胡蘿卜片中活菌數。超聲浸漬功率：超聲浸漬時間9 min，超聲浸漬溫度30 ℃，測定在超聲浸漬功率100、125、150、175、200 W條件下胡蘿卜片中活菌數。超聲浸漬時間：超聲浸漬功率150 W，超聲浸漬溫度30 ℃，測定在超聲浸漬時間3、6、9、12、15 min條件下胡蘿卜片中活菌數。

1.3.4 正交試驗設計

以單因素試驗結果為依據，真空浸漬中以真空浸漬溫度、真空浸漬時間、復壓浸漬時間為試驗因素，以活菌數為指標進行正交試驗設計見表1；超聲浸漬中以超聲浸漬溫度、超聲浸漬功率、超聲浸漬時間為試驗因素，以活菌數為指標進行正交試驗設計見表2。

表1 真空浸漬正交試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels used for orthogonal array design for optimization of vacuum impregnation parameters

1.3.5 常壓浸漬

在常壓環境40 ℃條件下，將胡蘿卜片浸漬于浸漬液中1.5 h。

1.3.6 乳酸菌數測定

參照GB 4789.35—2010《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》方法[16]，將富集了益生菌的胡蘿卜樣品經真空冷凍干燥后打粉測定，活菌數單位為CFU/g干樣。

1.3.7 植物乳桿菌附著情況的觀察

采用掃描電子顯微鏡觀察植物乳桿菌在胡蘿卜表面和內部的附著情況[17]。

1.4 數據統計分析

用Microsoft Excel 2003進行數據整理，用Origin 8.6進行作圖分析，采用SAS V8統計進行方差分析，并應用鄧肯多重比較方法進行樣品間的顯著性差異分析。P＜0.05表示存在顯著差異。每次實驗做3次重復，取平均值，并計算標準偏差。

2 結果與分析

2.1 真空浸漬單因素試驗結果

2.1.1 真空浸漬溫度對胡蘿卜中活菌數的影響

圖1 真空浸漬溫度對胡蘿卜中活菌數的影響Fig. 1 Effect of vacuum impregnation temperature on the number of viable bacteria in carrot

真空浸漬技術是基于某些食品多孔結構能夠在抽真空后被浸漬液占據的原理。影響真空浸漬效果的因素主要有注入浸漬液體積、物料浸漬體積變形率和有效空隙率。真空浸漬時間、壓力、浸漬液組成成分、浸漬溫度、浸漬液濃度等通過影響上述3 種參數，影響真空浸漬效果[18]。以浸漬后胡蘿卜片中活菌數為指標，考察浸漬溫度對浸漬效果的影響。如圖1所示，隨著溫度從25 ℃升高到45 ℃，活菌數隨呈現先增加后減少的趨勢，35 ℃為拐點，活菌數為2.45×1010CFU/g。在25～35 ℃內，菌數隨溫度升高而增加，可能原因是溫度升高致使液體黏度下降[19]，流動性增加，有利于含菌體的浸漬液滲入胡蘿卜的組織間隙內，從而使浸漬液體積升高，進而提高浸漬效率。也可能由于溫度升高促使胡蘿卜軟化，細胞孔隙增大，引起物料浸漬體積變形率和有效空隙率升高，提高了浸漬效率。在40～45 ℃時，觀察到菌數下降可能是由于溫度超出菌體的最適溫度，引起蛋白質、DNA等生物大分子熱變性，導致菌體失活，菌數下降[20]。故確定浸漬溫度為35 ℃。

2.1.2 真空浸漬時間對胡蘿卜中活菌數的影響

圖2 真空浸漬時間對胡蘿卜中活菌數的影響Fig. 2 Effect of vacuum impregnation time on the number of viable bacteria in carrot

如圖2所示，植物乳桿菌數隨抽真空時間的延長呈現先增加后穩定的趨勢。抽真空可以將胡蘿卜組織中的氣體和占據組織間隙的汁液排出，當瞬時恢復大氣壓時菌液趁勢吸入，進入到胡蘿卜組織間隙中。真空浸漬的效率主要由浸漬液占據物料多孔間隙的效率決定。研究發現，浸漬時間顯著影響物料中注入浸漬液體積和有效孔隙率[21-24]。結果顯示，在抽真空5～15 min內，胡蘿卜中活菌數隨著抽真空時間延長而變大，但在15 min后活菌數并未繼續增加而是略有下降。這與Krasaekoopt等[22]的研究結果相似，其在番石榴的真空浸漬益生菌過程中發現，隨著抽真空時間5～15 min變化，浸漬液體積、有效孔隙率和活菌數均呈現先上升后下降的趨勢。可能原因為，在抽真空初期，胡蘿卜孔隙隨著抽真空時間延長而變大，導致被排出的氣體和汁液也增加，因此在恢復大氣壓時，被吸入浸漬液增加從而的檢測到胡蘿卜中活菌數增加。當達到臨界點時，胡蘿卜組織發生部分變形，無法繼續包持浸漬液，從而出現略下降的趨勢。

