納濾技術(shù)在河豚魚皮膠原肽螯合鋅脫鹽中的應(yīng)用研究

郭洪輝，洪專

（國家海洋局第三海洋研究所海洋生物資源綜合利用工程技術(shù)研究中心，福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建廈門361005）

納濾技術(shù)在河豚魚皮膠原肽螯合鋅脫鹽中的應(yīng)用研究

郭洪輝，洪專*

（國家海洋局第三海洋研究所海洋生物資源綜合利用工程技術(shù)研究中心，福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建廈門361005）

采用納濾膜技術(shù)對(duì)河豚魚皮膠原肽螯合鋅進(jìn)行了脫鹽濃縮試驗(yàn)，研究不同分子量的納濾膜對(duì)螯合鋅脫鹽效果及回收率的影響，確定最佳的納濾除鹽工藝。試驗(yàn)結(jié)果表明，最適用膜為截留分子量700 Da的卷式納濾膜。在滲濾過程中，當(dāng)加入6倍料液體積的純水后，河豚魚皮膠原肽螯合鋅基本達(dá)到了脫鹽的效果，產(chǎn)品的回收率為73.82%。河豚魚皮膠原肽螯合鋅經(jīng)納濾膜脫鹽后，蛋白質(zhì)含量從46.6%提高到82.04%，含鋅量為12.8%，去除了大量的無機(jī)鹽雜質(zhì)，達(dá)到了分離純化的目的。

納濾；河豚魚皮；膠原肽螯合鋅；脫鹽

魚產(chǎn)品在加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量的魚副產(chǎn)物，如魚皮、魚鱗、魚頭、魚骨及內(nèi)臟等，這部分約占魚鮮重的50%左右[1-4]。其中，魚皮在副產(chǎn)物中約占7%～8%，研究顯示，魚皮中膠原蛋白含量豐富，約占蛋白質(zhì)總量的60%～80%，是魚體各部位中含量最高的一類蛋白，可以作為膠原蛋白提取的良好原料[5-6]。以魚皮作為原料，采用酸提或酶解等方法提取膠原蛋白，具有多種生物學(xué)功能，已在化妝品、保健食品、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域顯現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[4-6]。近年來，人們開始關(guān)注魚皮膠原肽與金屬螯合的研究，肽的金屬螯合物如Fe、Zn等的生物學(xué)利用率比無機(jī)鹽高，且無毒副作用，是理想的人體或動(dòng)物的微量元素補(bǔ)充劑[7-10]。

目前，肽的金屬螯合物脫鹽主要采用乙醇沉淀法，并不適用于大規(guī)模的分離純化[1，7-8，11-12]。而膜分離技術(shù)是一種簡單、快速、高效、選擇性好且經(jīng)濟(jì)節(jié)能的新技術(shù)，其中納濾膜過濾技術(shù)就是介于傳統(tǒng)分離范圍超濾和反滲透之間的一種新型分子級(jí)膜分離技術(shù)，納濾膜的表層孔徑范圍在納米級(jí)（10-9m），平均孔徑為2 mm，相對(duì)分子質(zhì)量截留范圍（MWCO）為200 Da～1 000 Da[13]。其納濾膜結(jié)構(gòu)及性能上的特點(diǎn)，使得納濾膜分離技術(shù)在食品工業(yè)、水處理等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[14]。本試驗(yàn)在河豚魚皮膠原肽螯合鋅制備過程中，采用了不同截留分子量的納濾膜對(duì)其進(jìn)行脫鹽的分離純化，并對(duì)脫鹽的工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，為今后的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

河豚魚皮膠原肽：國家海洋局第三海洋研究所海洋生物資源綜合利用工程技術(shù)研究中心自制[15]；卷式納濾膜芯：美國GE公司；醋酸鋅、氫氧化鈉、鹽酸、氯化銨、鉻黑T、乙二胺四乙酸二鈉均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

30 L雙層玻璃反應(yīng)釜、DFY-20L/20低溫恒溫反應(yīng)浴：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；1812卷式膜設(shè)備：三達(dá)膜科技有限公司；Milli-Q超純水純化系統(tǒng)：美國millipore公司；RC 6+大型高速冷凍離心機(jī)：美國熱電公司；SG3便攜式電導(dǎo)率儀：梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；Epsilon2-6D凍干機(jī)：德國Christ公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 河豚魚皮膠原肽螯合鋅的制備

