吡非尼酮對大鼠腎間質纖維化的防治作用研究*

徐建華，肖紅波，程玉花，王瑜，張桂玲，呂金雷，邵毅

（1.南昌大學第一附屬醫院 腎內科，江西 南昌 330006；2.北京大學深圳醫院 腎內科，廣東 深圳 518036；3.南昌大學第一附屬醫院 眼科，江西 南昌 330006）

吡非尼酮對大鼠腎間質纖維化的防治作用研究*

徐建華1，肖紅波2，程玉花1，王瑜1，張桂玲1，呂金雷1，邵毅3

（1.南昌大學第一附屬醫院 腎內科，江西 南昌 330006；2.北京大學深圳醫院 腎內科，廣東 深圳 518036；3.南昌大學第一附屬醫院 眼科，江西 南昌 330006）

目的 研究吡非尼酮（PFD）對大鼠腎間質纖維化的作用及其作用機制，為臨床使用吡非尼酮提供理論依據。方法 24只標準雄性SD大鼠，隨機分為3組：正常組（NC組）、模型組（M組）及吡非尼酮治療組（S組）。M組及S組行左側輸尿管結扎術，復制腎間質纖維化模型。S組予吡非尼酮250 mg/（kg·d）灌胃，NC組及M組大鼠予等量1%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃。分別于手術后第1、3、5、7天處死各組大鼠各2只，取梗阻側腎臟。HE染色觀察各組腎組織病理變化，實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測結締組織生長因子（CTGF）mRNA表達水平，Western blot檢測轉化生長因子-β（TGF-β）及α-平滑肌激動蛋白（α-SMA）的蛋白表達水平。結果 NC組未顯示腎纖維化，M組顯示大鼠腎間質纖維化及炎癥細胞浸潤。NC組TGF-β、α-SMA蛋白表達均較低，M組TGF-β、α-SMA蛋白及CTGF mRNA表達較NC組均升高，差異有統計學意義（P＜0.05），且隨著梗阻時間延長，各物質表達量增高，但第7天M組及S組上述物質表達量較第5天減少，且M組與S組之間表達差異無統計學意義（P＞0.05）；S組上述物質各時間點表達則較M組均減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 吡非尼酮可能通過抑制大鼠腎組織TGF-β和CTGF的表達進而減少成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，減少細胞外基質（ECM）的沉積，發揮抗腎纖維化作用。

吡非尼酮；單側輸尿管梗阻；腎間質纖維化；結締組織生長因子；轉化生長因子-β；α-平滑肌肌動蛋白

纖維化過程是組織損傷后的一種病理生理過程，是指由各種致病因子所致結締組織異常增生，如果損傷因素長期不能去除，纖維化的長期持續存在最終將導致器官的結構改變和功能減退。腎小管間質纖維化（tubulointerstitial fibrosis，TIF），是各種致病病因引起進行性腎損害的主要病理特征，是導致終末期腎病（end-stage renal disease，ESRD）的根本病理改變之一，是多種腎疾病發展至終末期腎衰竭的共同病理特征[1]，TIF的出現往往預示著預后不良，可以作為腎功能惡化的一個十分準確的預測指標，其程度與腎功能減退密切相關[2]。阻斷腎纖維化的形成及其發展，就能有效地阻止慢性腎病的進展及腎衰竭的發生。但是目前對纖維化疾病的治療僅限于非特異性抗炎藥物、免疫抑制劑及糖皮質激素等的應用，臨床上尚缺乏真正用于治療纖維化過程的有效藥物。吡非尼酮（Pirfenidone，PFD）是目前已經證實的少數可延緩甚至逆轉纖維化的藥物之一。已有實驗證實其能阻止甚至逆轉細胞外基質（extrac ellular matrix，ECM）的積聚，能夠有效地延緩肺纖維化、肝纖維化、青光眼術后濾過道瘢痕化等的進展[3-4]，但是關于其在腎間質纖維化中的作用報道甚少。本研究以單側輸尿管梗阻復制腎間質纖維化模型，探討其作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

