HPV16陽性和陰性患者宮頸癌組織中miR-27a-3p和HOXB8蛋白的表達差異及其機制研究

李會影，王慧智，張子旸（牡丹江醫學院附屬紅旗醫院婦產科，黑龍江牡丹江 157011）

·精準醫療·

HPV16陽性和陰性患者宮頸癌組織中miR-27a-3p和HOXB8蛋白的表達差異及其機制研究

李會影＊，王慧智，張子旸#（牡丹江醫學院附屬紅旗醫院婦產科，黑龍江牡丹江 157011）

目的：探討miR-27a-3p和同源盒B8（HOXB8）蛋白在人乳頭瘤病毒16型陽性[HPV16（+）]和陰性[HPV16（－）]患者宮頸癌組織中表達的差異及其機制。方法：選取2012年1月－2016年1月于我院就診的宮頸癌患者120例，根據其是否感染HPV16分為HPV16（+）組（60例）和HPV16（－）組（60例）。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應法檢測兩組患者宮頸癌組織中miR-27a-3p和HOXB8 mRNA的表達水平，采用蛋白印跡法檢測HOXB8蛋白的表達水平，采用巢式降落式甲基化特異性聚合酶鏈反應法檢測miR-27a-3p啟動子區DNA甲基化水平，采用染色質免疫共沉淀-定量聚合酶鏈反應法檢測miR-27a-3p啟動子區組蛋白甲基化水平；培養人宮頸癌細胞系SiHa細胞株，考察轉染miR-27a-3p模擬物（mimic）和抑制物（inhibitor）后miR-27a-3p和HOXB8 mRNA的表達水平。結果：HPV16（+）組患者宮頸癌組織中miR-27a-3p的表達水平顯著低于HPV16（－）組患者，HOXB8 mRNA和蛋白表達水平、miR-27a-3p啟動子區DNA甲基化水平和組蛋白甲基化水平均顯著高于HPV16（－）組患者，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。在SiHa細胞轉染miR-27a-3p mimic后，miR-27a-3p的表達水平顯著升高，而HOXB8 mRNA的表達水平顯著降低；轉染miR-27a-3p inhibitor后，miR-27a-3p的表達水平顯著降低，而HOXB8 mRNA的表達水平則顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）。結論：HPV16可能通過啟動子區DNA甲基化和組蛋白甲基化下調miR-27a-3p的表達，從而影響宮頸癌的發生與發展，HOXB8蛋白可能是其作用靶點。

人乳頭瘤病毒16型；宮頸癌；miR-27a-3p；同源盒B8蛋白；DNA甲基化；組蛋白甲基化

宮頸癌是女性生殖系統惡性腫瘤，在世界范圍內的發病率和病死率均較高，嚴重威脅女性生命健康[1-2]。人乳頭瘤病毒16型（Human papilloma virus type 16，HPV16）是最普遍、最致命的HPV類型之一，也是誘發宮頸癌的主要原因[3]。同源盒B8（Homeobox B8，HOXB8）是HOX蛋白家族成員，其表達水平在HPV16陽性[HPV16（+）]宮頸癌組織中顯著升高，但具體機制尚未闡明[4]。微RNA（MicroRNAs，miRNAs）是一類內源性小分子非編碼RNA，可在轉錄后調控基因的表達[5]。研究表明，多種miRNAs通過調控靶基因的表達參與宮頸癌的發生與發展，其中miR-27a-3p可調控HOXB8基因的表達[6-8]。現有研究多集中于miRNAs的調控作用，而忽視了miRNAs表達變化的機制。DNA甲基化和組蛋白甲基化是表觀遺傳學調控的重要方式[9-10]，其是否參與miRNAs的表達調控仍不清楚。因此，本研究以HPV16（+）和HPV16陰性[HPV16（－）]宮頸癌患者為研究對象，探討miR-27a-3p的表達變化及其機制，并考察其對HOXB8蛋白是否具有調控作用。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 QuantStudio Q3型實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）儀（美國Applied Biosystems公司）；Mastercycler Nexus Eco型普通PCR儀、547R型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；Powerpac HV Power Supply型電泳儀（美國BioRad公司）；FCM型凝膠成像系統（美國Protein Simple公司）；DLHR-D1603型電動勻漿器（華鄰科技有限公司）；HR900-ⅡA2型生物安全柜（海爾生物醫療）。