將5 kg河豚魚皮洗凈后，先經(jīng)過30 L 0.2%NaOH水溶液處理，瀝干洗至中性，然后用30 L 0.3%H2SO4水溶液處理，瀝干洗至中性，再加入5 L的純水在60℃恒溫加熱攪拌2 h，最后經(jīng)過復(fù)合酶解后得到30 L的河豚魚皮膠原肽水溶液[15]。用酸堿調(diào)節(jié)至一定的pH值，加入鋅離子與膠原肽的摩爾比為1∶2的醋酸鋅，加熱至60℃～70℃，反應(yīng)2 h，經(jīng)冷凍高速離心后得到淡黃色的河豚魚皮膠原肽螯合鋅水溶液。

1.3.2 卷式納濾膜的的篩選

由于河豚魚皮膠原肽螯合鋅的分子量約為1000Da，為了減小損失分別選用不同截留分子量（1 000、700、450 Da）的卷式納濾膜，對(duì)反應(yīng)得到的30 L河豚魚皮膠原肽螯合鋅水溶液進(jìn)行納濾除鹽，當(dāng)透過液的電導(dǎo)率降低到100 μs/cm時(shí)，停止納濾，濃縮料液并冷凍干燥[16]。通過測(cè)定膜通量、透過液電導(dǎo)率和含鋅量的變化等指標(biāo)來確定最適的納濾膜及加水量。

3種卷式納濾膜的工作參數(shù)如表1所示。

表1 不同卷式納濾膜的工作參數(shù)Table 1 Operating parameter of spiral nanofiltration membrane with different MWCO

1.3.3 不同卷式納濾膜對(duì)鋅離子透過率的測(cè)定

將醋酸鋅溶解于超純水中，得到1 g/L的醋酸鋅水溶液，選用不同截留分子量的卷式納濾膜在相同條件下進(jìn)行納濾循環(huán)，同時(shí)接取濃縮液和透過液，并對(duì)其鋅離子濃度進(jìn)行測(cè)定，按照公式（1）計(jì)算不同卷式納濾膜的鋅離子透過率。

式中：X為卷式納濾膜對(duì)鋅離子的透過率；C1為透過液的鋅濃度，mol/L；C2為濃縮液的鋅濃度，mol/L。

1.3.4 膜通量的測(cè)定[17]

式中：J為膜通量，L/（h·m2）；V為透過液的體積，L；t為超濾所用的時(shí)間，h；s為膜的面積，m2。

1.3.5 透過液中鋅離子濃度的變化

量取10 mL的透過液置于錐形瓶中，分別加入10 mL的pH 10.0 NH3-NH4Cl緩沖液和適量的鉻黑T指示劑，然后用0.01 mol/L的Na2EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液變藍(lán)，停止滴定，記錄消耗的Na2EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液毫升數(shù)，按照公式（3）計(jì)算鋅離子的濃度[18]。

式中：C為鋅濃度，mol/L；V為消耗的Na2EDTA的體積，mL；c為 Na2EDTA 的濃度，mol/L；v為透過液的體積，mL。

1.3.6 電導(dǎo)率的測(cè)定

電導(dǎo)率儀經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)液校準(zhǔn)后，用超純水洗凈探頭，濾紙擦干，將探頭浸入10 mL樣品液中，待讀數(shù)穩(wěn)定后讀取數(shù)值。

1.3.7 產(chǎn)品回收率的測(cè)定

式中：X為過膜后產(chǎn)品的回收率，%；m1為過膜后凍干樣的質(zhì)量，g；m2為相同體積未過膜料液凍干后的質(zhì)量，g。

1.3.8 產(chǎn)品成分的測(cè)定

水分含量的測(cè)定：直接干燥法（GB 5009.3-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》）。

粗蛋白含量的測(cè)定：微量凱氏定氮法（GB 5009.5-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》）。

鋅含量的測(cè)定：采用Na2EDTA滴定法。

2 結(jié)果與討論

2.1 河豚魚皮膠原肽螯合鋅主要成分分析

取未過膜的河豚魚皮膠原肽螯合鋅凍干樣，進(jìn)行主要成分分析，結(jié)果如表2所示。

表2 未過膜前河豚魚皮螯合鋅的主要成分Table 2 The main components of collagen peptide chelated zinc

由表2可以看出，在未過膜前，河豚魚皮膠原肽螯合鋅的蛋白含量較低，并含有大量的無機(jī)鹽雜質(zhì)，如果不加以去除，會(huì)嚴(yán)重影響最終產(chǎn)品的質(zhì)量[19]。

