過表達KLF4抑制非小細胞肺癌增殖及上皮間質轉化的作用機制*

劉華松，徐蘭蘭，張軍，郭家龍，林稱意，原野，曾敏，程棟梁

[1.湖北省十堰市太和醫院（湖北醫藥學院附屬醫院）胸心大血管外科，湖北 十堰 442099；2.湖北醫藥學院護理學院，湖北 十堰 442000]

過表達KLF4抑制非小細胞肺癌增殖及上皮間質轉化的作用機制*

劉華松1，徐蘭蘭2，張軍1，郭家龍1，林稱意1，原野1，曾敏1，程棟梁1

[1.湖北省十堰市太和醫院（湖北醫藥學院附屬醫院）胸心大血管外科，湖北 十堰 442099；2.湖北醫藥學院護理學院，湖北 十堰 442000]

目的 探究KLF4調控非小細胞肺癌（NSCLC）增殖及上皮間質轉化（EMT）發生的作用機制，為NSCLC的臨床研究提供理論依據。方法 收集臨床病理資料進行統計學分析，免疫組織化學檢測KLF4在癌旁及癌組織中的表達，細胞水平檢測KLF4在癌細胞和正常細胞中的表達差異，過表達KLF4檢測對肺癌細胞的增殖、侵襲、遷移及EMT相關標志物的影響。結果 KLF4在癌組織中的表達低于癌旁組織中的表達，并且與患者的臨床分期及遠處轉移密切相關，細胞水平檢測也得到了相同的結果，上調KLF4的表達抑制了細胞的增殖、侵襲及遷移，同時抑制EMT相關的間充質標志物的表達，促進上皮標志物的表達。結論 過表達KLF4能夠抑制NSCLC增殖及EMT的發生。

KLF4；非小細胞肺癌；增殖；上皮間質轉化

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發病率及癌癥致死率在所有腫瘤中均居第一位[1]。肺癌按病理類型主要包括小細胞肺癌（SCLC）和非小細胞肺癌（NSCLC），NSCLC占到80%以上。NSCLC患者中只有不到50%的能夠接受以手術為主的治療方案，絕大多數NSCLC患者確診時多已發展到中晚期，致使NSCLC患者的5年生存率只有15%左右，嚴重影響患者的治療及預后[2]。因此，尋找NSCLC早期診斷的特異性標志物顯得尤為重要。

Krüppel樣因子（krüppel-like factors，KLFs）家族是廣泛存在于人類組織中的鋅指型轉錄因子，主要參與到細胞的增殖、分化、周期、胚胎形成等多個生理活動過程中[3]。目前，KLF家族中研究最多的是KLF4基因，人類KLF4基因位于染色體9q31，其編碼的KLF4蛋白是能夠特異識別并結合DNA序列（5'-TGGGTGGGGC-3'）的轉錄因子。作為重要的核轉錄因子，KLF4蛋白即能通過調控下游靶基因表達發揮生物學功能，同時也能夠結合到自身啟動子上激活自身表達，因此，KLF4是一個雙向調節的轉錄因子[4]。針對KLF4與腫瘤的相關性研究發現，KLF4在不同的腫瘤中發揮著不同的作用。通過免疫組織化學和實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測等實驗驗證，發現其在白血病[5]、皮膚癌[6]、結腸癌、胃癌、食管癌、膀胱癌、肝癌及宮頸癌[7]等多個腫瘤組織中均低表達，然而在口腔上皮細胞鱗癌，乳腺癌[8]以及前列腺癌[9]中卻高表達。相關的臨床研究證實KLF4的表達異常與腫瘤患者的預后密切相關，成為判斷疾病預后的重要指標。CHALEB[10]等在研究中指出，雜合子缺失及啟動子甲基化導致的蛋白活性降低可能是KLF4在多個腫瘤組織中表達下調的重要機制。盡管KLF4與腫瘤發生發展的機制研究已取得了一定進展，但是有關KLF4與NSCLC關系的研究卻很少[11]。最新的研究表明，KLF4在NSCLC細胞系中均低表達，并且發現Numb-KLF4信號通路在調控NSCLC的侵襲轉移中發揮著重要的作用，然而，有關KLF4參與調控NSCLC的上皮間質轉化（EMT）的機制仍不清，因此，本研究主要探究KLF4調控非小細胞肺癌EMT的作用機制。

1 資料與方法

1.1 病例資料

隨機選取十堰市太和醫院胸心外科2012年9月-2015年9月收治的NSCLC病例100例。其中，男性63例，女性37例；年齡45～78歲，平均62歲；其中鱗癌56例，腺癌32例，其他12例。術后病理檢測均已證實，術前均未接受化療和放療，臨床病理資料完整，同時選取相對應的癌旁組織作為對照，本研究所收病例標本已獲本院倫理委員會的批準。

