環糊精及肽配體介導的毒死蜱非競爭檢測模式

賀 江，崔京珍，王伯華，雷 頌，李 娜

環糊精及肽配體介導的毒死蜱非競爭檢測模式

賀 江，崔京珍，王伯華，雷 頌，李 娜

（湖南文理學院生命與環境科學學院，環洞庭湖水產健康養殖與加工湖南省重點實驗室，湖南省水產高效健康生產協同創新中心，湖南 常德 415000）

以毒死蜱作為對象，構建了一種由環糊精和肽配體介導的非競爭檢測模式。首先利用分子模擬和光譜學方法對β-環糊精包合毒死蜱的效應進行了證實；然后將β-環糊精與牛血清蛋白進行偶聯，并證實偶聯狀態的環糊精分子仍能包合毒死蜱；以β-環糊精-牛血清蛋白偶聯產物為核心材料，從商品化的噬菌體展示線性十二肽庫中篩選獲得了5 個可以特異識別環糊精-毒死蜱包合物的肽配體；最后，利用親和力最強的肽配體（8#克隆）構建毒死蜱的非競爭檢測模式，該檢測模式能夠特異性地識別毒死蜱，而對丙溴磷、除線磷和溴硫磷等結構類似農藥分子無識別。本研究所構建的檢測模式無需對小分子物質進行改造和固定，可為小分子化學污染物的快速檢測提供新的參考。

β-環糊精；肽配體；毒死蜱；噬菌體展示

在小分子化學污染物的快速檢測領域，當前的研究熱點是構建基于抗體等特異性親和材料的免疫檢測[1-2]或生物傳感器[3-4]，尤其是新型檢測模式的開發。然而，制備針對小分子化學污染物制備親和配體較為繁瑣，需要對靶標分子進行修飾后再固定在適宜的載體蛋白上；此外，小分子化學污染物結構簡單，表位單一，難以構建比競爭檢測模式更具優勢的非競爭檢測模式[5]。國內外學者在構建重金屬元素的免疫檢測技術時，一般是通過制備能夠特異識別金屬離子-乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）復合物的抗體來實現[6-9]。首先將EDTA偶聯在牛血清蛋白（bull serum albumin，BSA）等載體蛋白分子上，再利用固相的EDTA螯合靶標金屬離子，然后用BSA-EDTA-金屬離子復合物作為免疫原進行抗體制備。其優點在于，一旦合成了BSA-EDTA，則可用其螯合任意可被螯合的金屬離子，進而進行抗體制備和免疫檢測方法的構建。

環糊精是由6～8 個葡萄糖分子以糖苷鍵結合而成的閉環低聚物，呈外親水，內疏水的圓筒形立體結構，能以其內部空間包合脂溶性分子形成超分子復合物，而自身表現出良好的水溶性。鑒于其這一特性，環糊精已成為許多研究和應用領域的重要材料。許多學者已就環糊精在分析化學、生物醫學以及其他相關領域的應用進行了系統性的評述[10-12]。受金屬離子免疫檢測技術構建思路的啟發，結合環糊精外親水、內疏水的特性，本實驗提出一種用于小分子化學污染物免疫檢測技術構建的思路：1）將環糊精分子偶聯至BSA；2）用偶聯物包合疏水性的小分子化學污染物；3）制備能夠特異性識別包合物的親和材料；4）構建小分子化學污染物的新型非競爭檢測模式。

近年來，國內外學者利用噬菌體展示的多肽（肽配體）成功構建了多種食品安全檢測技術，說明噬菌體展示多肽可作為傳統抗體的有效替代物用于檢測技術的構建[13-18]。此外，多種不同展示結構的噬菌體多肽庫已經商品化，噬菌體展示肽篩選后易于測序和化學合成，而化學合成的多肽比原核表達的單鏈抗體更具穩定性，說明肽配體較傳統抗體更具優勢。毒死蜱是一種中等毒性的有機磷殺蟲劑，能較好地防治多種作物的地上和地下害蟲，成為取代高毒有機磷殺蟲劑的理想藥物之一。目前，毒死蜱農業生產中已有較為廣泛的使用，其殘留問題也日益受到關注。

本研究以β-環糊精和毒死蜱作為模式性材料，利用噬菌體展示技術從商品化的多肽庫中篩選出能夠特異識別β-環糊精-毒死蜱包合物的肽配體，并進一步構建毒死蜱的非競爭檢測模式。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

