一株干酪乳桿菌生物學特性及其發酵豆乳的研究

陳佩，黨輝，賀國旗，王紅麗，孟科，陳衛

（1.陜西廣播電視大學，陜西西安710119；2.陜西理工學院生物科學與工程學院，陜西漢中723001；3.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122；4.陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西西安710119）

一株干酪乳桿菌生物學特性及其發酵豆乳的研究

陳佩1，2，黨輝3，4，賀國旗1，王紅麗1，孟科1，陳衛3

（1.陜西廣播電視大學，陜西西安710119；2.陜西理工學院生物科學與工程學院，陜西漢中723001；3.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122；4.陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西西安710119）

主要研究一株具有降糖作用的干酪乳桿菌的生物學特性及其對發酵豆乳的品質影響。結果表明該菌株在強酸條件下可以生長，對人工胃腸液都具有很好的耐受性。耐受膽鹽的延遲時間為1.01 h，對Caco-2細胞具有較強的黏附能力(15個/cell)。以干酪乳桿菌發酵豆乳具有良好的品質，且感官評定綜合得分為90分。

干酪乳桿菌；發酵豆乳；生物學特性

我國糖尿病患者人數在過去30年中快速增長了近10倍[1]，目前已超過1億，成為全球糖尿病人數第一大國。因此，對糖尿病的預防和治療有非常迫切的需求。大多數的糖尿病患者通過藥物能達到降糖的效果，但是每種藥物都存在有一定的副作用，在使用過程中會對人體健康產生危害。所以人們將目光投向更天然、更安全的降糖途徑。近年來，乳酸菌被證實具有預防和治療糖尿病的作用。有研究發現干酪乳桿菌[2]、VSL#3（雙歧桿菌，唾液鏈球菌，乳酸桿菌）[3]、嗜酸乳桿菌[4]、乳酸桿菌代田株[5]、鼠李糖乳桿菌和雙歧桿菌[6]等菌株在動物模型或臨床試驗中對糖尿病具有預防或治療的作用。

豆乳含有豐富的植物蛋白、不飽和脂肪酸和維生素等功能成分，不含膽固醇，其營養價值非常高。豆乳經過乳酸菌發酵后制成酸豆乳，產品中含有乳酸菌活菌體及其代謝產物，對人體的腸胃吸收功能有良好的生理作用，同時改善了豆乳原有的豆腥味和組織狀態[7]。目前越來越多的研究集中于用乳酸菌發酵豆乳[8-9]，且乳酸菌發酵豆乳制品已成為發展豆乳工業的方向之一。

在前期研究的基礎上[10]，研究一株干酪乳桿菌的生物學特性，初步探討其在豆乳中的發酵特性，為降糖產品的研究開發和規模化生產提供一定的技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干酪乳桿菌CCFM0412：江南大學食品生物與技術中心菌株保藏庫；MRS液體培養基：青島海博；大豆：市售；胃蛋白酶(1∶10 000)、胰蛋白酶（1∶250）、巰基乙酸鈉：美國sigma；人結腸癌腺細胞系Caco-2細胞株：上海生命科學研究院細胞資源中心；DMEM高糖培養基、0.25%胰酶、胎牛血清、雙抗（青、鏈霉素）：美國Gibico。

DHP9012恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1CV超凈臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；320-S pH計：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；UV-2100紫外可見分光光度計：尤尼科上海有限公司；DJ13B-N620SG九陽豆漿機：濟南九陽電器有限公司；TA-XT2質構測試儀：英國Godal ming UK；NDJ/79型粘度儀：同濟大學機電廠；5415R冷凍離心機：德國Eppendorf；CX41-12C02 倒置顯微鏡：日本 Olympus；細胞培養瓶：美國Corning。