實驗動物：24只標準雄性SD大鼠，體重150～180 g（購自南昌大學醫學院實驗動物科學部）。術前檢查均無全身病變。主要試劑：PDF（P2116；美國Sigma公司），1%羧甲基纖維素鈉溶液，小鼠抗大鼠α-SMA單克隆抗體（美國Abcam公司），轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）抗體（美國Abcam公司），辣根酶標記山羊抗小鼠IgG（北京中山金橋生物技術有限公司）。Trizol總RNA抽提試劑盒、逆轉錄試劑盒，實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒（北京全式金生物技術有限公司），qRT-PCR引物（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.2 動物模型的分組、復制及取材

1.2.1 模型的分組和復制 24只標準雄性SD大鼠，每籠6只，于標準實驗室環境常規喂養，適應性喂養1周后，隨機分為正常組（NC組，n=8），模型組（M組，n=8）及PFD治療組（S組，n=8）。M組及S組大鼠均在8%水合氯醛腹腔注射麻醉下接受手術，于左側腹部取一長約3 cm縱行切口，逐層分離，暴露腎臟及膀胱，沿著腎臟膀胱走向尋找輸尿管，分離并結扎左側輸尿管，關閉腹腔。各組大鼠正常飲食、進水。S組大鼠自手術當天起給予PFD 250 mg/（kg·d）灌胃，PFD溶于1%羧甲基纖維素鈉溶液。NC組及M組大鼠自手術當天起給予等量1%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃。分別于手術后第1、3、5及7天處死各組大鼠各2只。

1.2.2 取材 處死前稱大鼠體重，用8%水合氯醛腹腔注射麻醉，取左側腎臟，去除包膜和結締組織，洗凈，瀝干血跡，迅速置于液氮中過夜，次日轉移至-80℃冰箱保存，備HE染色、Western blot及qRT-PCR檢測用。所有實驗步驟通過動物倫理委員會同意。

1.3 腎組織病理形態學觀察

取出的腎組織經10%中性甲醛固定，常規包埋，按3μm的厚度行連續切片，行HE染色。

1.4 qRT-PCR檢測梗阻側腎組織中結締組織生長因子（CTGF）mRNA表達水平

分別取M組及S組大鼠腎組織100 mg，按總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒說明書分別提取各組總RNA及逆轉錄合成cDNA模板，取2μl cDNA用于qRT-PCR反應。qRT-PCR所用引物序列見表1，β-actin mRNA作為內參照。qRT-PCR反應條件：預變性94℃30 s，變性94℃5 s，退火60℃，40個循環，每次實驗設3復孔，獨立實驗重復3次。SDS軟件分析cDNA擴增的相對表達量，實時定量PCR儀（ABI7500）檢測出相對表達量RQ值（RQ值=2-Ct）用于統計學分析。

表1 β-actin及CTGF引物序列

1.5 Western blot檢測TGF-β和α-SMA蛋白的表達

取液氮保存的腎組織，使用RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，并用BCA法檢測蛋白濃度。取30μg蛋白樣品變性后經8%SDS-PAGE電泳3 h，200 mA轉膜90 min至NC膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別用鼠抗大鼠TGF-β單抗（1∶1 000）、鼠抗大鼠α-SMA多抗（1∶100）、鼠抗大鼠β-actin單抗（1∶2 500）4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記抗鼠IgG二抗（1∶1 000）室溫1 h，洗膜后ECL顯色成像。相同實驗條件重復3次。以β-actin為內參照，通過計算目標蛋白與β-actin蛋白的灰度比值進行半定量分析。

1.6 統計學方法

應用SPSS18.0統計軟件進行數據處理，計量數據用均數±標準差（±s）表示，多時間點比較采用重復測量設計的方差分析，同一時間點組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠實驗過程中生活狀態的比較

NC組大鼠反應靈敏、食欲佳、睡眠良好；手術后3 d，M組大鼠毛色開始逐漸變黃、色澤變黯淡、反應遲鈍、食量下降、體重增加慢、自覺活動減少，梗阻時間越長，表現越明顯；S組上述表現處于NC組及M組之間。