2.1.3 復壓浸漬時間對胡蘿卜中活菌數的影響

根據Fito[25]的理論，真空浸漬技術利用了由壓差引起的水動力學機理和變松弛現象。水動力學機理是指由于食品細胞內的液體在真空、低溫環境下容易汽化蒸發，會在物料內部形成了一些泡孔結構，在壓力差和毛細管效應的共同作用下，浸漬液更容易滲入物料結構內部。同時，被浸漬的物料整體在真空條件下會產生一定的膨脹，導致細胞之間的間距增大，這被稱作變形松弛現象，它也有利于浸漬液更快滲入到物料的內部。最終在水動力學和物料變形松弛現象的共同作用下，完成浸漬過程。真空浸漬分為2 個階段，真空階段和復壓階段。在真空階段，食品組織內部的空氣在水動力學機理和變松弛現象作用下膨脹并部分流出。在復壓階段，食品組織內部剩余的空氣被壓縮，浸漬液在外壓作用下擠入物料孔隙中。同時，細胞之間的間隙雖然所占體積不多，但也可以容納浸漬液。所以復壓時間的研究非常重要，對浸漬效率有顯著影響。

圖3 復壓浸漬時間對胡蘿卜中活菌數的影響Fig. 3 Effect of restoration time on the number of viable bacteria in carrot

如圖3所示，在5～10 min內，活菌數快速增加。在10～25 min內，活菌數保持相對穩定。此結果與Hironaka等[26]的研究一致，其在土豆中浸漬鐵元素實驗中發現，在0～3 h內土豆中的鐵元素含量逐漸升高，在3～4 h達到穩定。此文獻中浸漬時間較長主要是由于對整個土豆進行浸漬，其周皮組織不利于水和空氣的滲透。Mujica-Paz等[27]采用13.5～67.4 kPa真空壓力10 min，復壓10 min，將蔗糖溶解浸漬入芒果、蘋果和甜瓜切片中。Gras等[28]采用5 kPa真空壓力10 min，復壓10 min，將蔗糖和乳酸鈣的等滲溶液浸漬入茄子、胡蘿卜和平菇切片中。綜上，確定復壓浸漬時間為15 min。

2.2 真空浸漬參數正交試驗結果

2.2.1 真空浸漬正交試驗設計及結果

由表3可知，真空浸漬較優工藝參數為A2B2C3，即當真空浸漬溫度35 ℃、真空浸漬時間15 min、復壓浸漬時間20 min時真空浸漬的胡蘿卜片中富集的植物乳桿菌最多。由表4可知，各因素對活菌數影響主次為真空浸漬溫度＞真空浸漬時間＞復壓浸漬時間。

表3 真空浸漬正交試驗設計及試驗結果Table 3 Orthogonal array design with experimental results for optimization of vacuum impregnation parameters

表4 真空浸漬正交試驗設計方差分析Table 4 Analysis of variance of the orthogonal array design for optimization of vacuum impregnation parameters

2.2.2 驗證實驗

對正交試驗優選出的真空浸漬最佳工藝參數進行驗證實驗，按照最佳工藝條件操作的胡蘿卜片中的活菌數為10.16（lg（CFU/g）），高于表3中每一項試驗結果，驗證了所選取工藝條件的合理性。

2.3 超聲浸漬單因素試驗結果

2.3.1 超聲浸漬溫度對胡蘿卜中活菌數的影響

圖4 超聲浸漬溫度對胡蘿卜中活菌數的影響Fig. 4 Effect of ultrasonic impregnation temperature on the number of viable bacteria in carrot

