高通量微生物顯色法快速檢測動物源性食品中抗生素殘留

范 維，高曉月，李賀楠，李瑩瑩，郭文萍，陳淑敏*

高通量微生物顯色法快速檢測動物源性食品中抗生素殘留

范 維，高曉月，李賀楠，李瑩瑩，郭文萍，陳淑敏*

（中國肉類食品綜合研究中心，北京食品科學研究院，北京 100068）

建立一種采用高通量微生物顯色法對動物源性食品中抗生素殘留進行篩檢，再結合高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法對陽性樣品進行復測的分析檢驗方法。本方法利用嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus sterothermophilus）作為指示菌，制備96 微孔板，可同時對不同類別多種抗生素進行聯合檢測。結果表明：該微生物顯色法操作簡便、快捷，成本低，結果準確且易判斷，選取pH 7.4磷酸鹽緩沖液進行提取，以反應液150 μL、菌液50 μL（初始OD600nm為0.4左右）、樣品提取液100 μL作為檢測體系，檢測效果最佳，對動物源性食品中氨基糖苷類檢出限為60 μg/kg，β-內酰胺類檢出限為20～40 μg/kg，大環內酯類檢出限為60～80 μg/kg，四環素類檢出限為40～60 μg/kg，符合國內外對抗生素殘留限量的要求。對60 份動物源性樣品進行檢測，其結果與HPLC-MS/MS復測結果一致，說明該微生物法穩定性良好，可用于動物源性食品中抗生素殘留的初篩檢測。

高通量微生物顯色法；抗生素殘留；高效液相色譜-串聯質譜；動物源性食品

Abstract: A new rapid and high-throughput microbial chromogenic assay was developed to analyze antibiotic residues in animal-derived food samples. The positive samples were further confirmed by high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) method. Bacillus sterothermophilus was used as an indicator strain to produce a 96-well microplate for detecting a variety of antibiotics simultaneously. The results showed that the microbial assay was simple and cheap, and gave easy-to-interpret results. After extraction with phosphate buffer at pH 7.4, muscle samples were detected using a chromogenic assay system consisting of the reactant solution (150 μL), bacterial suspension (50 μL) with an initial optimal density (OD600nm) of around 0.4, and the sample extract (100 μL). The limits of detection (LODs) of aminoglycosides, beta-lactam, macrolide, and tetracyclines antibiotics were 60, 20–40, 60–80, and 40–60 μg/kg, respectively, which reached the requirements for the determination of antibiotic residue levels in the country and abroad. Consistent results were obtained in examining antibiotic residue in 60 animal-derived food samples using the microbial chromogenic assay and HPLC-MS/MS, indicating that the proposed assay could be used to detect antibiotic residues in animal-derived food samples with reliable results.
Key words: high-throughput microbial chromogenic assay; antibiotic residues; high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS); animal-derived food
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716038
中圖分類號：TS251.7 文獻標志碼：A 文章編號：1002-6630（2017）16-0239-06

抗生素在畜禽集約化生產中起著預防和治療疾病等作用，但濫用這些抗生素會使其通過動物體自身轉移、富集進入人類食物鏈，最終導致人體產生抗藥性，影響疾病治療與康復[1-4]。當前，我國抗生素濫用情況依然存在且形勢嚴峻[5]。2015年10月1日起施行的《食品安全法》中規定：食品安全監管環節，應采用國家規定的快速檢測方法對食品農產品進行抽查。這說明高通量、快速的檢測方法將成為未來檢測發展趨勢。目前，抗生素殘留檢測方法主要有色譜法[6]、微生物檢測法[7-8]和免疫分析法[9]等，其中色譜法較為常用，可以進行定性定量檢測，結果靈敏準確，但設備投入大，人員技能要求高，適合于大型綜合性實驗室進行仲裁判定和確證[10-11]；免疫分析法雖靈敏度高，但是檢測成本昂貴，只能檢測單一抗生素[12]，不易于推廣；相較于前兩種方法微生物法由于成本低廉、操作簡單、具有廣譜性，可作為一種高通量抗生素初篩方法應用在農產品安全監管環節，并在中小型企業得到普及。

