IgA腎病大鼠腎組織中T細胞免疫球蛋白與黏蛋白域基因1的表達和意義*

王纓，胡貴榮，李弼民

（南昌大學第一附屬醫院 腎內科，江西 南昌 330006）

IgA腎病大鼠腎組織中T細胞免疫球蛋白與黏蛋白域基因1的表達和意義*

王纓，胡貴榮，李弼民

（南昌大學第一附屬醫院 腎內科，江西 南昌 330006）

目的 觀察IgA腎病（IgAN）大鼠腎組織中T細胞免疫球蛋白與黏蛋白域基因1（TIM-1）的表達，探討TIM-1在IgAN大鼠發病中的作用。方法 20只雄性SD大鼠隨機分成IgAN模型組和對照組，每組10只。在復制模型完成后處死大鼠，取腎臟，腎組織切片行PAS染色，免疫熒光觀察大鼠腎臟病理變化，并行免疫組織化學法檢測腎組織中TIM-1的表達，實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測TIM-1 mRNA的表達。結果 IgAN組TIM-1主要分布在腎小球和腎小管，表達量較對照組增加（P＜0.05）。IgAN組腎組織中TIM-1 mRNA表達量均較對照組升高。TIM-1 mRNA相對表達量和腎臟病理Katafuchi評分呈正相關，且差異具有統計學意義（P＜0.05）。結論 TIM-1可能參與了IgAN的發生發展。

腎小球腎炎；IgA；T細胞免疫球蛋白與黏蛋白域基因-1

IgA腎病（IgA Nephropathy，IgAN）是目前最常見的原發性腎小球疾病之一，目前國際上尚無廣泛被認同的IgAN發病機制，其中機體免疫功能障礙，多種細胞因子和炎癥介質分泌異常被認為是IgAN發病的重要因素。T細胞亞群分化異常在多種自身免疫疾病發病中漸被闡明證實，Th1/Th2失衡與IgAN相關性也已開始受到重視。T細胞免疫球蛋白與黏蛋白域（T-cell immunoglobulin domain and mucin domain，TIM）基因家族共同編碼具有多種生物活性的I型跨膜糖蛋白，廣泛表達并參與多種T細胞介導的各類免疫反應。其中，T細胞免疫球蛋白與黏蛋白域基因1（TIM-1）與其天然配體T細胞免疫球蛋白與黏蛋白域基因4（TIM-4）特異性結合共刺激T細胞增殖，調節Th1/Th2細胞的平衡[1]。綜上所述，Th1/Th2失衡參與IgAN發病，而TIM-1信號通路可調控多種T細胞亞群免疫功能，調節T細胞平衡，那么在腎臟組織中TIM-1的表達如何？本研究通過復制IgAN大鼠模型，觀察IgAN大鼠腎組織中TIM-1的表達，初步探討TIM-1在IgAN中的作用與機制。

1 材料與方法

1.1 動物

20只SPF級SD大鼠，均為雄性，體重180～200 g。購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。按標準飼養條件。

1.2 動物模型的復制及分組

20只大鼠按隨機數字表法分為正常對照組（n= 10）和模型組（n=10）。模型組：牛血清白蛋白（美國Sigma公司）按400 mg/kg隔日灌胃，至復制模型結束共9周；在第6周和第8周末通過尾靜脈注射脂多糖（美國Sigma公司），0.05 mg/（只·次）；每個周末通過皮下注射四氯化碳CCl4（美國Sigma公司），每只每次蓖麻油0.5 ml+CCl40.1 ml，共9周；在相同時間給予正常對照組等體積蒸餾水灌胃，同體積生理鹽水皮下注射及同等量的生理鹽水尾靜脈注射。

1.3 取材及標本處理

實驗第9周復制模型完成后，采用3%戊巴比妥麻醉大鼠迅速游離腎臟，放入10%中性甲醛固定后用石蠟進行包埋，留待行光鏡檢查及免疫組織化學檢查，另一部分放入-80℃保存備用。

1.4 免疫組織化學法檢測腎組織TIM-1的表達

采用SP法檢測TIM-1（英國Abcam公司），陽性組織呈棕色，半定量結果分析采用 Image pro-plus 6.0圖像采集軟件，每張切片隨機采集20個視野（10×物鏡），用Image pro-plus 6.0圖像分析軟件對每個視野進行分析，其陽性染色面積/視野總面積即為免疫組織化學陽性目標的強度。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測大鼠腎臟組織中TIM-1 mRNA表達