1.2 方法

1.2.1 干酪乳桿菌的制備

將凍存于-80℃的干酪乳桿菌接入MRS液體培養基中，37℃培養18h，連續活化三代后用于后續試驗。

1.2.2 干酪乳桿菌在人工模擬胃腸液中的生長測定

將胃蛋白酶溶于PBS（pH 3.0）中，使其終濃度為3 g/L，過0.22 μm濾膜除菌后備用。將胰蛋白酶溶于PBS（pH 8.0）中，使其終濃度為 1 g/L，過 0.22 μm 濾膜后制備成模擬腸液[11]。

干酪乳桿菌以0.85%生理鹽水重懸后，在模擬胃液(pH 3.0)中調節菌液密度至1×109CFU/mL，混勻后37℃培養1、2、3 h檢測活菌數。在模擬胃液（pH 3.0）中培養3 h后，取培養液1 mL加入至9 mL的模擬腸液（pH8.0）中，混勻后 37℃培養 2、4、8h檢測活菌數[12]。乳酸菌的存活率用以下公式計算：

式中：N1為經過模擬胃腸液處理之后的乳酸菌活菌數；N0為未處理前乳酸菌的活菌數。

1.2.3 干酪乳桿菌對膽鹽的耐受能力

取對數生長期的干酪乳桿菌，以2%的接種量分別接種于含有或不含0.3%膽鹽的MRS-THIO(MRS含有0.2%的巰基乙酸鈉)培養基中，混勻后37℃培養。記錄不加膽鹽和加了膽鹽的培養基吸光值達到0.3個單位時各組所需的時間，這兩組的時間差即為干酪乳桿菌在膽鹽中生長的延遲時間（Lag Time，LT）。延遲時間的長短，反映了乳酸菌對膽鹽的耐受能力。延遲時間越短，說明耐受膽鹽的能力越強，反之則耐受膽鹽的能力越弱[13]。

1.2.4 干酪乳桿菌對Caco-2細胞的粘附能力測定

Caco-2細胞生長在含有20%胎牛血清，1%L-谷氨酰胺，1%非必需氨基酸和1%雙抗的高糖DMEM完全培養基中，于37℃，5%CO2的培養箱中進行培養，隔天換液，等細胞增殖融合率達到80%左右時，以含0.22%EDTA的0.25%胰酶消化細胞，按照1∶3進行傳代。取對數生長期的細胞進行下步試驗。

參照Bustos等[14]的方法有所改動，調節Caco-2細胞密度為4×104cell/孔接種到6孔板中，37℃，5%CO2的培養箱中培養24 h。將培養至對數期的干酪乳桿菌離心后用PBS（pH 7.2）沖洗3次后重懸于高糖DMEM完全培養基中，并調整菌液濃度為1×108CFU/mL，加入到已生長好的Caco-2細胞單層中，37℃，5%CO2的培養箱中培養2 h。再以PBS（pH 7.2）沖洗細胞單層3次，用甲醇固定30 min后，再進行革蘭氏染色。隨機找20個視野數100個細胞，以平均每個細胞上粘附的干酪乳桿菌數來評價其粘附能力。

1.2.5 發酵豆乳的工藝流程[15]

大豆→熱燙滅酶（4 min）→浸泡（0.5%NaHCO3溶液，12 h）→清洗→去皮（豆水比1：7，質量比）→熱水磨漿（80℃）→過濾→調漿（7%蔗糖）→均質→殺菌（121℃，15 min）→接種→發酵→低溫后熟→酸豆乳

1.2.6 接種量對發酵豆乳的影響

取對數生長期的干酪乳桿菌按照3%、5%和7%的接種量接種到豆乳中，37℃培養，記錄凝乳時間，測定pH值、滴定酸度和活菌數。

1.2.7 發酵豆乳黏度的測定

在25℃下，利用黏度計（10×轉子）測定發酵豆乳的黏度，重復試驗3次取平均值。

1.2.8 發酵豆乳游離氨基酸的測定

鄰苯二甲醛（ortho-phthalalolehy de，OPA）法測定發酵豆乳的蛋白水解程度。340 nm下測定游離氨基酸與OPA反應形成的復合物的吸光值表示發酵豆乳的蛋白水解程度，以空白作對照[16]。