目前，我國微生物顯色法多用于牛奶中抗生素殘留的檢測，用此法在禽畜肉中檢測抗生素殘留的研究較少。因此，本實驗開發出一種可檢測動物源性食品中抗生素殘留的高通量快速微生物顯色方法，可同時對常見的4大類抗生素進行聯合檢測，并可根據具體需要進行色譜法復測，使結果更加準確可靠。

1 材料與方法

1.1 材料與培養基

1.1.1 菌種與樣品

嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus sterothermophilus）（CICC 10392） 中國工業微生物菌種保藏管理中心；實驗采用的禽畜肉購自農貿批發市場。

1.1.2 試劑

氨基糖苷類：丁胺卡那霉素、雙氫鏈霉素；大環內酯類：紅霉素、羅紅霉素；四環素類：四環素、土霉素、金霉素；β-內酰胺類：阿莫西林、水合氨芐青霉素、青霉素G、乙氧萘青霉素和雙氯青霉素標準品德國Dr. Ehrenstorfer公司；蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、牛肉粉、葡萄糖、瓊脂、營養肉湯、營養瓊脂、溴甲酚紫 北京陸橋技術有限責任公司；其他試劑均為色譜純或分析純。

抗生素標準儲備液：將氨基糖苷類和β-內酰胺類各抗生素標準品分別用去離子水溶解并定容至100 μg/mL，-20 ℃避光可保存1 個月；將大環內酯類和四環素類各抗生素標品分別用甲醇溶解并定容至100 μg/mL，-18 ℃避光可保存12 個月以上。

磷酸鈉緩沖溶液：A液，稱取72 g Na2HPO4·12H2O，用去離子水定容至1 000 mL。B液，稱取31 g NaH2PO4·2H2O，用去離子水定容至1 000 mL。pH 6.8：A液49.5 mL和B液50.0 mL進行混合；pH 7.0：取A液61.0 mL和B液39.0 mL進行混合；pH 7.4：取A液81 mL和B液19 mL進行混合；pH 8.0：取A液94.7 mL和B液5.3 mL進行混合。

1.1.3 培養基

固體培養基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15.0 g溶于1 000 mL蒸餾水中，用NaOH溶液調pH 7.3，121 ℃高壓滅菌15 min。

液體培養基：胰蛋白胨10.0 g，葡萄糖2.0 g，牛心粉5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，用Na2HPO4·12H2O溶液調pH 7.4，121 ℃高壓滅菌15 min。

檢測液：蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏3.0 g，葡萄糖10.0 g，NaCl 5.0 g，溴甲酚紫指示劑0.04 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

SYNERGY H4酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；DHP-9272恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；UltiMate3000-TSQ QUANTUM ULTRA高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）聯用儀（配有電噴霧離子源） 美國Thermo公司；Series 1200-Technologies 6410 HPLC-MS/MS聯用儀（配有電噴霧離子源）、1260 HPLC儀（配有可變波長紫外檢測器） 美國安捷倫公司；SCR20BA離心機 日本日立儀器有限公司；PHS-3C pH計 上海雷韻儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

1.3.1.1 微生物顯色法

稱取4 份均質好的10 g鮮肉樣品置于50 mL離心管中，分別加入10 mL pH值為6.8、7.0、7.4、8.0的磷酸鈉緩沖溶液，旋渦1 min，密封置100 ℃沸水浴中加熱5 min，10 000 r/min離心3 min，取上清液用于微生物檢測。

1.3.1.2 色譜法

大環內酯類測定：樣品參照SN/T 1777.2—2007《動物源性食品中大環內酯類抗生素殘留測定方法》[13]進行前處理；四環素類測定：樣品參照GB/T 21317—2007《動物源性食品中四環素類獸藥殘留量檢測方法》[14]進行前處理；β-內酰胺類測定：樣品參照SN/T 2050—2008《進出口動物源食品中14 種β-內酰胺類抗生素殘留量檢測方法》[15]進行前處理；氨基糖苷類測定：樣品參照GB/T 21323—2007《動物組織中氨基糖苷類藥物殘留量的測定》[16]進行前處理。