1.2 主要試劑

KLF4兔抗人多克隆抗體（免疫組織化學1∶200 Western blot 1∶500武漢三鷹生物技術有限公司），E-cadherin兔抗人多克隆抗體（1∶500武漢三鷹生物技術有限公司），N-cadherin兔抗人多克隆抗體（1∶1 000 abcam），α-catenin兔抗人多克隆抗體（1∶1 000 CST），vimentin兔抗人多克隆抗體（1∶500 abcam），GADPH兔抗人多克隆抗體（1∶1 500北京博奧森生物技術有限公司），山羊抗兔二抗（1∶5000-10000，武漢博士德生物工程有限公司），SP系列檢測試劑盒（中杉金橋生物技術有限公司）。

1.3 細胞培養與轉染

人NSCLC（A549，NCl-H460，NCl-H1299，95D）以及人胚胎肺成纖維細胞（WI-38）來源于中國典型培養物保藏中心，用含10%胎牛血清（excellbio南美）RPMI-1640培養基（Hyclone USA）培養NCl-H1299，其他細胞用10%胎牛血清DMEM高糖培養基培養，細胞均培養于37℃、含5%二氧化碳CO2的培養箱，pMXs-hKLF4過表達質粒購于addgene（貨號17219），按照lipofectamine 2000轉染手冊的步驟進行轉染

1.4 免疫組織化學法

所有組織均經過了甲醛固定和石蠟包埋處理后，制備成厚度約為5μm的切片，采用SP免疫組織化學2步法進行后續處理，制成的切片經二甲苯脫蠟以及不同濃度的酒精脫水處理，后續進行微波抗原修復，再滴加3%雙氧水H2O2孵育10 min，PBS沖洗，10%山羊血清室溫封閉30 min，接著進行濕盒孵育KLF4抗體（1∶200）4℃過夜，第2天PBS沖洗，切片進行生物素標記的山羊抗兔二抗室溫孵育30 min，PBS沖洗，最后DAB顯色，顯微鏡下觀察，自來水沖洗，蘇木素復染，酒精脫水，樹膠封片。每張切片隨機選擇400倍下不重復視野5個，按陽性細胞百分比評分：≥30%表達陽性。

1.5 細胞計數

接種相同細胞到24孔板，設置陰性對照組和實驗組，實驗組轉染KLF4過表達質粒，24、48、72及96 h后分別在顯微鏡下統計各個時間點的細胞數，繪制生長曲線圖。

1.6 Western blot實驗

收集轉染過表達質粒48 h后的細胞，利用含PMSF的RIPA裂解液提取總蛋白，BCA蛋白定量，將變性蛋白進行垂直凝膠電泳2 h之后，接著濕法轉膜，再5%脫脂奶粉對PVDF膜進行室溫封閉處理1 h，封閉完的膜進行一抗4℃孵育過夜，TBST清洗3次，進行二抗室溫孵育1 h，TBST再次清洗3次，化學發光成像系統暗室曝光蛋白拍照。

1.7 遷移與侵襲

利用包埋基質膠或不包埋基質膠的Transwell小室檢測細胞遷移與侵襲能力，消化轉染48 h后的細胞，用不含血清的培養基重懸，取200μl（2×104個細胞）的單細胞懸液種植在Transwell小室的上室，下室加入600μl含10%的胎牛血清的培養基，37℃培養箱孵育24 h后，棉簽擦拭掉Transwell上室膜細胞，接著4%甲醛室溫固定10 min，0.05%結晶紫染色10 min，最后，顯微鏡200倍下每個小室隨機觀察5個視野計數并拍照。

1.8 統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，KLF4與臨床病理特征關系的分析采用χ2檢驗，隨機成對計量資料采取t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KLF4在非小細胞肺癌組織中的表達

KLF4主要表達在細胞核，少部分表達在細胞漿，陽性染色呈棕黃色顆粒，陰性則為無色。KLF4在肺癌組織中的陽性表達率為23.35%，而在對應的癌旁組織的陽性表達率高達86.14%（t=3.485，P= 0.034）。見圖1。

2.2 KLF4蛋白表達與NSCLC臨床病理特征的關系

免疫組織化學法檢測100例NSCLC組織中KLF4的陽性表達率為64%，KLF4在非小細胞肺癌中的表達與患者所處的臨床分期、是否遠處轉移密切相關，而與患者的性別、年齡、病理類型、腫瘤大小等無關。臨床分期等級越高，KLF4的表達越少（P＜0.05）；遠處轉移患者KLF4的陽性表達（23.07%）低于非遠處轉移者（52.45%），兩者差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.3 KLF4蛋白在NSCLC細胞系中的表達

Western blot檢測結果顯示，KLF4在非小細胞肺癌細胞系中的表達均低于WI-38中的表達，Image J軟件灰度分析蛋白表達情況，差異具有統計學意義（t=2.189，P=0.037，n=3）。見圖2。