提取細胞總RNA，參照cDNA試劑盒（AE301-02，北京全式金生物技術有限公司）說明書合成cDNA。采用大連寶生物有限公司PCR反應試劑盒進行PCR擴增。反應條件為95℃5 s，60℃ 30 s，95℃ 15 s，60℃ 1 min，60℃ 15 s（退火溫度及循環周期依據引物和PCR產物而定）。所有引物序列均由Invitrogen公司合成。引物序列見表1。

1.6 統計學方法

應用SPSS 17.0統計軟件對實驗結果進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，IgAN模型組和正常對照組比較采用t檢驗，對IgAN模型組的TIM-1表達與臨床、病理資料進行Pearson相關性分析，P＜0.05時差異為差異有統計學意義。

表1qRT-PCR引物序列

2 結果

2.1 腎臟病理結果

光鏡組織學見正常對照組腎小球系膜細胞無明顯細胞增多，基質無明顯增生，毛細血管襻開放，腎小管未見明顯異常，腎間質未見明顯增生，無炎癥細胞浸潤；模型組在腎小球內可見明顯的系膜細胞增多，系膜基質中到重度增生，毛細血管管腔狹窄，腎間質內可見明顯的炎癥細胞浸潤，并可見腫脹變性的腎小管上皮細胞。免疫熒光：正常對照組未見IgA沉積，模型組可見團塊狀或顆粒狀綠色IgA熒光。見圖1。

2.2 兩組大鼠臨床指標比較

IgAN模型組大鼠24 h尿蛋白定量高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），IgAN模型組大鼠血清白蛋白較正常對照組則下降，差異有統計學意義（P＜0.05），兩組血肌酐相比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

圖1 兩組大鼠腎臟病理學改變

表2 兩組大鼠24 h尿蛋白定量、血清白蛋白及腎功能的比較 （±s）

表2 兩組大鼠24 h尿蛋白定量、血清白蛋白及腎功能的比較 （±s）

注：?與正常對照組同時期相比，P＜0.05

項目血肌酐/（μmol/L）正常對照組 39.254±8.433 IgAN模型組 42.32±8.670血清白蛋白/（g/L）4.321±0.498 36.217±0.783 8.744±1.942? 20.940±1.779?t值24 h尿蛋白定量/g-6.721 7.734 P值 0.003 0.004 0.951 -0.073

2.3 兩組大鼠腎臟病理損傷Katafuchi評分

每張HE染色切片取任意5個高倍鏡（×40）視野，每個視野取任意2個小球和2個小管，IgAN模型組和正常對照組的Katafuchi評分分別為（6.303± 1.949）和（1.301±0.823），差異有統計學意義（t= 9.682，P=0.000），IgAN模型組高于正常對照組。

2.4 兩組大鼠腎臟TIM-1的表達

正常對照組僅在腎小管上皮細胞中可見少量TIM-1陽性表達，而IgAN模型組陽性表達較正常對照組增多，廣泛分布在腎小球細胞核和腎小管上皮細胞核，見圖2；IgAN模型組和正常對照組的TIM-1定量積分分別為（7.519±1.580）和（1.036±0.824），差異有統計學意義（t=-11.551，P=0.000），IgAN模型組高于正常對照組。

2.5 兩組大鼠腎臟TIM-1 mRNA的表達

qRT-PCR檢測結果顯示，IgAN模型組和正常對照組的 TIM-1 mRNA的相對表達量分別為（2.033±0.784）和（0.830±0.209），差異有統計學意義（t=4.532，P=0.001），IgAN模型組高于正常對照組。

2.6 TIM-1表達與各個臨床及病理指標間的相關性分析

采用雙變量Pearson相關性分析法，可見IgAN模型組大鼠腎臟 TIM-1 mRNA相對表達量與TIM-1半定量積分呈正相關（r=0.481）（見圖3），分別分析IgAN模型組大鼠腎臟TIM-1 mRNA相對表達和24 h尿白蛋白定量、血清白蛋白變化、腎臟病理損傷Katafuchi評分及TIM-1半定量積分的相關性。結果見表3、圖3。在IgAN模型組中，TIM-1 mRNA相對表達量與24 h尿白蛋白的變化呈正相關，與血清白蛋白變化呈負相關，但差異無統計學意義（P＞0.05）；TIM-1 mRNA相對表達量和腎臟病理Katafuchi評分呈正相關（r=0.846），且差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 兩組大鼠腎臟TIM-1的表達