2.2 腎臟病理變化

HE染色顯示NC組大鼠腎小管間質無明顯纖維化，M組大鼠自第1天開始即有較為明顯的間質增生、纖維化、炎癥細胞浸潤等，提示本次實驗模型復制成功，可行后續實驗。S組腎間質纖維化和炎癥細胞浸潤較M組減少。見附圖。

2.3CTGF mRNA相對表達量

qRT-PCR結果顯示，行單側輸尿管結扎術后第1、3、5及7天，M組及S組大鼠CTGF mRNA表達采用重復測量設計的方差分析，結果：第1、3及5天CTGF mRNA表達量有差異（F=19.721，P=0.046），隨著梗阻時間越長，表達量越高，但第7天M組與S組表達量減少，且兩組之間表達差異無統計學意義（F=0.127，P=0.739）。見表2。

2.4 各組TGF-β及α-SMA蛋白表達水平

正常組大鼠腎臟中僅有少量TGF-β、α-SMA表達，單側輸尿管結扎術后，M組及S組大鼠TGF-β及α-SMA蛋白表達采用重復測量設計的方差分析，結果：①與NC組比較，TGF-β第1、3及5天表達有差別（F=35.341，P=0.025），α-SMA第1、3、5及7天表達有差別（F=34.357，P=0.026），梗阻時間越長，表達量越高；②S組與M組比較，TGF-β第1、3及5天表達量降低（F=8.742，P=0.039），α-SMA第1、3及5天表達量降低（F=8.233，P=0.042）；③第7天TGF-β及α-SMA S組與M組之間表達趨勢無差別（F= 1.157和2.749，P=0.343和0.173）。見表3。

表2 腎組織CTGF mRNA表達變化 （n=8，±s）

表2 腎組織CTGF mRNA表達變化 （n=8，±s）

注：1）與第1天M組比較，P＜0.05；2）與相同時間M組比較，P＜0.05

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附圖 各組腎組織病理變化 （HE，×200）

表3 各組腎組織TGF-β、α-SMA蛋白相對表達量 （n=8，±s）

表3 各組腎組織TGF-β、α-SMA蛋白相對表達量 （n=8，±s）

注：1）NC組比較，P＜0.05；2）與相同時間M組比較，P＜0.05

T G F -β α -S M A組別第7天N C組 1 . 0 0 0 ± 0 . 0 0 0 1 . 0 0 0 ± 0 . 0 0 0 1 . 0 0 0 ± 0 . 0 0 0 1 . 0 0 0 ± 0 . 0 0 0 1 . 0 0 0 ± 0 . 0 0 0 1 . 0 0 0 ± 0 . 0 0 0 1 . 0 0 0 ± 0 . 0 0 0 1 . 0 0 0 ± 0 . 0 0 0 M組 2 . 2 8 0 ± 0 . 4 5 21） 2 . 6 3 8 ± 0 . 4 7 01）2 . 9 2 8 ± 0 . 7 0 21）2 . 3 9 6 ± 0 . 5 4 31）2 . 2 1 3 ± 0 . 4 7 41）3 . 8 6 8 ± 1 . 1 4 51）5 . 8 3 1 ± 1 . 4 0 01）4 . 0 4 2 ± 1 . 1 4 31）S組 1 . 1 0 7 ± 0 . 5 2 92） 1 . 7 0 9 ± 0 . 2 6 41）2）1 . 5 5 0 ± 0 . 4 8 01）2）2 . 9 7 2 ± 0 . 7 5 21）1 . 3 0 9 ± 0 . 2 9 01）2）3 . 6 3 ± 1 . 0 2 31）2）3 . 1 1 8 ± 0 . 8 1 61）2）2 . 7 7 ± 0 . 6 7 81）第1天第3天第5天第7天第1天第3天第5天

3 討論

纖維化主要病理改變為器官組織內纖維結締組織增多，ECM沉積，實質細胞減少，持續進展可致器官結構破壞和功能減退，乃至衰竭，嚴重威脅人類健康和生命。任何引起ECM合成增加以及降解減少的因素都能夠導致ECM的沉積。腎小管間質纖維化是各種腎病進展至終末期的共同通路，也是判斷預后的關鍵指標，延緩腎間質纖維化的進展是治療各種腎疾病、改善預后的有效方法[5]。

