水解方式對黃繭蠶絲多肽抗氧化活性的影響

包立軍，彭云武，殷創，孫敏瑞

（1.安康學院陜西省蠶桑重點實驗室，陜西安康725000；2.安康學院現代農業與生物科技學院，陜西安康725000）

水解方式對黃繭蠶絲多肽抗氧化活性的影響

包立軍1，2，彭云武1，2，殷創2，孫敏瑞2

（1.安康學院陜西省蠶桑重點實驗室，陜西安康725000；2.安康學院現代農業與生物科技學院，陜西安康725000）

以DPPH自由基清除率為指標，研究了天然黃繭家蠶品種“金絲一號”繭絲在鹽水解、堿水解、酶水解3種不同提取條件下所獲蛋白多肽的抗氧化功能活性差異。結果表明：鹽水解法時，在40%CaCl2溶液、100℃、料液比為1∶20（g/mL）的提取條件下，蠶絲蛋白多肽DPPH自由基清除率平均為43.15%；堿水解法時，在4 mol/L NaOH溶液、100℃的條件下提取1 h，DPPH自由基清除率平均為45.62%。酶水解法時，加入1 000 U/g堿性蛋白酶，55℃處理4 h，蠶絲蛋白多肽DPPH自由基清除率平均為62.26%。天然黃繭蠶絲蛋白酶法水解物的抗氧化活性優于鹽水解法和堿水解法。

天然黃繭；多肽；酶解；抗氧化活性

我國種桑養蠶、制絲織綢歷史悠久。蠶絲是天然纖維中的珍貴品種，素有“纖維皇后”之稱，是發展天然彩色織物的理想對象。天然有色繭絲是符合生態紡織品概念的一種天然纖維，因繭絲絲膠含有色素類物質而呈黃、綠等天然顏色，可免去紡織印染及該過程中各種助劑和染料的加入，實現環保無污染，近年來其發展備受關注。為滿足消費者崇尚天然、環保、綠色的消費需求，育種工作者選育出一批如“金絲一號”[1]、“黃繭一號”[2]、“蜀黃一號”[3]、“金菊×明玉”[4]、“夏·黃×秋·色”[5]、“桂蠶 H9”[6]、“粵彩繭 1 號”[7]、“彩繭 1 號”[8]、“蜀·黃×川·白”[9]、渝黔黃繭[10]、湘彩黃 1 號[11]等彩色繭家蠶品種，人工飼育過程與普通白繭類似，有色繭繭質經濟性狀與白繭也相近，但可以減少傳統絲綢生產工序，用彩色蠶繭直接繅絲織綢生產天然彩色絲綢服裝。同時，研究發現天然有色繭絲具有較好的功能活性，Liang等對彩色繭絲的抗氧化性能進行的研究表明，天然彩色繭絲分解自由基的能力遠遠高于棉纖維和白繭絲，將彩色繭絲制成內衣或化妝品，有很好的護膚作用[12]。Chikara Hirayama等[13]從家蠶黃繭的乙醇提取物中分離得到了含有兩種脯氨酸的櫟皮黃酮類物質，有較強的抗菌[14]、抗氧化[15]活性。這些研究為天然有色繭絲的高附加值開發提供了試驗依據。

本研究以陜西省蠶桑重點實驗室野桑蠶與家蠶雜交選育而成的“金絲一號”品種天然黃繭為材料，以DPPH自由基清除率為檢測指標，采用鹽水解法、堿水解法、酶水解法3種方法分別制備蠶絲蛋白多肽，在單因素試驗的基礎上運用正交試驗方法探討了各自的最佳提取工藝，以期為天然黃繭蠶絲蛋白功能應用開發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

天然黃繭：取自安康學院陜西蠶桑重點實驗室天然黃繭品種“金絲一號”，鮮繭繭殼剪碎、清洗、干燥備用；無水氯化鈣、鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇：國藥集團化學試劑有限公司陜西公司；透析袋、堿性蛋白酶：上海源葉生物科技有限公司；DPPH試劑：西安熱默爾生物科技公司。

JY4002型電子天平：上海良平儀器儀表公司；PHS-3C型pH計：上海精科雷磁公司；UV752型電熱恒溫水浴鍋：杭州匯爾儀器公司；TGL-16G型臺式離心機：上海安亭科學儀器公司；BPZ-6033型真空干燥箱：上海一恒科學儀器公司；755B型紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器公司。

1.2 蠶絲多肽水解方法

1.2.1 鹽水解法提取絲素蛋白溶液

精確稱取1.00 g黃繭繭殼，加入CaCl2溶液，在單因素試驗結果基礎上按表1中的溶液濃度、溫度、料液比水平進行提取，獲得鹽水解絲素蛋白溶液。

表1 鹽水解正交因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment with saline solution

1.2.2 堿水解法提取絲素蛋白溶液

精確稱取1.00 g黃繭繭殼，加入NaOH溶液，在單因素試驗結果基礎上按表2中NaOH濃度、溫度、時間進行提取。提取結束后調至pH 7，過濾得堿水解絲素蛋白溶液。

表2 堿水解正交因素水平表Table 2 The factors and levels of orthogonal experiment with alkaline hydrolysis

1.2.3 酶水解法提取絲素蛋白溶液

精確稱取1.00 g黃繭繭殼，加入堿性蛋白酶，在單因素試驗結果基礎上按表3中加酶量、溫度和時間水平提取。提取結束后調至pH 7，過濾得酶水解絲素蛋白溶液。

表3 酶水解正交因素水平表Table 3 The factors and levels of orthogonal experiment with enzymatic hydrolysis

