紫甘藍提取物對食源性致病菌的抑菌作用

陳穎慧

（永城職業學院食品化工系，河南永城476600）

紫甘藍提取物對食源性致病菌的抑菌作用

陳穎慧

（永城職業學院食品化工系，河南永城476600）

以7種食源性致病菌作為供試菌株，利用牛津杯法評估紫甘藍提取物的抑菌效果，測定紫甘藍提取物的最低抑制濃度（MIC），并分析其熱穩定性，最后利用透視電鏡試驗揭示紫甘藍提取物的抑菌機理。結果表明：紫甘藍提取物對7種食源性致病菌具有較好的抑菌效果，其中對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌效果最好（MIC=0.2%），對蠟樣芽孢桿菌和阪崎克羅諾桿菌的抑菌效果較差（MIC=0.4%）。紫甘藍提取產物在60℃以下的殺菌效果較好，90℃，20 min下紫甘藍提取物抑菌作用全部失活。紫甘藍提取物是通過較低的pH值和破壞菌株的細胞形態和細胞膜通透性發揮抑菌作用。

紫甘藍提取物；抑菌作用；最低抑制濃度；熱穩定性；透射電鏡

紫甘藍又名紅甘藍、紫洋白菜或紫包菜，屬于十字花科，富含多種維生素及礦物元素，深受廣大消費者的喜愛[1-2]。此外，紫甘藍中含有花青素、多酚和黃酮等多種活性物質，具有抗氧化和抑制病原微生物的作用。張會香等分析了紫甘藍色素對大腸肝菌、金黃色葡萄球菌和酵母菌的抑菌作用，并評估了其抗氧化活性[3]。楊曉玲等則在揭示紫甘藍色素抑菌能力的基礎上，研究了紫甘藍色素的熱穩定性[4]。然而，紫甘藍中的活性物質并非只有紫甘藍色素一種，因此有必要對紫甘藍提取物做進一步的系統研究，并分析其抑菌的機理。本研究以常見的食源性致病菌為供試菌株，確定紫甘藍提取物對這些食源性致病菌的抑菌作用及最低抑制濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC），分析其熱穩定性，并利用對照試驗和透射電鏡試驗揭示紫甘藍提取的抑菌機理，從而為紫甘藍的綜合利用提供新思路。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料、菌株與試劑

紫甘藍：新鮮無損壞變質，購于沃爾瑪超市。

大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門氏菌（Salmonella）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni）、阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）和單增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）：東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室饋贈。

溶菌肉湯培養基（lysogeny broth，LB）、胰酪胨大豆瓊脂培養基（Tryptose Soya Agar，TSA）：北京雷根生物技術有限公司；鹽酸、磷酸緩沖液、戊二醛、乙醇和丙酮：西隴化工股份有限公司；餓酸固定液、醋酸鈾和檸檬酸鉛：天津市大陸化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

牛津杯：上海橋星貿易有限公司；TGL-24MC臺式高速冷凍離心機：杭州艾普儀器設備有限公司；AS.3Y分析天平：中科先創科技（深圳）有限公司；PHS-300型臺式酸度計：江蘇盛奧華環保科技有限公司；日立H-7650透視電鏡：上海鑄金分析儀器有限公司。

2 方法

2.1 紫甘藍提取物的制備

利用向延菊等[5]報道的方式對紫甘藍提取物進行制備，得到的紫甘藍提取物溶液在40℃的真空干燥箱中干燥，從而得到紫甘藍提取物干粉。

2.2 菌懸液的制備

從凍存管中取100 μL菌液在TSA培養基中三區劃線，供試菌株的純化。挑取單菌落，在LB培養基中擴大培養，培養條件為37℃，20 h。取2 mL上述培養液，在8 500 r/min下離心10 min，小心除去上清液，并用生理鹽水進行洗滌，最后將得到的菌泥溶于1 mL生理鹽水中，制成細胞懸液，并調整濃度達到7.0 logCFU/mL[6]。

2.3 紫甘藍提取物抑菌效果的測定

利用牛津杯法評估紫甘藍提取物的抑菌效果，首先配制TSA培養基，涂布供試菌株，在無菌環境下將3只牛津杯（內徑6 mm、外徑8 mm、高10 mm）均勻的垂直放置在TSA培養基中，配制3%的紫甘藍提取物溶液加到牛津杯中，之后在37℃條件下培養24 h，最后計算抑菌圈大小[7]，相同pH值下的鹽酸和無菌蒸餾水處理組為對照組。