毒死蜱及丙溴磷、溴硫磷、除線磷等農藥標準品德國Dr. Ehrensorfer GmbH公司；β-環糊精、BSA、乙二醇二縮水甘油醚 美國Sigma公司；線性十二肽噬菌體展示庫（Ph.D.-12TMPeptide Library Kit） 英國New England Biolabs公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒 碧云天生物技術研究所；HRP標記的抗M13單克隆抗體 美國GE Healthcare公司；HRP標記的鏈霉親和素 美國Proteintech Group公司；多肽片段的合成與標記委托寧波康貝生物有限公司進行；其他相關試劑均為國產分析純；實驗用水由優普UPT-I-10T超純水機制備。實驗中用到的所有試劑均參照噬菌體抗體庫說明書進行配制。

1.2 儀器與設備

6 孔板、96 孔板 美國康寧公司；UV-160A紫外-可見分光光度計 日本島津公司；F-2700熒光分光光度計 日本日立公司；GC 450氣相色譜儀 美國瓦里安公司；MK3酶標儀 美國熱電公司。

1.3 方法

1.3.1 β-環糊精對毒死蜱包合特性的鑒定

先利用分子模擬方法對β-環糊精包合毒死蜱的過程進行計算，再利用光譜實驗研究對β-環糊精包合毒死蜱作用作進一步鑒定。分子模擬計算采用AutoDock 4.0軟件進行，具體操作參照文獻[19-22]。光譜學實驗分兩部分：1）將等體積的β-環糊精溶液（濃度為0、2.5、5.0 mmol/L）與毒死蜱甲醇溶液（0.05 mmol/L）混合，室溫平衡2 h，然后記錄各溶液200～400 nm范圍內的紫外吸收光譜；2）將等體積的β-環糊精溶液（濃度為2.5 mmol/L）或純水與毒死蜱甲醇溶液（0.3 μmol/L）混合，室溫平衡2 h，然后在激發光波長為290 nm條件下記錄各溶液350～500 nm波長范圍內的熒光光譜。

1.3.2 β-環糊精與BSA的偶聯與鑒定

參照文獻[23]，以乙二醇二縮水甘油醚為交聯劑將β-環糊精與BSA進行偶聯，偶聯效果通過SDS-PAGE進行鑒定，具體操作參照相關實驗手冊。設計吸附實驗，對β-環糊精-BSA偶聯產物上的環糊精分子包合毒死蜱的能力做進一步驗證，具體過程如下：將不同質量濃度的β-環糊精-BSA偶聯產物加入到6 孔板中，每孔2 mL，4 ℃包被過夜；次日，每孔加入2 mL質量濃度為0.5 mg/mL的BSA溶液，4 ℃封閉2 h；洗滌每個孔之后，每孔加入質量濃度為0.25 mg/mL的毒死蜱溶液，室溫振蕩孵育2 h后，將每孔中的溶液進行收集；同時再用洗滌緩沖液洗滌每個孔3 次，洗滌液與相應孔的溶液合并；采用液液萃取-氣相色譜法，測定孵育后每個孔中殘留的毒死蜱量（即合并液中的毒死蜱質量濃度）。

1.3.3 β-環糊精-毒死蜱復合物特異識別肽配體的篩選

采用正負交替篩選策略從噬菌體展示多肽庫中篩選出能夠特異結合β-環糊精-毒死蜱復合物的肽配體，以用于相應檢測模式的構建。1）包被：用碳酸鹽緩沖液配制質量濃度為0.5 mg/mL的β-環糊精-BSA偶聯產物溶液，在6 孔細胞培養板的兩孔中各加入1.5 mL該溶液，4 ℃包被過夜；次日，每孔加入2 mL封閉液，4 ℃封閉2 h。2）負篩選：將10 μL試劑盒所提供的噬菌體展示多肽庫與990 μL洗滌緩沖液（0.1% TBST）混合，并加入到上述兩孔中的其中一孔中（負篩選孔）；同時，將一定量的農藥與TBS溶液混合，并加入至另一孔中（正篩選孔）；兩孔同時在37 ℃、300 r/min條件下孵育2 h。3）正篩選：將正篩選孔中的樣液除去，再將負篩選孔中的樣液轉移至正篩選孔；繼續在37 ℃、300 r/min的條件下孵育一定時間后，除去樣液，并用TBST溶液洗滌正篩選孔若干次。4）洗脫：于正篩選孔中加入1 mL含1 mg/mL BSA的洗脫緩沖液；37 ℃、300 r/min的條件下孵育15 min后，將樣液轉移至150 μL中和緩沖液中。5）滴度測定與擴增：按試劑盒說明書所述方法對中和后的洗脫液進行噬菌體滴度測定；按試劑盒說明說所述方法對洗脫的噬菌體進行擴增和滴度測定，用于下一輪篩選。