1.3.2 微生物顯色法檢測

1.3.2.1 微生物初始濃度及檢測體系組成比例的確定

無菌狀態下，從固體培養基上挑取已培養24 h的細菌菌落，接入液體培養基中，分別配成光密度值（OD600nm）為0.1、0.4、0.6、0.8、1.0的菌懸液。取96 孔板，將各菌懸液分別加入到以下3 組體系中，檢測液體積、菌懸液體積、生理鹽水，A組體積分別為180、20、100 μL；B組體積分別為150、50、100 μL；C組體積分別為100、100、100 μL。于60 ℃恒溫箱中培養，確定各組變色（反應液由紫變黃）時間。將變色時間較短的組合中生理鹽水換成0.1 μg/mL羅紅霉素標準溶液，于60 ℃恒溫培養，觀察變色情況，選出結果呈陽性組（檢測液紫色為陽性，黃色為陰性），最終優化出最適微生物初始濃度和檢測體系組成比例。

1.3.2.2 微生物顯色法檢測程序

取96 孔板，按1.3.2.1節優化的比例，在第1列只加入檢測液，在2～12列加入檢測液和菌懸液，之后在第2列加入無抗生素的鮮肉提取液，在3～12列加入不同抗生素標準液或樣品提取液，于60 ℃恒溫培養至第2列變成黃色，觀察其他列顏色變化。

1.3.2.3 微生物顯色法檢出限的確定

用去離子水將12 種抗生素標準儲備液分別稀釋成0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 μg/mL共5 個梯度，以注射的方式加入到無抗生素鮮肉中，使其充分吸收。按上述微生物法進行檢測，確定各種抗生素的檢出限。

1.3.2.4 指示菌傳代穩定性的確定

將嗜熱脂肪芽孢桿菌連續傳代至第5代，用各代菌對雙氫鏈霉素、阿莫西林、羅紅霉素和四環素的檢出限進行測定，并確定反應時間，以此判斷指示菌的傳代穩定性。

1.3.3 色譜法檢測

大環內酯類，參照SN/T 1777.2—2007[13]方法，運用Series 1200-Technologies 6410型HPLC-MS/MS進行檢測；四環素類和氨基糖苷類，分別參照GB/T 21317—2007[14]和GB/T 21323—2007[16]方法，運用UltiMate3000-TSQ QUANTUM ULTRA HPLC-MS/MS進行檢測；β-內酰胺類，運用HPLC法進行測定，參照GB 29682—2013[17]和SN/T 2050—2008[16]方法。

1.3.4 色譜法標準曲線及檢出限的確定

用超純水將各類抗生素標準溶液逐級稀釋，對應1.3.3節色譜條件進行測定，以質量濃度（μg/L）為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，并以3 倍信噪比（RSN=3）確定其檢出限。

1.3.5 樣品測定

從不同市場分別購進鮮豬肉20 份、牛肉10 份、羊肉10 份、禽肉20 份，共計60 份，分別用序號1～60標識，用微生物法和色譜法同時對60 份樣品中這4 類、12 種抗生素進行測定。

2 結果與分析

2.1 微生物法提取緩沖液pH值的確定

本實驗所用指示劑為溴甲酚紫，其變色范圍是pH 6.8（紫色）～5.6（黃色），而市售鮮肉的pH值一般在6.6～5.8之間，肉汁本身酸堿性對檢測液變色效果影響較大。實驗選取不同pH值的磷酸鹽緩沖液對樣品進行前處理，結果見表1。從表1可以看出，當緩沖液pH值小于7.4時，鮮肉提取液加入到檢測體系中，會使檢測液瞬間變黃；緩沖液pH值較高時，則會延長反應時間。因此，選取pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液對樣品中的抗生素進行提取。