如圖4所示，在一定范圍內，隨著超聲浸漬溫度的升高，液體分子運動加快造成浸漬液黏度變小，有利于植物乳桿菌進入到胡蘿卜組織內部，溫度繼續升高，黏度趨于穩定，滲入的植物乳桿菌數也趨于穩定。溫度為25 ℃時，富集的活菌數遠低于其他溫度，當浸漬溫度為30 ℃時，胡蘿卜中的活菌數已達到最多，比真空浸漬的最適溫度35 ℃低，這可能是因為在超聲時部分質點物質吸收超聲波，使超聲波的動能轉化為熱能，從而導致浸漬液的溫度升高[26]。因此確定浸漬溫度為30 ℃。

2.3.2 超聲浸漬功率對胡蘿卜中活菌數的影響

圖5 超聲浸漬功率對胡蘿卜中活菌數的影響Fig. 5 Effect of ultrasonic power on the number of viable bacteria in carrot

如圖5所示，超聲浸漬功率對植物乳桿菌富集效果有明顯作用，在一定范圍內隨功率增大，胡蘿卜片富集的活菌數快速增多，但當功率在150 W后，活菌數快速減少。這是因為胡蘿卜組織中的水分和微小氣泡使得超聲波的空穴作用極易產生，細胞膜結構受到破壞，細胞通透性增加[29-30]，加大傳質速率，導致菌富集效果明顯；另外隨著空穴的不斷形成及消失，形成的旋渦起到攪拌作用，也促進了菌的富集。但是隨著功率繼續增加，空穴作用加劇，溫度升高，導致菌體的細胞結構損傷，活菌數減少。故選擇超聲浸漬功率為150 W。

2.3.3 超聲浸漬時間對胡蘿卜中活菌數的影響

圖6 超聲浸漬時間對胡蘿卜中活菌數的影響Fig. 6 Effect of ultrasonic impregnation time on the number of viable bacteria in carrot

如圖6所示，活菌數隨著超聲浸漬時間的延長呈現先緩慢上升后快速下降的趨勢。在12 min前，超聲浸漬時間延長，活菌數也隨之增加，在經過一段時間的超聲后，胡蘿卜內外環境之間的物質交換會達到平衡，使得植物乳桿菌數不再增加，保持在一定范圍內。但是超聲超過12 min時活菌數明顯下降，這可能是因為長時間的超聲，破壞了植物乳桿菌的結構，增加菌體死亡數量。因此確定浸漬時間為12 min。

2.4 超聲浸漬參數正交試驗結果

2.4.1 超聲浸漬正交試驗設計結果

由表5可知，超聲浸漬較優工藝參數為A1B1C3，即超聲浸漬溫度30 ℃、超聲浸漬功率125 W、超聲浸漬時間12 min時，通過超聲浸漬胡蘿卜片富集的活菌數最多。由表6可知，各因素的影響主次為超聲浸漬時間＞超聲浸漬溫度＞超聲浸漬功率。

表5 超聲浸漬正交試驗設計和試驗結果Table 5 Orthogonal array design with experimental results for optimization of ultrasonic impregnation parameters

表6 超聲浸漬正交試驗設計方差分析Table 6 Analysis of variance of the orthogonal array design for optimization of ultrasonic impregnation parameters

2.4.2 驗證實驗

對正交試驗優選出的超聲浸漬最佳工藝參數進行驗證實驗，按照最佳工藝條件操作的胡蘿卜片中的活菌數為9.93（lg（CFU/g）），高于表5中每一項試驗結果，驗證了所選取工藝條件的合理性。

2.5 3 種富集方式比較

2.5.1 不同富集方式下胡蘿卜片中活菌數

圖7 不同富集方式下胡蘿卜中活菌數Fig. 7 Effect of impregnation methods on the number of viable bacteria in carrot

在較優工藝條件下真空浸漬、超聲浸漬以及常壓浸漬胡蘿卜片中的活菌數如圖7所示，通過真空浸漬富集的活菌數明顯多于其他兩種富集方式，達到1.2×1010CFU/g，而超聲浸漬和常壓浸漬富集的活菌數相當，沒有明顯差異（P＞0.05）。

2.5.2 不同富集方式下胡蘿卜片中菌的附著情況

經真空浸漬、超聲浸漬以及常壓浸漬的富植物乳桿菌胡蘿卜脆片表面和內部結構，見圖8和圖9。3 種浸漬方式制備的富植物乳桿菌胡蘿卜表面均附著大量菌體。然而，在富植物乳桿菌胡蘿卜組織內部只有真空浸漬組和超聲浸漬組有菌體存在，常壓浸漬組未發現菌體。說明通過這兩種富集方式植物乳桿菌可以滲入并定植到胡蘿卜組織內部而常壓浸漬只是將菌體固定于胡蘿卜組織表面。從植物乳桿菌在貯藏過程中的存活性角度，真空浸漬及超聲浸漬可將菌富集到組織內部對菌應該有包埋保護作用，所以這兩種富集方式優于常壓浸漬。