2.4 紫甘藍提取物MIC值計算及熱穩定性試驗

調整紫甘藍提取物的濃度為：0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%，取7.0 logCFU/mL的菌液進行MIC的測定，具體步驟參考趙敏等[8]的報道。將MIC的紫甘藍提取在 60、70、80、90 ℃和 100 ℃下分別處理 10、20、30 min，計算紫甘藍提取物在不同溫度處理后的抑菌率。

2.5 透射電鏡試驗

為了了解紫甘藍對食源性致病菌的抑制作用，分別對用LB肉湯培養和含有0.5%紫甘藍提取物的生理鹽水對金黃色葡萄球菌和空腸彎曲桿菌進行處理，培養1 h后利用透視電鏡觀察供試菌株細胞變化，整個過程包括取材、固定、脫水、浸透、包埋、修塊、切片、正染色和透視電鏡觀察[9]。

3 結果與分析

3.1 紫甘藍提取物抑菌效果的評估

利用牛津杯法評估紫甘藍提取物對供試食源性致病菌的抑菌效果，結果如表1所示。

表1 紫甘藍提取物抑制效果評估Table 1 The inhibition effect assessment of purple cabbage extract

由表1可知，0.3%紫甘藍提取物對7種食源性致病菌都具有較好的抑菌作用，其中對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌效果最好，抑菌圈的直徑大于14.0 mm，對蠟樣芽孢桿菌和阪崎克羅諾桿菌的抑菌效果較差，抑菌圈為10.0 mm～12.0 mm。為了分析紫甘藍提取物抑菌效果和pH值的關系，以相同pH值的HCl為對照組，HCl（pH=3.02）對7種食源性致病菌有一定的抑菌效果，但是遠低于紫甘藍提取物，這表明紫甘藍提取物對供試菌株的抑菌作用與其pH值有一定的關系，但是并不能完全解釋其抑菌機理。

3.2 紫甘藍提取物對食源性致病菌的MIC

紫甘藍提取物對食源性致病菌的MIC結果如表2所示。

由表2可知，紫甘藍提取物對大腸桿菌和沙門氏菌的MIC為0.2%，對金黃色葡萄球菌、空腸彎曲桿菌和單增李斯特氏菌的MIC為0.3%，對蠟樣芽孢桿菌和阪崎克羅諾桿菌的MIC為0.4%，上述結果和3.1中對紫甘藍提取物抑菌效果評估的結果趨勢一致。

表2 紫甘藍提取物對供試菌種的MICTable 2 The MIC of purple cabbage extract to tested strains

3.3 紫甘藍提取物熱穩定分析

對紫甘藍提取物進行不同溫度的熱處理，并計算其抑菌率，結果如表3所示。

由表3可知，紫甘藍提取物的抑菌效果隨著處理溫度的提高而降低，當80℃處理30 min時，紫甘藍提取物對金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、空腸彎曲桿菌、阪崎克羅諾桿菌和單增李斯特氏菌的抑菌率為0，當紫甘藍提取物在90℃下處理30 min或100℃下處理10 min時，紫甘藍提取物對所用供試菌株失去抑菌作用。紫甘藍提取物熱穩定分析結果表明紫甘藍提取物在大于80℃的高溫處理下會導致失活。

3.4 透視電鏡分析

表3 溫度對紫甘藍提取物抑菌效果的影響Table 3 The influence of temperature on bacteriostatic effect of purple cabbage extract

圖1 透視電鏡分析結果Fig.1 The results of the analysis of SEM

0.5%紫甘藍提取物處理后的金黃色葡萄球菌和空腸彎曲桿菌的透視電鏡分析結果如圖1所示。

由圖1可知，經過0.5%紫甘藍提取物的處理，金黃色葡萄球菌和阪崎克羅諾桿菌的細胞壁被破壞，菌體形態發生了改變，細胞內部的細胞液外泄，這說明紫甘藍提取物通過破壞供試菌株的細胞壁，使其細胞液排出而發揮其抑菌效果。