表1 不同pH值緩沖液對檢測效果的影響Table 1 Effect of different pH buffers on the detection

2.2 微生物初始濃度及檢測體系的確定

用生理鹽水作為樣品提取液按比例加入到檢測體系中，確定菌懸液濃度和檢測體系組成比例對反應時間的影響，結果如表2所示。當菌懸液初始吸光度不小于0.4時，B、C兩組反應時間較短，均能在4 h內變色，因此用這兩組進行抗生素敏感度實驗，結果如表3所示。

表2 菌懸液初始濃度及檢測體系組成比例對反應時間的影響Table 2 Effects of initial concentration of bacterial suspension and reaction mixture composition on response time min

表3 菌懸液初始濃度及檢測體系組成比例對抗生素敏感度的影響Table 3 Effects of initial concentration of bacterial suspension and reaction mixture composition on the sensitivity for antibiotics

從表3可以看出，菌懸液初始OD600nm較高或加入菌懸液體積較大時，抗生素對菌的抑制效果不明顯，反應液變為黃色，達不到檢測目的，因此選擇0.4作為菌懸液初始OD600nm，反應液150 μL、菌液50 μL、樣品提取液100 μL作為檢測體系。該法比傳統平板法省時省力，采用指示劑顯色作為判別標準也比抑菌圈更易于觀察，滿足快速檢測的要求。

2.3 微生物顯色法的檢出限檢測結果

表4 12 種抗生素的檢出限量Table 4 Limits of detection of 12 antibiotic μg/kg

按1.3.2.3節方法進行檢測，以顏色未發生變化的標準液濃度為該抗生素的最小檢測濃度，結果見表4。本方法各類抗生素的檢出限均小于我國農業部規定的動物性食品中獸藥最高殘留限量[18]，雖然檢出的陰性樣品中可能含有抗生素，但其含量低于最高殘留限量，依然是合格產品，說明該法可以滿足初篩檢測的要求。其中對β-內酰胺類和四環素類抗生素較為敏感，檢出限為20～40、40～60 μg/kg，這與劉冬梅等[19]研究的對牛奶中抗生素殘留檢測結果相似。

2.4 指示菌傳代穩定性

表5 指示菌傳代穩定性Table 5 Genetic stability of indicator bacterium during passage

分別用5 代嗜熱脂肪芽孢桿菌進行各類抗生素檢出限和反應時間的測定，結果如表5所示。對于同一種抗生素，各代菌測定的檢出限相同，說明前5 代菌對抗生素的敏感程度一致。從反應時間來看，第1代菌所需反應時間略長，后幾代菌的反應時間趨于穩定，5 代菌均能在3～4 h內使指示劑變色。因此，前5 代菌具有較好的穩定性，均可以用于微生物顯色法檢測。

2.5 色譜法的檢出限檢測結果

將不同質量濃度的抗生素標準溶液分別在1.3.1.2節色譜條件下進行測定，12 種抗生素的質量濃度在50～200 μg/L的范圍內，與其峰面積呈良好線性關系（R2＞0.991），滿足定量要求，其標準品色譜圖見圖1，檢出限結果如表4所示。色譜法靈敏度較高，其檢出限遠小于國家規定的抗生素最大殘留限量，這就導致一些含有極少抗生素的合格樣品被檢測出來，造成時間和成本的浪費。相較于色譜法，微生物顯色法的檢出限更接近最大殘留限量，因此用微生物法初篩呈陽性的樣品更有可能是不合格樣品，之后將這些陽性樣品用色譜法進行復測，可以節約時間和成本。并且有時企業并不需要太精準的數值，只想知道購入的原料肉中抗生素殘留是否合格，因此太靈敏的檢測過于浪費。