圖8 植物乳桿菌在胡蘿卜表面附著情況Fig. 8 Lactobacillus plantarum adhesion on the surface of carrot cells

圖9 植物乳桿菌在胡蘿卜組織內部附著情況Fig. 9 Lactobacillus plantarum adhesion inside carrot cells

3 結 論

真空浸漬的較優工藝為真空浸漬溫度35 ℃、真空浸漬時間15 min、復壓浸漬時間20 min；超聲浸漬較優工藝為超聲浸漬溫度30 ℃、超聲浸漬功率125 W、超聲浸漬時間12 min。以常壓浸漬為對照，比較優化后真空浸漬、超聲浸漬的植物乳桿菌富集效果可知，真空浸漬組活菌數最多，可達1.2×1010CFU/g。其他兩種浸漬方式下的活菌數也都在106CFU/g以上，達到乳制品功能食品中含菌數標準。掃描電子顯微鏡結果顯示，真空浸漬及超聲浸漬都可將菌體定植于胡蘿卜組織內部，而常壓浸漬未進入組織內部。綜合考慮，真空浸漬可作為較優的植物乳桿菌胡蘿卜片的富集方式。

本研究將植物乳桿菌以物理方式富集到果蔬中，形成富植物乳桿菌果蔬產品，其活菌數能夠保持106CFU/g以上，達到益生菌乳制品功能食品活菌數要求，此產品兼具果蔬和益生菌的優良品質，集營養保健于一體，可用于制備含益生菌鮮切果蔬、含益生菌果蔬脆片、含益生菌果蔬粉、益生菌的固定化載體等多種產品，具有廣闊市場前景。同時比較了3 種浸漬方式富集益生菌的適用性，為真空浸漬在果蔬中應用提供新的科學依據。

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Optimization of Processing Parameters for Probiotics Enrichment in Impregnated Carrot Slices

CUI Li1, NIU Liying1, HUANG Jiapeng1, LI Dajing1, ZHANG Zhongyuan1, LIU Chunju1, LIU Chunquan1, LIU Yingping2, XIAO Lixia2,*
(1. Institute of Farm Product Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 2. School of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China)

This research aimed to develop probiotic foods by fortifying probiotics in carrot using vacuum or ultrasonic impregnation. The vacuum and ultrasonic impregnation conditions were optimized by one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods. The results showed that the optimum parameters for vacuum impregnation were obtained as temperature 35 ℃, impregnation time 15 min and restoration time 20 min and the optimum parameters for ultrasonic impregnation were temperature 30 ℃, ultrasonic power 125 W and impregnation time 12 min. The two techniques were compared with atmospheric pressure impregnation in terms of viable bacterial count and the results showed that the number of viable bacteria enriched by vacuum impregnation was the highest, reaching 1010CFU/g. Scanning electron microscopy (SEM) confirmed the presence of rod-shaped bacteria being embedded in the intracellular space of vacuum and ultrasonic impregnated carrot samples, which were not observed within the tissue of samples impregnated at atmospheric pressure. However, there was a large quantity of bacteria observed on the surface of the samples impregnated under all three conditions. Vacuum impregnation can be considered a new approach for fortifying probiotics in carrot. The results of this research may provide new ideas for the development of functional probiotic foods.

probiotics; carrot slices; vacuum impregnation; ultrasonic impregnation

10.7506/spkx1002-6630-201716029

TS255.52

A

1002-6630（2017）16-0183-07

崔莉, 牛麗影, 黃家鵬, 等. 胡蘿卜片中富集植物乳桿菌的工藝優化[J]. 食品科學, 2017, 38(16): 183-189. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201716029. http://www.spkx.net.cn

CUI Li, NIU Liying, HUANG Jiapeng, et al. Optimization of processing parameters for probiotics enrichment in impregnated carrot slices[J]. Food Science, 2017, 38(16): 183-189. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201716029. http://www.spkx.net.cn

2017-01-12

江蘇省重點研發計劃（現代農業）重點項目（BE2016363）

崔莉（1978—），女，博士，研究方向為食品微生物與果蔬加工。E-mail：sunnycuili@gmail.com

*通信作者：肖麗霞（1966—），女，教授，博士，研究方向為農產品貯藏加工。E-mail：lxxiao@yzu.edu.cn