表3 TIM-1 mRNA與24 h尿白蛋白、血清白蛋白及腎臟病理損傷Katafuchi評分相關性分析

圖3 TIM-1 mRNA與24 h尿白蛋白、血清白蛋白及腎臟病理損傷Katafuchi評分相關性

3 討論

目前國際上尚無廣泛被認同的IgAN發病機制，其中機體免疫功能障礙，多種細胞因子和炎癥介質分泌異常被認為是IgAN發病重要因素。T細胞亞群分化異常在多種自身免疫疾病發病中漸被闡明證實，Th1/Th2失衡與IgAN相關性也已開始受到重視。早在上世紀90年代年ANDRE等[2]已經檢測到大部分IgAN患者腎小球系膜區均有IgAl分子高表達，而過量IgA1需要由成熟B細胞在Th2細胞或病毒抗原的刺激下才能生成。人們還發現自發性產生IgAN的ddY小鼠幼鼠為Thl優勢,但成年小鼠卻呈現Th2優勢、血清IgA水平升高，NOGAKI等[3]由此提出Thl/Th2失衡與IgA的分泌水平相關，Th2優勢時分泌過量IL-4、IL-6等細胞因子，IL-4和IL-6不僅正反饋Th2過度分化，還同時刺激B細胞活化、增殖，并增加抗體分泌，可能在促進IgAN的發病中占據重要地位。肖俊等[4]發現IgAN較正常人外周血中IFN-γ表達減少,而IL-4比例升高,Th1/Th2比值下降并與血IgA水平構成正比，證實了IgAN患者外周血中Th1/Th2失衡向Th2偏倚。近年來，參與自身免疫性疾病的發病的Treg/Th17細胞平衡在IgAN患者向Treg有所偏倚也漸受重視，LIN等[5]證實了其腎臟組織Foxp3表達上調、而致炎因子IL-17A的表達減少，盡管在血清中IL-17A表達有所升高。

21世紀初MCINTIRE等[6]在分析人類染色體5q23-35基因與哮喘的易感性時，在染色體5q33.2上識別出一個基因的主要序列編碼完全背離了控制氣道高反應性的TAPR調節器，且與人類甲肝病毒（HAV）受體同源，首次將其命名為TIM-1。TIM家族在小鼠有8個基因（TIM-1至TIM-8），其中TIM-5至TIM-8為有待證實序列的預測基因，在人類發現有 3個：TIM-1（Havcrl）、TIM-3（Havcr2）、TIM-4[7]。小鼠和人類 TIM基因編碼區分別位于染色體11b1.1和5q33.2上，這兩處染色體區在人類基因圖譜中被證實為與過敏性和自身免疫性疾病易感性相關，中國地區的兒童哮喘等的發病有可能也同TIM-1、TIM-3、TIM-4的基因多態性存在一定聯系[8]。T細胞免疫球蛋白和黏蛋白基因家族編碼的跨膜糖蛋白具有多種生物活性，各自表達于T淋巴細胞、APC等不同細胞表面，主要參與調節T輔助細胞介導的各種免疫反應，其中，TIM-1與其天然配體TIM-4特異性結合，共刺激T細胞增殖，可調節多種效應性T細胞的表達，影響Th1/Th2細胞的平衡[9]，而Th1/Th2失衡，Th0分化向Th2偏倚，在調節Th2反映中起重要作用。研究證實在Henoch-Schonlein purpura患者外周血單核細胞中Th2占優勢且TIM-1mRNA的表達上調，并與血清IgA1和IL-4分子水平呈正相關[9]。在有關哮喘小鼠模型中發現TIM-1介導免疫反應，當給予抗TIM-1抗體后可減少氣道黏液高分泌，且IL-4表達下調，說明TIM-1通過調節Th2細胞，參與了氣道高反應[10]。