圖1 12 種抗生素色譜圖Fig. 1 Chromatograms of 12 antibiotics

2.6 樣品測定結果

從不同市場共購得鮮肉樣品60 個，經過微生物法檢測，共有14 個樣品成陽性，見表6。將14個陽性樣品用色譜法進行復測，共有8 個樣品測出含有以上抗生素殘留，包括2 個含四環素樣品、1 個含金霉素樣品、2 個含土霉素樣品、1 個含紅霉素樣品、1 個含阿莫西林樣品、1 個含雙氫鏈霉素樣品，而其他6 個樣品沒有檢出這12 種抗生素，存在著含有其他抗生素殘留的可能。在微生物法下呈陰性的46 個樣品中，這12 種抗生素均未被檢出。由表6可知，2號、9號和15號樣品中四環素和金霉素殘留量分別為204、118、187 μg/kg，55號樣品中紅霉素殘留量為212 μg/kg，均超過我國農業部規定的抗生素殘留最大限量。目前養殖業使用的抗生素種類繁多，這使肉類產品中抗生素殘留的檢測變得很難。色譜法雖靈敏精確，但不同種類抗生素檢測前處理方法及檢測程序均不相同，很難做到高通量，且前處理方法復雜費時[20]；免疫法亦是如此，只能針對一種或幾種的抗生素，無法判別是否有其他抗生素殘留存在，而且試劑盒的價格較高[21]。而微生物法對于不同種類抗生素的前處理方式和檢測方法均相同，且操作簡單，據研究[22-23]嗜熱脂肪芽孢桿菌除對以上4 類抗生素敏感外，對磺胺類、酰胺醇類及糖肽類藥物也有較高的敏感性，可真正做到高通量檢測。

表6 微生物法與色譜法樣品檢測結果Table 6 Results obtained from the detection of antibiotics by microbial microbial chromogenic assay and HPLC-MS/MS

3 結 論

本研究選用的嗜熱脂肪芽孢桿菌具有較高廣譜性，不僅對多類抗生素敏感，且產酸迅速，是一種理想的高通量抗生素快速檢測菌[24-25]。菌種經24 h活化后，按本實驗優化的初始濃度及檢測體系進行實驗，可在3～4 h內使指示劑變色，且樣品前處理簡便，10 min內即可完成，較傳統平板法省時省力[26]。研究所用指示劑為溴甲酚紫，顏色變化明顯，易用肉眼區分[27-28]。當樣品中沒有抗生素殘留或殘留量低于檢出限時，嗜熱脂肪芽孢桿菌在60 ℃快速生長產酸，使檢測液pH值下降，指示劑由紫色變為黃色。反之，若抗生素殘留質量濃度高于檢出限，則會抑制檢測菌的生長，使得檢測液pH值基本不變，指試劑不會變色[29-30]。該方法采用96 微孔板，除去空白對照列，還有80多個孔可以用于樣品檢測，即便采用4 次重復，仍然可以同時對20 個樣品進行檢測，做到對不同樣品、不同抗生素的高通量檢測。

用色譜法對微生物法篩檢出的46 個陰性樣品進行檢測，12 種抗生素均未被檢出，說明本實驗建立的微生物顯色法結果可靠，沒有假陰性。因此可以采用微生物顯色法進行篩檢，再以色譜法對呈陽性的樣品進行檢測，以便減少工作量和提高檢測效率，這將在普通的檢測實驗室具有良好的應用前景。

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Rapid and High-Throughput Detection of Antibiotic Residues in Animal-Derived Food Samples by Microbial Chromotest

FAN Wei, GAO Xiaoyue, LI Henan, LI Yingying, GUO Wenping, CHEN Shumin*
(China Meat Research Center, Beijing Academy of Food Science, Beijing 100068, China)

范維, 高曉月, 李賀楠, 等. 高通量微生物顯色法快速檢測動物源性食品中抗生素殘留[J]. 食品科學, 2017, 38(16): 239-244. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716038. http://www.spkx.net.cn

FAN Wei, GAO Xiaoyue, LI Henan, et al. Rapid and high-throughput detection of antibiotic residues in animal-derived food samples by microbial chromotest[J]. Food Science, 2017, 38(16): 239-244. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201716038. http://www.spkx.net.cn

2016-09-13

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2014BAD04B05）

范維（1989—），女，助理工程師，碩士，研究方向為食品科學與工程。E-mail：fw837093515@163.com *通信作者：陳淑敏（1963—），女，高級工程師，本科，研究方向為食品安全。E-mail：13681032924@163.com