腎間質纖維化的發生機制較為復雜，至今尚未明確，TGF-β是參與多種纖維化過程的中樞因子，能夠促進成纖維細胞的增殖和生長，增加膠原的合成以及減少ECM的降解。而CTGF是實現TGF-β主要纖維化效應的下游介質。ITO等[6]觀察到，腎間質纖維化病變區內CTGF mRNA表達和肌成纖維細胞同步增加。TGF-β可以通過多種途徑誘導CTGF的表達，實現其纖維化效應。FAN等[7]觀察到，TGF-β可刺激體外培養的人近曲小管上皮細胞發生表型轉化而轉變為肌成纖維細胞，并可以高表達CTCF并增加ECM的合成[8]。肌成纖維細胞是間質細胞外基質持續增加的主要來源細胞[9]，在TGF-β刺激下，體外培養的腎間質成纖維細胞可以高表達CTCF并增加ECM的合成。黃海長等[10]證明CTGF可直接誘導體外培養的腎間質成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞。肌成纖維細胞胞質內的α-SMA是其活躍的標志性抗原[11]，α-SMA能較好地反映腎間質纖維化程度，其數量與腎間質纖維化程度密切相關，可作為判斷預后的良好指標。張春等[12]研究提示，CTGF可能通過與胞膜上特定配體結合，啟動細胞內信號轉導，促進了α-SMA基因的轉錄，進而增加了α-SMA蛋白合成。

目前，對于器官纖維化，尚無效果特別肯定的藥物，主要仍是使用激素及免疫抑制劑，但其效果甚微，且副作用較大。PFD是一種新型抗纖維化藥物，屬于一種羥基吡啶，化學名為5-甲基-1苯基-2 [1H]-吡啶酮，分子量為185.2，具有廣譜的抗纖維化作用，其在多種器官纖維化中均被證實有良好的抗纖維化作用，IYER等[13]用博來霉素誘導的肺纖維化倉鼠證實PFD可以抑制纖維化肺組織的脯氨酸羥化酶的活性，減少羥脯氨酸的生成，抑制Ⅰ型、Ⅲ型膠原基因的轉錄，減少肺膠原的含量。GARCIA等[14]證實PFD可明顯抑制肝硬化大鼠的Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅳ型膠原mRNA的表達，血中羥脯氨酸水平下降，明顯改善肝纖維化，SHIMIZU等[15]通過切除大鼠5/6腎臟復制慢性腎衰竭模型，并飼喂PFD，可使殘余腎皮質中的Ⅰ型、Ⅳ型膠原mRNA和羥脯氨酸水平下降，與對照組相比，纖維化程度明顯減輕。PFD抗纖維化的主要機制被認為是[16]：①抑制TGF-β過度表達。TGF-β是參與多種纖維化過程的中樞因子，對炎癥具有放大作用，是單核巨噬細胞強有力的趨化劑，活化的巨噬細胞可以分泌TGF-β，TGF-β可以通過正反饋的形式誘導自身的合成和分泌，故TGF-β在整個纖維化的病理生理過程中保持高水平。研究證實PFD能夠減少肺、腎等器官成纖維細胞TGF-β表達，并與膠原合成和基質減少相關。②清除活性氧（ROS）。在纖維化發病過程中的早期炎癥階段，炎癥細胞產生的髓過氧化物酶、超氧化物歧化酶可以催化過氧化物形成ROS。ROS可引起脂質過氧化反應、放大炎癥反應，使體內蛋白及酶變性、DNA氧化損傷；此外，它還可以作為細胞內重要信使，活化多條信號通路，間接引起組織損傷。幾乎所有纖維化都與氧化應激有關。PFD可清除體內ROS，減輕纖維化程度。③抑制腫瘤壞死因子TNF-α的生成，減輕炎癥反應。TNF-α主要由活化的單核/巨噬細胞產生，是重要的炎癥因子，可以引起和加重炎癥反應，引起組織的損傷，啟動組織修復及纖維化過程。研究證實，吡非尼酮可以在翻譯水平上抑制巨噬細胞TNF-α的生成。

