油菜花粉多糖羧甲基化分子修飾及其抗氧化研究

姚秋萍，衛亞麗，楊瓊，盧慶祝

（貴州民族大學化學與生態環境工程學院，貴州貴陽550025）

油菜花粉多糖羧甲基化分子修飾及其抗氧化研究

姚秋萍，衛亞麗，楊瓊，盧慶祝

（貴州民族大學化學與生態環境工程學院，貴州貴陽550025）

以油菜花粉多糖為原料，采用氫氧化鈉-氯乙酸法，分別在0.5 mol/L和2.0 mol/L NaOH濃度條件下對油菜花粉多糖（rape pollen polysaccharides，RPP）進行羧甲基化修飾，并對其清除羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的能力進行研究。結果表明：羧甲基與油菜花粉多糖形成羧甲基化合物，得到取代度分別為0.47和0.55的2個改性產物，羧甲基油菜花粉多糖1（Carboxymethylated rape pollen polysaccharide1，CM-RPP1）和羧甲基油菜花粉多糖2（Carboxymethylated rape pollen polysaccharide 2，CM-RPP）2，RPP、CM-RPP1和CM-RPP2表現出不同程度的抗氧化活性，總的自由基清除能力大小為CM-RPP2＞CM-RPP1＞RPP。與未修飾油菜花粉多糖相比，羧甲基化修飾能提高油菜花粉多糖的體外抗氧化活性。

油菜花粉多糖；羧甲基化修飾；抗氧化活性

由物理因素、化學反應和代謝過程產生的自由基給機體帶來很多病理性的影響，如引起DNA損傷、致癌作用、和衰老有關的細胞變性[1]。油菜多糖是油菜花粉的主要有效成分之一。藥理研究表明，油菜花粉多糖具有增強免疫功能[2]、抗腫瘤[3]、抗氧化[4]等作用。

多糖羧甲基化即指向多糖大分子鏈上引入羧甲基基團，多糖羧甲基化能增大多糖的溶解度和電負性，可以提高多糖的水溶性，修飾后多糖有可能具有較修飾前更高的活性或者產生新的活性[5-9]。杏鮑菇多糖[10]、金銀花多糖[11]、雞腿菇多糖[12]、當歸多糖[13]、黑木耳多糖[14]、靈芝多糖[15]經羧甲基化后抗氧化性能明顯提高，羧甲基紅棗多糖[16]可增強對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，羧甲基茯苓多糖[17]可以抑制乙肝病毒。目前對油菜花粉多糖的研究主要集中在提取、分離純化本研究對油菜花粉多糖進行羧甲基化分子修飾等方面的研究，而對油菜花粉多糖的羧甲基化結構修飾的研究未見報道，并對其修飾前后的抗氧化活性進行研究，以期為油菜花粉的開發利用以及新型保健品的研發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油菜花粉多糖（rape pollen polysaccharides，RPP），貴州民族大學化學與環境科學學院藥物與化學實驗室自制，純度為74.86%；透析袋（MD34型，截留分子量 8 000 Da～14 000 Da，進口分裝）；乙酸、單氯乙酸、DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、NaOH、濃 HCl、無水乙醇、95%乙醇、抗壞血酸、鄰苯三酚、三（羥甲基）氨基甲烷、FeSO4、水楊酸、H2O2等均為分析純。

1.2 主要儀器

HH-6數顯恒溫水浴鍋：常州博遠實驗分析儀器廠；旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；電子分析天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；756PC紫外可見分光光度計：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；電子天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司；傅里葉Nicolct6700型紅外光譜儀：上海萊睿科學儀器有限公司。

2 方法

2.1 油菜花粉多糖的羧甲基化分子修飾

采用氫氧化鈉-氯乙酸反應體系[18]。準確稱取1 g油菜花粉多糖，分別溶于不同濃度（0.5、2.0 mol/L）的NaOH溶液中，劇烈攪拌下緩慢加入6 g的單氯乙酸，混合均勻后在60℃條件下繼續攪拌反應3 h，冷卻，用冰乙酸（或NaOH溶液）中和溶液的pH值為7.0，過濾，濾液透析72 h，冷凍干燥得到羧甲基化油菜花粉多糖[Carboxymethylated rape pollen polysaccharide1（CMRPP1），Carboxymethylated rape pollen polysaccharide 2（CM-RPP2）]。

2.2 羧甲基化油菜花粉多糖取代度（DSCM）的測定

采用酸堿滴定法[19]。精確稱量10 mg羧甲基化油菜花粉多糖樣品，于100℃干燥1 h后轉入錐形瓶中，加入3 mL 70%乙醇，混勻后放置5 min。再依次加入10 mL的H2O，50 mL 0.5 mol/L的NaOH溶液。混合后攪拌直至樣品溶解。然后用濃度為0.1mol/L鹽酸滴定，酚酞作為指示劑，計算每克羧甲基化油菜花粉多糖所需鹽酸的毫摩爾數（A）：

