動物源性食品中呋喃它酮代謝物酶聯(lián)免疫檢測方法的建立

劉靜靜

摘要：建立了呋喃它酮代謝物（AMOZ）在動物源性食品中殘留的酶聯(lián)免疫吸附檢測法（ELISA）。本研究應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備抗呋喃它酮代謝物的衍生物（CPAMOZ）單克隆抗體，測定單抗特性，并初步應(yīng)用于AMOZ的ELISA方法檢測。融合后得到1株穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株AMOZ-2F7，應(yīng)用于酶聯(lián)免疫吸附法，在0.0975—6.25μg/L范圍內(nèi)呈較好的線性，半數(shù)抑制濃度（IC₅₀）為1.011μg/L，與其他幾種結(jié)構(gòu)類似物無交叉反應(yīng)。本研究建立了AMOZ檢測的ELISA方法，可以實現(xiàn)樣品的快速檢測。

關(guān)鍵詞：呋喃它酮代謝物；單克隆抗體；酶聯(lián)免疫吸附法

1主要試劑及儀器

HAT，HT，鼠單抗分型試劑盒，Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司；SP2/0細胞，本實驗室保存。其他試劑均為國產(chǎn)分析純；二氧化碳培養(yǎng)箱，日本三洋；凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀，美國Bio-TEK；96孔、24孔培養(yǎng)板，Cost～公司。CPAMOZ-BSA、CPAMOZ-OVA本研究室自制。

2實驗方法

2.1單克隆抗體的制備及特性鑒定

CPAMOZ-BSA免疫Balb/C小鼠共4次，ELISA方法檢測血清，選擇效價高、敏感性好的小鼠用于融合。經(jīng)篩選、亞克隆，建立穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株，并擴大培養(yǎng)，誘生腹水，經(jīng)辛酸一硫酸銨沉淀法純化，-20℃保存。對單克隆抗體的效價、敏感性、亞型進行測定。

2.2ELISA方法的優(yōu)化

2.2.1抗原抗體最適濃度的確定

采用方陣滴定法，橫向用梯度濃度的包被原包被，縱向加入倍比稀釋的單克隆抗體，用間接ELISA法測定吸光度值。

2.2.2抗原抗體最適反應(yīng)時間的選擇

本研究選用10min、20min、30min、45min、60min作為一抗的作用時間，用間接競爭ELISA法測定IC₅₀值，選擇最佳反應(yīng)時間。

2.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用最佳ELISA工作條件，加入系列稀釋的NPAMOZ，用間接競爭ELISA法測定吸光度值。

2.2.4特異性的測定

采用競爭ELISA分別檢測抗AMOZ單克隆抗體與其他幾種結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)，計算交叉反應(yīng)率（Cross reaction，CR），CR=（NPAMOZ的IC₅₀/結(jié)構(gòu)類似物的IC₅₀）×100。根據(jù)CR值判定單抗的特異性。

3結(jié)果與討論

3.1單抗的制備及特性鑒定

融合后經(jīng)篩選得到1株穩(wěn)定分泌抗體且特異性較好的細胞株，命名為2F7。腹水純化后經(jīng)檢測，效價達到1：1×106。用間接競爭ELISA檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，計算半數(shù)抑制質(zhì)量濃度（IC₅₀）為1.084μg/L。單抗亞型經(jīng)測定，與IgG1二抗反應(yīng)的吸光度值最高，證明抗體為IgG1型。

3.2ELISA方法的優(yōu)化

3.2.1抗原抗體工作濃度的確定

按抗原抗體1：40000、1μg/mL，1：20000、0.5μg/mL，1：10000、0.25μg/mL 3組濃度，用間接競爭ELISA檢測。隨著包被濃度的降低，抑制曲線在上移，IC₅₀值在上升，抗體1：40000和1：20000的曲線比較接近，且抗體1：20000時線性較好，綜合考慮，選擇抗原0.5μg/mL、抗體1：2萬作為AMOZ的ELISA法最佳抗原抗體濃度。

3.2.2抗原抗體反應(yīng)時間的選擇

隨著抗體和抗原作用時間的增加，抑制曲線呈下移趨勢，且45-60min變化不大，綜合考慮，選擇線性較好的45min，作為AMOz間接競爭ELISA的一抗作用時間。

3.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

按照ELISA最佳工作條件，以NPAMOZ為橫坐標(biāo)，以B/B0（B代表不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的A_450mm，B0代表陰性對照的A_450mm）為縱坐標(biāo)，繪制抗體的抑制曲線。如圖1所示，AMOZ ELISA試劑盒在O.0975-6.25pg/L范圍內(nèi)呈線性，IC50=1.01log/L，線性方程Y=-0.399X+0.5019，R2=0.992。

3.2.4特異性的測定

采用間接競爭ELISA法檢測，AMOZ-2F7抗體與NPAHD、NPAOZ、NPSEM、4-CBA的交叉反應(yīng)率均小于0.01%，證明單抗與其他幾種結(jié)構(gòu)類似物不發(fā)生反應(yīng)，該方法具有很高的特異性。

4結(jié)論

呋喃它酮屬于小分子物質(zhì)，沒有免疫原性，所以在抗體制備過程中用對羧基苯甲醛將其衍生成CPAMOZ，再通過活化酯法將其衍生物與大分子載體蛋白進行連接，使其具備免疫原性。小分子抗原在雜交瘤細胞篩選過程中常出現(xiàn)效價高、敏感性差的結(jié)果。本實驗用不同批次免疫原多次免疫、多次融合，以提高分泌強陽性、高抑制抗體的融合細胞數(shù)量。經(jīng)過篩選，最終得到1株穩(wěn)定分泌抗體的細胞，單抗AMOZ-2F7經(jīng)檢測，效價達到1：1×10⁶。將該抗體應(yīng)用于ELISA方法檢測，在0.0975-6.25μg/L范圍呈現(xiàn)較好線性，ICso為1.011μg/L，與其他結(jié)構(gòu)類似物無交叉反應(yīng)。本研究得到的抗體特異性好、敏感性高，建立了ELISA檢測方法，呈現(xiàn)較好性能，為免疫學(xué)檢測技術(shù)研究和動物源性食品中獸藥殘留的快速檢測奠定了基礎(chǔ)。

（作者單位：河北省科學(xué)院生物研究所）