在相同梗阻時間下M組TGF-β、α-SMA的蛋白表達及CTGF mRNA表達均高于S組，但第7天M組及S組上述物質表達量較第5天減少，且M組與S組之間表達差異無統計學意義，提示PFD可能通過抑制CTGF的表達而減少以α-SMA為活化標志的腎間質肌成纖維細胞的數量和表達，減少細胞外基質的合成，從而延緩腎間質纖維化的進展，該治療在早期可顯著緩解腎組織纖維化，但梗阻時間越長，腎臟積水越明顯，腎實質破壞越明顯，藥物作用較前有所下降。

PFD作為一種新型的抗纖維化藥物，其對于纖維化疾病的預防和治療作用機制研究還不是十分透徹，與此同時，PFD與腎增生性疾病的研究目前尚處于初級階段，因此，進一步探究PFD在腎疾病的應用具有十分重要的意義。研究表明，PFD具有良好的穿透性，同時具有作用廣泛、副作用小的特點，這使得PFD能夠更好地應用于其他纖維增生性疾病，為臨床治療提供新的思路和希望，具有極大的應用前景。

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（張蕾 編輯）

Effect of Pirfenidone on renal interstitial fibrosis in rats*

Jian-hua Xu1,Hong-bo Xiao2,Yu-hua Cheng1,Yu Wang1, Gui-ling Zhang1,Jin-lei Lü1,Yi Shao3
(1.Department of Nephrology,the First Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang, Jiangxi 330006,China 2.Department of Nephrology,Shenzhen Hospital of Peking University, Shenzhen,Guangdong 518036,China;3.Department of Ophthalmology,the First Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang,Jiangxi 330006,China)

Objective To investigate the effect of Pirfenidone(PFD)on renal interstitial fibrosis in rat model of unilateral ureteral occlusion(UUO)and to reveal the anti-fibrosis mechanism of PFD.Methods Twenty-four standard male SD rats were randomly divided into three groups:normal control group(N),UUO model group(M)and Pirfenidone treated group(S).The rats of the M and S groups underwent left urethral ligation to make the renal interstitial fibrosis model.The S group was given PFD 250 mg/(kg·d)for gavage,meanwhile the N and M groups were given 1%sodium carboxymethyl cellulose solution for gavage.Two rats were sacrificed from each group on day 1,3,5 and 7 after UUO operation,the kidney of the obstructive side was taken for further research.In each group,pathological changes were observed by HE staining,qRT-PCR was applied to detect the mRNA expression of connective tissue growth factor(CTGF),Western bolt was applied to detect the protein expressions of TGF-β and α-SMA.Results There was obvious renal interstitial fibrosis in the M group.Compared with the N group,the expressions of TGF-β and α-SMA proteins and the mRNA expression of CTGF were significantly increased in the M group(P＜0.05).Compared with the M group,the expressions of above parameters in the S group were decreased significantly(P＜0.05).The level of TGF-β was positively correlated with the level of α-SMA (P＜0.05). Conclusions Pirfenidone has anti-fibrosis effect on rat UUO model by inhibiting renal TGF-β and CTGF expressions,which may control the fibroblast transformation and reduce the extracellular matrix deposition in the renal tissue.

Pirfenidonde;unilateral ureteral obsrtruction;renal interstitial fibrosis;connective tissue growth factor; tranforming growth factor beta

R-332

A

2016-12-15

國家自然科學基金（No：81400372，81660129）；全國臨床醫藥研究專項基金（No：L2012052）；廣東省自然科學基金（No：S2013040015040）；江西省自然科學基金青年基金（No：20132BAB215004,20114BAB215036）

呂金雷，E-mail：lvjinlei97@163.com，Tel：13064127385

徐健華現工作單位為江西省直醫療門診部，330046

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.19.001

1005-8982（2017）19-0001-06