其中：V0代表加入的NaOH的體積，mL；V2代表測定消耗的HCl的體積，mL；V1代表空白測定所消耗的鹽酸的體積；M0代表加入的NaOH的濃度；M代表HCl的濃度；W為樣品的質量，g。

羧甲基取代度（DS）計算公式如下：

2.3 紅外光譜分析

采用KBr壓片法，分別測定RPP、CM-RPP1、CMRPP2的紅外光譜。波數范圍為4 000 cm-1～400 cm-1，儀器分辨率為0.5 cm-1，靈敏度為90，掃描次數為32/64。

圖1 RPP的紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectra of RPP

圖2 CM-RPP1紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of CM-RPP1

圖3 CM-RPP2紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of CM-RPP2

2.4 羧甲基化油菜花粉多糖對羥基自由基（·OH）的清除率

利用Fenton反應來引發產生羥基自由基[20]。在試管中依次加入1 mL 6 mmol/L水楊酸溶液、6 mmol/L FeSO4溶液，然后分別加入1 mL不同質量濃度的羧甲基化油菜花粉多糖水溶液，最后加入6 mmol/L的H2O2溶液1mL啟動反應，靜置30 min后于波長510 nm處測定其吸光度。以蒸餾水代替羧甲基化油菜花粉多糖溶液做空白對照，VC水溶液做陽性對照，對·OH清除率按下式計算：

式中：A0為空白吸光度；AX為樣品吸光度。

2.5 羧甲基化油菜花粉多糖對超氧陰離子自由基的清除率

利用鄰苯三酚發生自氧化反應引發產生超氧陰離子自由基[21]。在試管中依次加入濃度為50 mmol/L，pH8.2的Tris-HCl（即三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液）緩沖液4 mL，然后分別加入1 mL不同質量濃度的羧甲基化油菜花粉多糖水溶液，混勻后于25℃的水浴鍋中放置10 min，加入預熱至25℃的鄰苯三酚（60 mmol/L）溶液0.1 mL，反應5 min后滴加2滴10 mol/L的鹽酸終止反應，并于波長325 nm處測定其吸光度A1，同法測定用蒸餾水代替鄰苯三酚后的吸光度A2，以及用1.0 mL蒸餾水代替樣品溶液后測得的吸光度A0。VC水溶液做陽性對照，對的清除率按下式計算：

2.6 羧甲基化油菜花粉多糖對DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基的清除率

利用在波長517 nm處DPPH無水乙醇溶液紫色團的特定吸收峰原理來測定DPPH自由基的清除率[22]。在具塞試管中加入0.2 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液2 mL，再分別加入2 mL不同質量濃度的羧甲基化油菜花粉多糖水溶液，混均，室溫下靜置30 min后，于波長517 nm處測吸光度AI，同時測定2 mL 0.2 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液與2 mL 50%乙醇混合液的吸光度A0以及2 m不同質量濃度的羧甲基化菜花粉多糖溶液與50%乙醇混合后的溶液測定吸光度AJ。VC水溶液做陽性對照，DPPH自由基的清除率按下式計算：

3 結果與分析

3.1 羧甲基化油菜花粉多糖的取代度

采用堿性-氯乙酸反應體系對油菜花粉多糖進行羧甲基化修飾，由公式計算出CM-RPP1、CM-RPP2的取代度分別為0.47、0.55。

3.2 紅外光譜圖分析

RPP、CM-RPP1和CM-RPP2的紅外光譜圖分別見圖1、圖2和圖3。油菜花粉多糖的羧甲基化修飾產物仍具有多糖的特征紅外吸收峰：3 400 cm-1附近處O-H的伸縮振動吸收峰、2 935 cm-1附近處C-H的伸縮振動吸收峰，1 240 cm-1附近處C-H變角振動吸收、1 039cm-1附近處的C-O-H平面彎曲振動吸收外；與圖1比較，圖2和3在1654.89 cm-1是羧基（-COOH）的C=O非對稱振動吸收峰、1 412 cm-1處與羧基相連的甲基（-CH3）的C-H變角振動吸收、1 326 cm-1處C=O的對稱伸縮吸收增強，并且隨著羧甲基取代度的增加吸收增強，充分表明了羧甲基化油菜花粉多糖中羧甲基（-OCH2-COOH）的存在。從譜圖上可以看出，羧甲基化后油菜花粉多糖的羥基峰（3 400 cm-1）的強度僅稍有減小，說明油菜花粉多糖僅有部分羥基被羧甲基化且取代度較低。