2.2 卷式納濾膜膜通量隨時(shí)間的變化

不同截留分子量卷式納濾膜膜通量隨時(shí)間變化關(guān)系如圖1所示。

圖1 不同截留分子量卷式納濾膜膜通量隨時(shí)間變化關(guān)系Fig.1 Relationship between membrane fluxes of spiral nanofiltration membrane with different MWCO and time

膜通量是膜分離過程中的一個(gè)重要工藝運(yùn)行參數(shù)之一，可以由此判斷膜分離的效率。當(dāng)30 L河豚魚皮膠原肽螯合鋅水溶液使用不同截留分子量卷式納濾膜進(jìn)行循環(huán)脫鹽時(shí)，對(duì)其膜通量進(jìn)行實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看到，在相同溫度和操作壓力下，3種卷式納濾膜的膜通量隨著時(shí)間的變化都有所下降，但是下降程度有所不同，可能是循環(huán)過程中，少量的蛋白或樣品吸附在膜芯表面，使得膜孔有一定程度的堵塞[16]。截留分子量為1 000 Da的卷式納濾膜，膜通量隨時(shí)間變化較小，可能是孔徑較大的原因。而700 Da和450 Da的卷式納濾膜膜通量下降較多，尤其是450 Da的卷式納濾膜，運(yùn)行60 min時(shí)，膜通量從10.2 L/（h·m2）下降到6.9 L/（h·m2）。膜通量的降低會(huì)使使用時(shí)間延長，從而影響生產(chǎn)效率。

2.3 透過液電導(dǎo)率及鋅濃度隨加水體積的變化

在脫鹽時(shí)，最重要的是滲濾過程，即在接出透過液的同時(shí)不斷地向濃縮液中加入純水稀釋濃縮液的濃度以提高脫鹽率。因此，在脫鹽時(shí)需在濃縮液中加入足夠的純水，以保證除鹽效果[20]。在滲濾過程中，檢測(cè)透過液的電導(dǎo)率隨時(shí)間的變化如圖2所示。

圖2 不同截留分子量卷式納濾膜透過液電導(dǎo)率隨加水體積的變化關(guān)系Fig.2 Relationship between conductivity of permeate treated by spiral nanofiltration membrane with different MWCO and the volume of water

由圖2可知，當(dāng)往濃縮液中加入純水后，透過液的電導(dǎo)率迅速下降。截留分子量為1 000 Da的卷式納濾膜，在加入4倍體積的純水后，透過液電導(dǎo)率即下降到99.6 μs/cm。而700 Da和450 Da的卷式納濾膜由于孔徑較小，對(duì)鹽的截留率較大，分別需要加入6倍和9倍體積的純水，才使料液達(dá)到了基本除鹽的效果。因此，可以看出，卷式納濾膜的截留分子量過小，不僅延長脫鹽的時(shí)間，降低生產(chǎn)效率，還會(huì)造成大量水資源的浪費(fèi)。

表3為不同卷式納濾膜對(duì)鋅離子的透過率。

表3 不同截留分子量的卷式納濾膜對(duì)鋅離子的透過率Table 3 Permeation rate of zinc ion of spiral nanofiltration membrane with different MWCO

從表3可以看到，1 000 Da和700 Da的卷式納濾膜鋅離子的透過率為66.16%和60.52%，均大于60%；而450 Da的卷式納濾膜鋅離子的透過率較低，為52.31%，但是也超過50%，說明這3種卷式納濾膜對(duì)游離的鋅離子均有較好的透過性，能用于除去料液中未參與螯合反應(yīng)的游離鋅離子。

不同截留分子量卷式納濾膜透過液濃度隨加水體積的變化關(guān)系見圖3。

圖3 不同截留分子量卷式納濾膜透過液濃度隨加水體積的變化關(guān)系Fig.3 Relationship between zinc concentration of permeate treated by spiral nanofiltration membrane with different MWCO and the volume of water

在滲濾脫鹽的過程中，隨著加水倍數(shù)的增加，透過液的鋅離子濃度會(huì)逐漸下降，如圖3所示。透過液鋅離子的初始濃度約為0.046 mol/L，當(dāng)加入4倍體積的超純水后，1 000 Da的卷式納濾膜透過液鋅離子濃度降低到0.69 mmol/L，基本去除了游離的鋅離子。700 Da和450 Da的卷式納濾膜在加入6倍體積和9倍體積的純凈水后，鋅離子濃度分別降低到0.78 mmol/L和0.83 mmol/L，降低了98.3%和99.2%，此時(shí)游離的鋅離子濃度已經(jīng)很低，基本達(dá)到脫鹽的目的。