表1 KLF4蛋白的表達與臨床病理的相關性 例

圖1 KLF4蛋白在肺癌及癌旁組織中的表達 （SP×400）

2.4 過表達KLF4抑制NSCLC細胞的增殖

轉染KLF4的過表達質粒后，A549（t=4.763，P= 0.004）和H1299（t=1.368，P=0.006）的細胞增殖能力受到抑制。見圖3。

圖2 KLF4蛋白在正常肺細胞以及NSCLC細胞系中的表達水平

圖3 過表達KLF4抑制NSCLC細胞的增殖能力

2.5 過表達KLF4蛋白對EMT相關標志物的影響

A549細胞和H1299細胞分別轉染pMXs-hKLF4過表達質粒后，提取蛋白進行Western blot檢測，發現過表達KLF4后2種細胞的上皮標志物E-caherin、α-catenin表達均升高，而間皮標志物N-caherin、vimentin的表達下調（見圖4），說明過表達KLF4能夠抑制NSCLC細胞EMT的發生。

2.6 過表達KLF4蛋白對NSCLC細胞遷移和侵襲的影響

瞬轉KLF4過表達質粒的細胞進行Transwell實驗，發現過表達KLF4的A549細胞（t=5.763，P= 0.024；t=2.489，P=0.015，n=3）和H1299細胞（t= 1.463，P=0.033；t=3.398，P=0.107，n=3）遷移及侵襲能力均受到明顯抑制。見圖5。

3 討論

KLF4是重要的核轉錄因子，在參與調控癌細胞的增殖、分化、周期等方面發揮著重要的作用。目前的研究已經證實，KLF4在組織中的表達失調與多種腫瘤的發生發展密切相關，鑒于KLF4作為雙向調控因子，在腫瘤中既發揮抑癌作用，也發揮促癌作用，因此對于KLF4在腫瘤的具體作用機制仍存在諸多疑問。關于KLF4在NSCLC中的作用機制的研究，雖已有少量文獻報道，但是KLF4調控NSCLC及EMT的發生的研究卻很少，EMT是腫瘤惡性轉變的一個重要的標志，EMT的發生與腫瘤的增殖、侵襲及轉移密切相關。NEHA等[12]在其研究中指出KLF4是EMT的關鍵調節因子；此外，有關腎纖維化的研究報道了KLF4能夠通過抑制EMT來延緩腎纖維化的發生[13]，同時Dnmt1甲基化KLF4的啟動子促進EMT的發生；ZHOU等[14]在其乳腺癌的研究也做了類似的研究；有文獻報道KLF4抑制SPARC的表達來抑制肺癌細胞的侵襲轉移；最新的研究表明，KLF4能夠抑制K-Ras誘導的小鼠肺癌的形成，組蛋白乙酰化可能抑制KLF4的表達[15]。

本研究發現，KLF4在肺癌組織中的表達低于癌旁組織，并且KLF4的表達與患者的臨床分期、遠處轉移密切相關；在NSCLC細胞系中的表達也低于正常的肺細胞，過表達KLF4抑制NSCLC細胞的侵襲與遷移，同時，KLF4的過表達抑制了EMT的發生，因此，推測KLF4在調控NSCLC增殖及EMT的發生過程中發揮著重要的作用，可能成為NSCLC臨床早期診斷的特異性標志物。KLF4在非小細胞肺癌中的研究較少，其機制有待深入研究。該論文收集了100例NSCLC進行統計學分析，同時通過免疫組織化學分析過表達KLF4，發現KLF4與細胞的增殖、侵襲及遷移有關，并得出過表達KLF4能夠抑制NSCLC增殖及EMT的發生這一結論。該結論有較好的實驗證據支持，具有一定的理論和臨床指導意義。

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（張西倩 編輯）

Mechanisms of KLF4 over-expression in inhibiting proliferation and EMT of NSCLC*

Hua-song Liu1,Lan-lan Xu2,Jun Zhang1,Jia-long Guo1,Chen-yi Lin1,
Ye Yuan1,Min Zeng1,Dong-liang Cheng1
(1.Department of Thoraco-cardio-macrovascular Surgery,Shiyan Taihe Hospital(the Affiliated Hospital of Hubei University of Medicine),Shiyan,Hubei 442099,China；2.Shool of Nursing, Hubei University of Medicine,Shiyan,Hubei 442000)

Objective To explore the effect of KLF4 on proliferation and epithelial mesenchymal transition(EMT) innon-small cell lung cancer(NSCLC).Methods KLF4 expression in 100 samples of surgical resected NSCLC and matched normal tumor-adjacent tissues were measured by immunohistochemical staining.KLF4 expression in WI-38 and NSCLC cell lines was detected by Western blot.The regulatory effect of KLF4 on proliferation,invasion, migration and EMT markers were confirmed by cell counting,Transwell and Western blot,respectively.Results KLF4 expression was impaired in the NSCLC tissues.Loss of KLF4 expression was correlated with poor clinicopathological features including tumor stage and distant metastasis,upregulated KLF4 attenuated proliferation, invasion and migration.Meanwhile,the expressions of N-cadherin and vimentin were markedly decreased,but E-caherin and α-catenin expressions were increased after NSCLC cells were transfected with pMXs-hKLF4. Conclusions Our work provides a novel molecular insight into KLF4-directed tumor suppression through regulation of EMT.

KLF4;NSCLC;proliferation;EMT

R734.2

A

2016-12-06

湖北省教育廳項目（No：B2016497）

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.19.008

1005-8982（2017）19-0040-05