1.2.9 發酵豆乳感官評價

感官評定小組由10名研究生（5男5女）志愿者組合，并全部接受過《食品感官評定》課程的培訓。按照表1各項指標進行評價[17]。

表1 酸豆乳感官評價標準Table 1 Sensory evaluation criteria of fermented soymilk

2 結果與討論

2.1 干酪乳桿菌在人工模擬胃腸液中的存活率

乳酸菌要進入人體腸道發揮益生作用，首先應該具有較強的耐受胃腸液的能力。干酪乳桿菌在人工模擬胃腸液中的存活率見表2。

表2 干酪乳桿菌在人工模擬胃腸液中的存活率Table 2 Tolerance of Lactobacillus casei to simulated gastrointestinal juice

從表2可見，干酪乳桿菌在人工模擬胃液（pH 3.0）中可存活3 h，并且存活率為82.34%。在模擬腸液（pH 8.0）中可存活8 h，且存活率可達到90%以上，結果表明干酪乳桿菌對人工模擬胃腸液有很好的耐受力。

2.2 干酪乳桿菌對膽鹽的耐受能力

膽鹽能夠破壞細胞的細胞膜，所以對膽鹽的耐受能力是評價益生菌的一個重要指標。干酪乳桿菌對膽鹽的耐受能力見圖1。

圖1中所示，本試驗中的干酪乳桿菌對于膽鹽的延遲時間為1.01 h，說明此菌株對膽鹽具有很好的耐受性。乳酸菌中有些菌株可以產出膽鹽水解酶，此酶可將甘氨酸和牛磺酸結合的膽鹽催化水解為氨基酸殘基和游離的膽鹽。這種乳酸菌具有降低血清膽固醇水平和預防正常人高膽固醇血癥的發生[18]。

圖1 干酪乳桿菌對膽鹽的耐受能力Fig.1 Bile salts tolerance of Lactobacillus casei

2.3 干酪乳桿菌對Caco-2細胞的黏附能力

益生菌能夠黏附定植與腸壁細胞表面，是其發揮益生作用的必要條件之一[19]。Caco-2細胞是一種人克隆結腸腺癌細胞，結構和功能類似于分化的小腸上皮細胞，可以較好的模擬人體腸道中的環境。干酪乳桿菌對Caco-2細胞的黏附能力見圖2。

圖2 干酪乳桿菌對Caco-2細胞的黏附形態（×400）Fig.2 The morphology of adherent of Lactobacillus casei to Caco-2 cells

如圖2所示，干酪乳桿菌對Caco-2細胞具有一定的黏附能力，依據試驗統計結果表明粘附率為15個/cell，由此推測此試驗菌株在腸道中具有較好的定植能力，可以發揮其益生作用。

2.4 不同接種量對發酵豆乳的影響

根據發酵豆乳的工藝流程，將干酪乳桿菌以不同接種量接入到豆乳中，測定其凝乳時間、pH值、滴定酸度和活菌數，結果見表3。不同接種量下，酸豆乳的凝乳時間和滴定酸度差異顯著（P＜0.05），隨著接菌量的增加，豆乳的凝乳時間相應縮短，滴定酸度升高。接種量為7%和3%的pH值差異顯著（P＜0.05）。活菌數隨著接種量的增加而增加。綜合考慮選取7%的接菌量進行后續試驗。

表3 干酪乳桿菌接種量對酸豆乳發酵特性的影響Table 3 The fermentation characteristics of Lactobacillus casei in different inoculums densities

2.5 發酵豆乳表觀黏度的變化

干酪乳桿菌在發酵豆乳期間表觀黏度的變化如圖3所示。

圖3 干酪乳桿菌發酵過程中酸豆乳表觀黏度變化Fig.3 Changes of apparent viscosity of soymilk during fermentation with Lactobacillus casei