實驗共進行4 輪篩選，每輪篩選的洗脫液經擴增后，用酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）對其進行活性測定。1）96 孔板的每孔中加入200 μL BSA-β-環糊精（1.0 mg/mL）溶液，4 ℃包被過夜；2）傾去包被液，每孔加入200 μL封閉液，4 ℃孵育2 h；3）洗板后，一半孔中加200 μL毒死蜱溶液（0.05 μmol/L）并標記為“+”孔，另一半孔直接加入200 μL TBS緩沖液并標記為“-”孔，整個板于37 ℃振蕩孵育2 h；4）洗板后，每孔加入1012PFU的噬菌體（來自于每輪洗脫液的擴增產物）并于37 ℃振蕩孵育1 h；5）洗板后，每孔加入200 μL HRP標記的抗M13抗體（1∶5 000稀釋）并于37 ℃振蕩孵育1 h；6）按照常規ELISA，用TMB體系進行后續的顯色、終止和讀數操作。

1.3.4 環糊精-毒死蜱復合物特異識別肽配體的鑒定

篩選結束后，從第4輪篩選產物中分離挑選出噬菌體單克隆，并利用ELISA方法鑒定出能夠特異識別β-環糊精與農藥分子復合物的克隆。ELISA鑒定步驟同1.3.3節，區別在于使用的噬菌體為單個噬菌體克隆的擴增產物。分析ELISA數據，定義在“+”孔和“-”孔中的OD450nm讀數比值大于2.1的噬菌體克隆為陽性克隆，即能夠特異識別環糊精-毒死蜱復合物。對鑒定出的陽性克隆，按試劑盒說明書所述的步驟進行測序，并由測得的DNA序列翻譯出氨基酸序列。

1.3.5 環糊精和肽配體介導的毒死蜱非競爭檢測模式構建

選擇活性最高的陽性克隆，對其展示的多肽片段進行化學合成并在其N-端做生物素標記，用于構建毒死蜱殘留檢測模式，檢測模式的基本原理如圖1所示。前3 步操作同ELISA鑒定的步驟1）～3）；然后每孔中加入200 μL不同濃度的毒死蜱溶液，37 ℃條件下振蕩孵育1 h后傾去溶液并洗滌酶標板；每孔再加入200 μL生物標記多肽溶液（0.1 μmol/L），37 ℃條件下再次振蕩孵育1 h后傾去多肽溶液并洗滌酶標板；每孔再加入200 μL HRP標記的鏈霉親和素（1∶5 000稀釋）溶液，37 ℃振蕩孵育1 h；最后按照常規ELISA，用TMB體系進行顯色、終止和讀數。

圖1 環糊精和肽配體介導的毒死蜱非競爭檢測模式基本原理Fig. 1 Schematic illustration of the general principle of cyclodextrin and peptide-assisted noncompetitive assay for chlorpyrifos

2 結果與分析

2.1 β-環糊精對毒死蜱包合特性的鑒定結果

基于AutoDocking軟件能量簇分析發現，毒死蜱能進入β-環糊精的空腔（圖2A），結合自由能ΔGFree為-4.80 kcal/mol（N=30）。光譜鑒定結果分別如圖2B、C所示，當固定客體毒死蜱濃度時，隨著β-環糊精濃度的增大，整個體系的吸收峰沒有明顯的位移，但其最大吸收峰處的吸光度逐漸增大（圖2B）；當毒死蜱體系中添加一定濃度的β-環糊精時，其熒光強度顯著的增大（圖2C）。上述結果說明毒死蜱能夠進入β-環糊精的空腔形成包合物。

2.2 β-環糊精與BSA的偶聯與鑒定

圖3 β-環糊精與BSA偶聯效果鑒定結果Fig. 3 Identification of BSA-β-CD conjugates

如圖3a所示，偶聯產物的分子質量明顯大于BSA，說明環糊精分子成功偶聯至BSA分子上，進一步估算表明，偶聯比約為5，即每個BSA分子上約偶聯有5 個環糊精分子。如圖3b所示，隨著微孔中β-環糊精-BSA包被濃度的增加，殘留的毒死蜱濃度減小，即被包合在環糊精空腔的毒死蜱量越多。該結果進一步說明β-環糊精-BSA偶聯成功，且偶聯產物上的環糊精分子依然保留對毒死蜱的包合能力。

2.3 β-環糊精-毒死蜱復合物特異識別肽配體的篩選

文獻資料[24-30]及前期實驗研究表明，靶標分子濃度、篩選結合時間、洗滌程序等對噬菌體展示篩選結果有顯著影響，本研究從第1輪到第4輪篩選，逐步降低毒死蜱的用量、減少正向篩選時間、洗滌強度逐漸增加，各輪的具體參數如表1所示。

表1 每輪篩選中正向結合與洗滌的具體參數Table 1 Positive binding time and washing steps in each round of biopanning