4 結論與討論

紫甘藍提取物對7種食源性致病菌具有較好的抑菌作用，但是紫甘藍提取物對熱的穩定性較差，當溫度大于90℃時，20 min的處理就會導致抑菌作用消失，這可能是因為在高溫下紫甘藍提取物中的活性物質，包括有機酸、多酚、花青素和黃酮類化合物會揮發或失活，這啟示我們在提取紫甘藍提取物和發揮其抑菌作用的過程中要避免高溫處理。同時，相同pH值鹽酸對食源性致病菌也具有一定的抑菌作用，這說明紫甘藍提取物的抑菌作用與其較低的pH值有關。

同時，在相同的pH值作用下，紫甘藍提取物的抑菌效果優于HCl，這說明紫甘藍提取物的抑菌效果還另有原因。透視電鏡分析表明供試菌株的細胞形態被破壞、細胞液外泄，這些結果和已有的研究結果相似[6，9]，這說明紫甘藍提取物中有機酸和多酚類物質發揮了抑菌作用。有機酸作為小分子可以透過菌體的細胞壁和細胞膜，從而改變細胞內的pH值，導致細胞形態發生變化，其次多酚類物質可以改變細胞膜的通透性，從細胞液排除，從而導致菌體的死亡[10-11]。

[1]李昌文,張麗華,縱偉,等.紫甘藍蔬菜紙片加工工藝的研究[J].食品研究與開發,2016,37(20)：115-118

[2]任虹,李婷,李強,等.加熱方法對紫甘藍花色苷組分及其清除自由基活性的影響[J].中國食品學報,2016,16(6)：231-240

[3]張會香,楊世軍,梁閃坐.紫甘藍色素的抑菌性和抗氧化性研究[J].食品工業,2010(4)：64-66

[4]楊曉玲,郭彥東.紫甘藍色素的穩定性及抑菌性[J].食品科學,2010,31(23)：32-35

[5]向延菊,白紅進,張美娥,等.黑果枸杞果實提取物的抑菌效果研究[J].食品研究與開發,2016(1)：26-29

[6]徐春華.牡丹花提取物抑菌作用的研究[J].食品研究與開發,2016,37(15)：163-165

[7]劉冬梅,李理,楊曉泉,等.用牛津杯法測定益生菌的抑菌活力[J].食品研究與開發,2006,27(3)：110-111

[8]趙敏,譚鋼文,唐小異,等.十種中藥提取物與抗生素合用對銅綠假單胞菌最小抑菌濃度影響的體外實驗[J].湖南師范大學學報(醫學版),2011,8(4)：80-83

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[10]Kim T J,Silva J L,Weng W L,et al.Inactivation of Enterobacter sakazakii by water-soluble muscadine seed extracts[J].International Journal of Food Microbiology,2009,129(3)：295-299

[11]錢麗紅,陶妍,謝晶.茶多酚對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌機理[J].微生物學通報,2010,37(11)：1628-1633

Bacteriostatic Effect of Purple Cabbage Extract to Foodborne Pathogenic Bacteria

CHEN Ying-hui
（Department of Food and Chemical Engineering，Yongcheng Vocational College，Yongcheng 476600，Henan，China）

Seven foodborne pathogenic bacteria were chosen as the tested strains.The oxford cup method was used to evaluate the antibacterial activity of the purple cabbage extract.The minimum inhibitory concentration（MIC）of of purple cabbage extract to tested strains were calculated.The thermal stability of purple cabbage extract was analyzed.Finally，bacteriostatic mechanism of purple cabbage extract was revealed using perspective electron microscopy（SEM）.The results showed that purple cabbage extract had a good bacteriostatic effect to 7 foodborne pathogenic bacteria.The bacteriostatic effects of purple cabbage extract to Escherichia coli and Salmonella were best（MIC=0.2%），meanwhile,the bacteriostatic effects of purple cabbage extract to Bacillus cereus and Cronobacter sakazakii were worst（MIC=0.4%）.The bacteriostatic effect of purple cabbage extract was favourable under less than 60℃，which was inactivated thoroughly with the treatment of 90℃，20 min.Purple cabbage extract played a bacteriostatic role through lower pH and damaging cell morphology and cell membrane permeability.

purple cabbage extract；bacteriostatic effect；minimum inhibitory concentration；thermal stability；perspective electron microscopy

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.008

2017-03-19

陳穎慧（1981—），女（漢），講師，碩士研究生，研究方向：食品科學與工程。