2.4 3種卷式納濾膜的脫鹽效果對(duì)比

表4是3種不同截留分子量卷式納濾膜的耗時(shí)、耗水量和回收率的比較。

表4 3種卷式納濾膜的脫鹽效果比較Table 4 Desalination effect of spiral nanofiltration membrane with different MWCO

1 000 Da的卷式納濾膜孔徑較大，雖然所加水量最少，耗時(shí)也最短，但是螯合鋅的回收率過低，只有21.33%，在脫鹽的同時(shí)損失了大量的螯合鋅樣品。450 Da的卷式納濾膜耗時(shí)20 h，加水量為9倍體積的純凈水，雖然回收率較其他兩種膜高，但是生產(chǎn)效率較低，造成水資源的較大浪費(fèi)。綜合考慮，截留分子量為700 Da的卷式納濾膜回收率為73.82%，最適合于河豚魚皮膠原肽螯合鋅的脫鹽除雜。

2.5 河豚魚皮膠原肽螯合鋅凍干樣主要成分分析

河豚魚皮膠原肽螯合鋅水溶液經(jīng)截留分子量為700 Da的卷式納濾膜脫鹽濃縮后，冷凍干燥并檢測(cè)其主要成分，結(jié)果如表5所示。

表5 河豚魚皮螯合鋅凍干樣的主要組成成分Table 5 The main components of collagen peptide chelated zinc

與表2相比，經(jīng)納濾膜脫鹽后，河豚魚皮膠原肽螯合鋅的蛋白含量顯著提高，并去除了大量的無機(jī)鹽雜質(zhì)，達(dá)到了分離純化的目的。

3 結(jié)論

對(duì)于河豚魚皮膠原肽螯合鋅的脫鹽，納濾膜分離是一種穩(wěn)定、有效的分離方法，其在脫除鹽分的同時(shí)還可實(shí)現(xiàn)螯合鋅的濃縮。本研究是在實(shí)驗(yàn)室小試的基礎(chǔ)上，選用了3種不同截留分子量的卷式納濾膜對(duì)河豚魚皮膠原肽螯合鋅溶液進(jìn)行除鹽濃縮，確定了最佳的納濾除鹽工藝。截留分子量為700 Da的卷式納濾膜能夠有效地除去螯合鋅中大量的無機(jī)鹽雜質(zhì)。當(dāng)加入6倍體積的純水后，透過液電導(dǎo)率可降低到100 μs/cm，鋅離子濃度降到0.78 mmol/L，基本可達(dá)到除鹽的效果，螯合鋅產(chǎn)品的回收率為73.82%。河豚魚皮膠原肽螯合鋅經(jīng)納濾膜脫鹽后，蛋白質(zhì)含量顯著提高，并去除了大量的無機(jī)鹽雜質(zhì)，達(dá)到了分離純化的目的。

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Appllication of Nanofiltration Membrane in Desalination of Collagen Peptide Chelated Zinc from Puffer Skin

GUO Hong-hui，HONG Zhuan*
（Engineering Research Center of Marine Biological Resource Comprehensive Utilization，Third Institute of Oceanography，State Oceanic Administration，F(xiàn)ujian Collaborative Innovation Center for Exploitation and Utilization of Marine Biological Resources，Xiamen 361005，F(xiàn)ujian，China）

Nanofiltration membrane separation was applied for the desalination of collagen peptide chelated zinc from puffer skin.The effect of nanofiltration membrane with different molecular weight cut off（MWCO）on the desalination efficiency and recovery of collagen peptide chelated zinc from puffer skin was studied.The optimal process of desalination by nanofiltration was found.The result showed that the optimal membrane was nanofiltration membrane with MWCO 700 Da.In diafiltration process，when six times feed volume of pure water was added，the collagen peptide chelated zinc was mainly desalted，and the recovery was 73.82%.The protein content of collagen peptide chelated zinc from puffer skin was increased from 46.6%to 82.04%and the zinc content was 12.8%.Much impurity of inorganic salt was removed and the collagen peptide chelated zinc from puffer skin was purified.

nanofiltration；puffer skin；collagen peptide chelated zinc；desalination

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.006

2016-12-01

福建省科技重大專項(xiàng)（2014NZ0001-2）

郭洪輝（1982—），女（漢），助理研究員，博士，主要從事海洋生物資源綜合利用研究。

*通信作者：洪專，男，教授級(jí)高工。