每輪篩選中，投入的噬菌體數量基本一致，均約為1011PFU；同時還測定了每輪洗脫液的噬菌體滴度，即洗脫產出的噬菌體數量，結果如圖4a所示。隨著篩選的進行，每輪篩選的噬菌體產出/投入比逐步增加，說明噬菌體展示庫在篩選中得到了有效的富集。每輪洗脫液經擴增后，采用ELISA對其進行活性測定，結果如圖4b所示。從第1輪到第4輪的洗脫產物，對毒死蜱-環糊精復合物的結合活性逐步增加，說明噬菌體庫的富集朝著預期目標進行。

圖4 噬菌體展示肽庫篩選效果Fig. 4 Efficiency of the biopanning process

2.4 環糊精-毒死蜱復合物特異識別肽配體的鑒定

圖5 環糊精-毒死蜱復合物特異識別肽配體的鑒定結果Fig. 5 Identification of phage-displayed peptide

ELISA鑒定結果顯示，共獲得5 個陽性克隆（圖5a），其中8#克隆的親和力最強，17#克隆的親和力相對最低。對5個陽性克隆的氨基酸序列進行分析表明，所有克隆均包合W(F)χχχH結構，其中χ代表任意氨基酸，因而可推測W(F)χχχH能夠形成與“環糊精-毒死蜱”復合物結合的框架結構，而其他氨基酸則主要影響結合活性（圖5b）。

2.5 環糊精和肽配體介導的毒死蜱非競爭檢測模式構建選擇親和力最強的8#克隆，構建了毒死蜱殘留檢測模式，在該檢測模式下，隨著毒死蜱濃度的增加檢測信號增強，即該模式屬于一種非競爭檢測模式。所建立的毒死蜱殘留檢測模式，能夠特異的檢測毒死蜱，而對丙溴磷、溴硫磷、除線磷3 種結構類似農藥無識別效應，說明該檢測模式具有較好的特異性（圖6）。

圖6 環糊精和肽配體介導的非競爭檢測模式對毒死蜱及3 種結構類似農藥的劑量-反應關系Fig. 6 Dose-dependent response curves of the cyclodextrin and peptideassisted noncompetitive assay

3 結 論

本研究采用計算機模擬和光譜學鑒定證實了β-環糊精對毒死蜱的包合作用，并成功合成了β-環糊精-BSA偶聯產物；在此基礎上，進一步利用噬菌體展示技術從商品化的線性十二肽庫中篩選獲得了5 條能夠特異識別環糊精-毒死蜱復合物的肽配體；利用親和力較高的肽配體（8#）成功構建了一種能夠對毒死蜱進行特異性檢測的非競爭模式。該研究能夠為食品及環境中小分子化學污染物的檢測提供新的思路。

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Cyclodextrin and Peptide Ligand-Assisted Noncompetitive Detection of Chlorpyrifos

HE Jiang, CUI Jingzhen, WANG Bohua, LEI Song, LI Na
(Key Laboratory of Health Aquaculture and Product Processing in Dongting Lake Area of Hunan Province, Collaborative Innovation Center for Efficient and Health Production of Fisheries in Hunan Province, College of Life and Environmental Sciences, Hunan University of Arts and Science, Changde 415000, China)

In this work, a cyclodextrin and peptide ligand-assisted noncompetitive detection model was developed using chlorpyrifos (CPF) as typical target. The possibility of CPF encapsulated by β-cyclodextrin (β-CD) was first confirmed through the use of molecular modeling and UV and fluorescence spectroscopy. Then, bovine serum albumin (BSA)-β-CD conjugate, which was still able to include CPF, was synthesized and five positive peptide ligands specifically bound to the CPF:β-CD inclusion complexes rather other β-CD were screened from a commercialized phage-display liner dodecapeptide library. At last, a noncompetitive detection model was developed using BSA-β-CD conjugate and the most active peptide (Clone 8). The developed detection model could specially detect CPF, but not profenofos, dichlofenthion, or bromophos without the need for the modification and immobilization of the target small molecules, thereby providing an alternative method for the rapid detection of small molecules.

β-cyclodextrin; peptide; chlorpyrifos; phage display

10.7506/spkx1002-6630-201716034

TS201.6

A

1002-6630（2017）16-0216-06

賀江, 崔京珍, 王伯華, 等. 環糊精及肽配體介導的毒死蜱非競爭檢測模式[J]. 食品科學, 2017, 38(16): 216-221. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716034. http://www.spkx.net.cn

HE Jiang, CUI Jingzhen, WANG Bohua, et al. Cyclodextrin and peptide ligand-assisted noncompetitive detection of chlorpyrifos[J]. Food Science, 2017, 38(16): 216-221. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716034. http://www.spkx.net.cn

2016-08-15

國家自然科學基金青年科學基金項目（31401583）；湖南省常德市聯合基金項目（2015JJ5008）

賀江（1983—），男，副教授，博士，研究方向為食品安全與食品生物技術。E-mail：hejiang1119@163.com