發酵前2 h因為豆乳呈液態狀，所以表觀黏度的變化很微小。之后隨著乳酸菌的快速繁殖產酸，豆乳的pH值不斷下降，大豆球蛋白之間不斷聚集凝結，形成了酸凝膠體系，所以酸豆乳的表觀黏度也不斷升高。當發酵豆乳過程中凝乳的形成抑制了發酵乳桿菌的乳酸代謝，因此到發酵后期，豆乳黏度呈現緩慢上升的趨勢。

2.6 發酵豆乳蛋白水解能力的變化

發酵豆乳蛋白水解能力的變化見圖4。

圖4 干酪乳桿菌發酵過程中游離氨基酸含量的變化Fig.4 Changes of free amino acid content in soymilk during fermentation with Lactobacillus casei

如圖4所示，干酪乳桿菌在發酵豆乳初期，由于其生長代謝緩慢分解大豆蛋白的能力較弱，故游離氨基酸的含量較低，隨著發酵時間的延長，大豆蛋白被分解的量增加，游離氨基酸的含量也隨之迅速增加，吸光值也越來越高。

2.7 發酵豆乳感官評定

干酪乳桿菌發酵豆乳結束后，經過10名專業感官鑒評人員對色澤，氣味，滋味和組織狀態4個指標的評定，發酵豆乳產品呈現良好的品質，綜合得分為90分。目前市場上還沒有比較成熟的發酵豆乳產品，因此我們暫時無法對產品進行橫向的比較。但是在以后的應用開發研究中，可以根據特別的產品需求有針對性的進行研究。

3 結論

目前，全球的糖尿病發病率和患者總數都呈逐年增加的趨勢。因為傳統降糖藥物的使用會引發一系列的副作用，所以人們逐漸將目光投入到更安全的天然食品，尋求理想的降糖保健食品。國內外的研究表明乳酸菌通過調節宿主腸道菌群達到降糖的作用。本研究對一株具有潛在的降糖作用的干酪乳桿菌生物學特性及其在發酵豆乳中的應用進行了研究。結果表明該菌株具有較好的耐酸、耐膽鹽和黏附的生物特性，耐受膽鹽的延遲時間為1.01 h，對Caco-2細胞具有較強的黏附能力（15個/cell），并且發酵豆乳成品風味獨特，營養豐富，具有較高的感官評定得分。故該菌株可以作為潛在降糖的益生菌，未來可進一步研究開發出具有降糖作用的新型發酵產品，具有良好的開發應用前景。

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Study on the Biological Characteristics of Lactobacillus casei and Application in the Fermented Soymilk Produce

CHEN Pei1，2，DANG Hui3，4，HE Guo-qi1，WANG Hong-li1，MENG Ke1，CHEN Wei3
（1.Shaanxi Radio&TV University,Xi'an 710119，Shaanxi，China;2.School of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology,Hanzhong 723001，Shaanxi，China;3.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122，Jiangsu，China;4.College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi'an 710119，Shaanxi，China）

The aim of the present study was to investigate the biological characteristics of a Lactobacillus casei strain with hypoglycemic activity and application in the fermented soymilk produce.The results showed that Lactobacillus casei could grow under strongly acidic conditions,and survive in the simulated gastro-intestinal juice.The bile tolerance of this strain in the form of lag time was 1.01 h.More importantly,it possessed strong adhesive properties to Caco-2 cells （15 bacteria per cell）.The results revealed that Lactobacillus casei grew well in fermented soymilk with good sensory quality.The sensory evaluation score of fermented soymilk produce was 90 points.

Lactobacilus casei；fermented soymilk；biological characteristics

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.005

2016-09-21

陜西省農業科技創新與攻關項目“益生乳酸菌胞外多糖制備及功能研究”（2015NY025）；陜西廣播電視大學重點課題“陜南泡菜中優質菌株的篩選及菌群關系研究”（15D-08-A02）

陳佩（1983—），女（漢），講師，博士，研究方向：食品微生物。