3.3 對羥基自由基的清除作用

CM-RPP1、CM-RPP2和RPP對羥基自由基的清除作用見圖4。

圖4 對羥基自由基的清除作用Fig.4 Scavenging capacity of RPP，CM-RPP1and CM-RPP2on hydroxyl free radicals

由圖4可知，隨著多糖濃度的增加，CM-RPP1、CM-RPP2和RPP對Fenton反應產生的羥基自由基的清除作用逐漸增強。相比較而言，CM-RPP2表現出更強的清除活性，但是清除能力均低于相同質量濃度的VC。

3.4 對超氧陰離子自由基清除作用

CM-RPP1、CM-RPP2和RPP對超氧陰離子自由基的清除作用見圖5。

圖5 對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.5 Scavenging capacity of RPP，CM-RPP1and CM-RPP2on superoxide anion free radicals

由圖 5 可知，CM-RPP1、CM-RPP2和 RPP 對鄰苯三酚自氧化體系產生的超氧陰離子自由基均表現出了一定的清除能力。當多糖濃度在0.2 mg/mL～1 mg/mL時，隨濃度增加，CM-RPP1、CM-RPP2和 RPP 對超氧陰離子自由基清除率提高較快；當多糖濃度大于1 mg/mL時，CM-RPP1、CM-RPP2和RPP對超氧陰離子自由基清除作用平緩。

3.5 對DPPH自由基清除作用

CM-RPP1、CM-RPP2和RPP對DPPH自由基的清除作用見圖6。

圖6 對DPPH自由基的清除作用Fig.6 Scavenging capacity of RPP，CM-RPP1and CM-RPP2on DPPH free radicals

由圖6可知，當多糖濃度在0.2 mg/mL～0.8 mg/mL時，CM-RPP1、CM-RPP2對 DPPH 的清除作用相當，而多糖濃度大于0.8 mg/mL時，CM-RPP2對DPPH的清除作用明顯大于CM-RPP1，但是均大于RPP對DPPH的清除作用。

4 結論

本試驗以油菜花粉多糖為研究對象，經羧甲基化修飾后得到CM-RPP1、CM-RPP22個修飾產物，取代度分別為0.47、0.55。紅外光譜圖譜說明羧甲基化油菜花粉多糖中羧甲基（-OCH2-COOH）的存在。體外抗氧化活性結果顯示，油菜花粉多糖經羧甲基化修飾后對DPPH自由基、·OH和均具有較好的清除能力，并且呈現明顯的量效關系。在相同濃度條件下，CMRPP1、CM-RPP2的清除能力均高于RPP，說明油菜花粉多糖經羧甲基化修飾后，抗氧化作用明顯增強，特別是CM-RPP2表現出了更好的抗氧化活性。可能是由于油菜花粉多糖經過羧甲基分子修飾后，其空間結構發生了改變，使其抗氧化活性提高。關于羧甲基化油菜花粉多糖的構效關系有待進一步研究。

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Carboxymethylated Modification and Antioxidant Activity of Rape Pollen Polysaccharides

YAO Qiu-ping，WEI Ya-li，YANG Qiong，LU Qing-zhu
（School of Chemistry and Eco-Environmental Engineering，Guizhou Minzu University，Guiyang 550025，Guizhou，China）

Polysaccharides from rape pollen （RPP）was carboxymethylated by alkaline chloroacetic acid at 0.5 mol/L and 2.0 mol/L NaOH respectively to obtain carboxymethylated rape pollen polysaccharides（CM-RPP）.The scavenging capacities of hydroxyl free radicals，superoxide anion radical，1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl were assayed，with vitamin C （VC）as control.The results were that two carboxymethylated polysaccharides of RPP with degree of substitution （SD）of 0.47 and 0.55，named carboxymethylated rape pollen polysaccharide1（CM-RPP1）and carboxymethylated rape pollen polysaccharide 2（CM-RPP2），were obtained.RPP，CM-RPP1and CM-RPP2had certain scavenging ability to OH·free radical，·free radical and DPPH free radical.Total antioxidant activity was CM-RPP2＞CM-RPP1＞RPP.Compared with RPP，the antioxidant activity of polysaccharides in rape pollen can be improved through carboxymethylation.

polysaccharides of rape pollen；carboxymethylation modification；antioxidative activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.007

2017-06-01

貴州省科技合作計劃項目（黔科合字[2015]7210）

姚秋萍（1978—），女（漢），副教授，博士，研究方向：食品化學，天然產物研究與開發。