1998年，ICHIMURA等[11]又將其命名為腎損傷分子1（kidney injury molecule-1，KIM-1），因在缺血再灌注大鼠模型中確定該分子的高度表達與腎小管損傷程度相關。KIM-1是人們發現的首個非骨髓源性清道夫受體，由腎小管上皮細胞表達，并參與腎小管中凋亡細胞的吞噬清除和誘導淋巴細胞浸潤。KIM-1在近膜端釋放出細胞外區并溶于尿液，由于在健康腎臟中幾乎不表達，尿液KIM-1聯合中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（NGAL）、IL-8、半胱氨酸酶抑制劑Cysc等的檢測等可以作為急性腎缺血性損傷、慢性腎臟病等各類腎損傷的診斷及預后標志。NOZAKI等[12]發現TIM-1增強新月體性腎小球腎炎T細胞免疫應答，并促進細胞介導的腎臟損害。在順鉑誘導的急性腎損傷模型中的研究發現，運用TIM-1抗體后腎臟NF-κB的表達及促炎因子、趨化因子的表達下降，而且腎臟的免疫炎癥反應也受到抑制[13]。人們在IgAN發病中對TIM-1的研究還比較少，本研究中觀察到IgAN大鼠腎臟TIM-1 mRNA的表達上調，與腎臟病理組織學損傷程度呈正相關,差異有統計學意義；同時觀察到IgAN大鼠腎臟TIM-1 mRNA的表達上調與24 h尿白蛋白定量呈正相關，與血清白蛋白呈負相關，但可能因為樣本量過小或檢驗方法的局限性，相關性分析結果差異無統計學意義，推測TIM-1可能一定程度參與大鼠IgAN的發病及進展。

Th1/Th2和Treg/Th17失衡均參與IgAN發病，而TIM-1信號通路可調控多種T細胞亞群免疫功能，調節T細胞平衡，究竟TIM-1在IgAN的免疫發病機制中如何發揮作用，是否通過調控Th1/Th2、 Treg/Th17參與IgAN發病？這將是下一步的研究方向。

[1]DEGAUQUE N,MARIAT C,KENNY J,et al.Regulation of T-cell immunity by T-cell immunoglobulin and mucin domain proteins[J].Transplantation,2007,84(Suppl 1):S12-16.

[2]ANDRE P M,LE POGAMP P,CHEVET D,et al.Impairment of jacalin binding to serum IgA in IgA nephropathy[J].J Clin Lab Anal,1990,4(2):115-119.

[3]NOGAKI F,MUSO E,KOBAYASHI I,et al.Interleukin 12 induces crescentic glomerular lesions in a high IgA strain of ddY mice,independently of changes in IgA deposition [J].Nephrol Dial Transplant,2000,15(8):1146-1154.

[4]肖俊,曹春瑜,周靜,等.IgAN患者外周血Th1、Th2、Th3細胞水平的變化及意義[J].實用臨床醫學,2012,13(12):28-31.

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（張西倩 編輯）

E xpression of TIM-1 in renal tissue of IgAN rats and significance*

Ying Wang,Gui-rong Hu,Bi-min Li
(Department of Nephrology,the Frist Affliated Hospital of Nanchang University, Nanchang,Jiangxi 330006,China)

Objective To investigate the expression of T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-1(TIM-1)in rats with IgA nephropathy(IgAN),and to explore the role of TIM-1 in the pathogenesis of IgAN.Methods Twenty male SD rats were randomized into two groups,i.e.IgAN model group(10 rats)and control group(10 rats). The rats were sacrificed after the completion of building the model and the kidneys were obtained.The pathological changes of the rat kidneys were observed after PAS and immunofluorescence staining.Immunohistochemical staining was used to detect the expression of TIM-1 protein and RT-PCR was used to measure the expression of TIM-1 mRNA in the renal tissue.Results TIM-1 expression in the IgAN group mainly distributed in glomeruli and renal tubules,the expression levels of TIM-1 mRNA and protein significantly increased in the IgAN group compared with those in the control group(P＜0.05).A positive correlation was found between the expression quantity of TIM-1 mRNA and Katafuchi score(r=0.846,P＜0.05).Conclusions TIM-1 may be involved in the occurrence and development of IgAN.

IgAN;T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-1(TIM-1);rat

R-332

A

2016-12-20

江西省自然科學基金（No：20142BAB205006）；江西省教育廳科學技術研究項目（No：14005）

李弼民，E-mail：lbmjx@163.com ·12·

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.19.003

1005-8982（2017）19-0012-05