1.2.4 蠶絲蛋白多肽的透析純化

將上述水解液放入透析袋中，自來水中透析2 d、蒸餾水中透析1 d。

1.2.5 蠶絲蛋白多肽的濃縮

將透析后的多肽液，在真空干燥箱中50℃干燥3 h。

1.2.6 DPPH法測定抗氧化活性

DPPH液配制：1 mg DPPH用少量無水乙醇溶解后蒸餾水定容至1 L，避光保存。

預試：試管中先加入2 mL DPPH液，加入各測試樣。溶液呈無色時，加樣量即為預試加樣量值。

A0值測量：取DPPH液2 mL，加無水乙醇1 mL，充分混合，測A值（519 nm），即為A0值。

A值測量：取2 mL DPPH溶液，加入各測試樣的預試加樣量，再加入無水乙醇至總體積3 mL，混合，靜置30 min后，測A值（519 nm）。

清除率計算公式：

DPPH 自由基清除率/%=（A0－A）/A0×100

2 結果與分析

2.1 鹽水解絲素蛋白溶液最優提取方案的確定

選取底物濃度、溫度和料液比進行三因素三水平L9（34）的正交試驗，根據表1中所列正交試驗的因素和水平試驗方案，進行正交試驗，結果分析見表4。

表4 鹽水解絲素蛋白正交結果分析Table 4 The result of orthogonal experiment for silk fibroin with saline solution

正交試驗結果表明，影響DPPH自由基清除率的因子順序依次為：料液比>底物濃度>溫度。制備絲素蛋白溶液的優化結果為A2B3C2，即在40%CaCl2溶液、100℃、料液比為1∶20（g/mL）的條件下提取。經3次試驗驗證，該條件下DPPH自由基清除率平均為43.15%。

2.2 堿水解絲素蛋白溶液最優提取方案的確定

選取底物濃度、溫度和處理時間3個因子進行三因素三水平L9（34）的正交試驗，確定最佳的堿水解絲素蛋白溶液最優提取方案。根據表2中所列正交試驗的因素和水平的方案，進行正交試驗，結果分析見表5。

從表5可以看出，影響DPPH自由基清除率的因子順序依次為：底物濃度>處理時間>溫度。制備絲素蛋白溶液的優化結果為A2B3C2，即在4 mol/L NaOH溶液中，在100℃的條件下提取1 h。經3次試驗驗證，該條件下DPPH自由基清除率平均為45.62%。

2.3 酶水解絲素蛋白溶液最優提取方案的確定

選取加酶量、溫度和處理時間3個因子進行三因素三水平L9（34）的正交試驗，確定最佳的酶水解絲素蛋白溶液最優提取方案。根據表3中所列正交試驗的因素和水平的方案，進行正交試驗，結果分析見表6。

正交試驗結果見表6，影響DPPH自由基清除率的因子順序依次為：加酶量>處理時間>溫度。制備絲素蛋白溶液的優化結果為A2B2C2。即加入1 000 U/g的酶，在55℃處理4 h。經3次試驗驗證，該條件下DPPH自由基清除率平均為62.26%。

表5 堿水解絲素蛋白正交結果分析Table 5 The result of orthogonal experiment for silk fibroin with alkaline hydrolysis

表6 酶水解絲素蛋白正交結果分析Table 6 The result of orthogonal experiment for silk fibroin with enzymatic hydrolysis

3 結論

本試驗采用鹽水解、堿水解、酶水解3種方法獲得天然黃繭蠶絲蛋白多肽，并比較了多肽的抗氧化活性。試驗結果表明：鹽水解法時，在40%CaCl2溶液、100 ℃、料液比為 1∶20（g/mL）的條件下提取，DPPH 自由基清除率平均為43.15%；堿水解法時，在4 mol/LNaOH溶液、100℃的條件下提取1 h，DPPH自由基清除率平均為45.62%；酶水解法時，加入1 000 U/g的堿性蛋白酶，55℃處理4 h，DPPH自由基清除率平均為62.26%。由此可見，天然黃繭蠶絲蛋白酶法水解物的抗氧化活性優于鹽水解法和堿水解法。因此，在進行蠶絲蛋白抗氧化多肽應用中，應優先考慮酶法提取。

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Studies on Polypeptide Antioxidant Activity of Natural Yellow Cocoon by Different Hydrolysis Methods

BAO Li-jun1，2，PENG Yun-wu1，2，YIN Chuang2，SUN Min-rui2
（1.Shaanxi Key Laboratory of Sericulture，Ankang University，Ankang 725000，Shaanxi，China；2.College of Modern Agriculture and Biotechnology，Ankang University，Ankang 725000，Shaanxi，China）

To study the effect of polypeptide antioxidant activity of“Golden Silk I”natural yellow cocoon，DPPH radical scavenging rate was detected of the saline solution，alkali hydrolysis，or enzymatic hydrolysis's polypeptides.The results showed that the saline solution，under the conditions of 40%CaCl2solution，100℃，and solid-liquid ratio of 1∶20（g/mL），DPPH radical scavenging rate averaged 43.15%.Alkaline hydrolysis，under the conditions of 4 mol/L NaOH solution，1 h and 100℃，DPPH radical scavenging rate averaged 45.62%.Enzymatic hydrolysis method，under the conditions of joining 1 000 U/g enzyme，4 h and 55℃，DPPH radical scavenging rate averaged 62.26%.Antioxidant activity of using enzymatic hydrolysis was better than that of saline solution and alkaline solution.

natural yellow cocoon；polypeptides；enzymatic hydrolysis；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.004

2017-06-05

陜西省農業科技創新與攻關項目（2014K02-13-01）；安康市科技計劃項目（2014AK01-11）

包立軍（1982—），男（漢），副研究員，碩士，研究方向：桑育種及蠶桑資源綜合開發研究。