1.1.2 試劑 胎牛血清（FBS）、opti-MEM無血清培養基、青鏈霉素和高糖培養基（DMEM）（美國Gibco公司，批號分別為12483-012、51985042、15240-062、12491-015）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國Hyclone公司，批號：SH30256.01B）；聚山梨酯20（美國BioRad公司，批號：170-6531）；DNA提取試劑盒、總RNA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑盒（含SYBR Green、ddH2O）（美國Qiagen公司，批號分別為69506、74104、204054）；逆轉錄試劑盒及發光液（美國ThermoFisher公司，批號分別為K1691、32106）；DNA甲基化修飾試劑盒（北京天漠科技開發有限公司，批號：D5030）；miRNA提取試劑盒、miRNA逆轉錄試劑盒、miRNA熒光定量PCR試劑盒、miR-27a-3p及U6引物（天根生化科技有限公司，批號分別為DP501、KR201-02、FP401-02、CD201-0025、CD201-0145）；蛋白質提取及定量試劑盒、蛋白上樣緩沖液（江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號分別為KGP250、KGPBCA、KGP101）；anti-HOXB8、anti-H3K9me2（美國Abcam公司，批號分別為ab125727、ab120）；anti-β-actin及辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號分別為TA-09、SC-2048）；人工合成miR-27a-3p模擬物（mimic）、抑制物（inhibitor）及陰性對照（上海吉瑪制藥技術有限公司）；Lipo2000（美國Invitrogen公司，批號：11668027）；染色質免疫共沉淀試劑盒[含蛋白A/G瓊脂糖（Protein G Agarose），美國Millipore公司，批號：17-371]；普通引物由華大基因提供，HOXB8、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物及甲基化特異性引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；人宮頸癌細胞系Si-Ha細胞株購自美國模式培養物集存庫。

1.2 研究對象

納入標準：（1）于我院首次就診或接受治療的宮頸癌患者，經組織活檢及術后病理學檢查確診為宮頸癌；（2）既往無其他惡性腫瘤病史；（3）不合并其他惡性腫瘤；（4）術前未接受放療、化療或其他治療。排除標準：（1）年齡≤18歲者；（2）妊娠期婦女；（3）嚴重的肝腎功能障礙者；（4）合并不能有效控制的高血壓、糖尿病及心臟疾病等。本研究方案經醫院醫學倫理委員會審核通過，患者均知情同意并簽署知情同意書。

本研究共納入2012年1月—2016年1月于我院婦產科就診的宮頸癌患者120例，根據其是否感染HPV16分為HPV16（+）組和HPV16（－）組。其中，HPV16（+）組患者60例，年齡28～63歲，平均年齡（47.2±9.5）歲；HPV16（－）組患者60例，年齡25～59歲，平均年齡（45.7±8.3）歲。所有患者均留取手術切除的癌組織標本，于－80℃凍存，備用。

1.3 研究方法

1.3.1 實時熒光定量PCR法檢測miR-27a-3p和HOXB8 mRNA的表達水平 按照試劑盒說明書提取宮頸癌組織中的總miRNA和總mRNA，并將其逆轉錄為互補脫氧核糖核酸（cDNA）。其中，總miRNA的逆轉錄分為加多聚腺苷酸（PolyA）尾和逆轉錄兩部分。以cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR分析，反應體系包括cDNA 2 μL，上、下游引物各0.8 μL，SYBR Green 12.5 μL，ddH2O 8.9 μL，共25 μL。反應條件：95℃預變性5 min，1個循環；95℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環；產物經熔解曲線分析。HOXB8基因上游引物：5′-GTCCCTGCGCCCCAATTATTA-3′，下游引物：5′-GCCCGTGGTAGAACTCCTG-3′。HOXB8 mRNA相對表達水平以GAPDH的表達水平為參照，根據目的基因的相對表達量＝2－ΔΔCt計算結果，ΔΔCt＝[CtHOXB8－CtGAPDH]，計算HOXB8 mRNA的相對表達變化。miR-27a-3p相對表達水平以U6的表達水平為參照，根據目的基因的相對表達量＝2－ΔΔCt計算結果，ΔΔCt＝[CtmiR-27a-3p－CtU6]，計算miR-27a-3p的相對表達變化。式中，Ct（Cycle threshold）表示每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數。

1.3.2 蛋白質印跡（Western blotting）法檢測HOXB8蛋白的表達水平 將宮頸癌組織剪碎，冰上勻漿，以離心半徑6 cm、轉速5 000 r/min離心5 min，棄去上清，收集沉淀。按照蛋白提取試劑盒說明書提取宮頸癌組織的總蛋白，并進行蛋白定量。按體積比1∶4加入蛋白上樣緩沖液混勻，于100℃下反應5 min，使蛋白變性。取變性后的蛋白樣品5 μL，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳，切取大小約為32 kDa（HOXB8）和43 kDa（β-actin）的片段，分別進行半干轉膜操作。轉膜結束后，采用5%脫脂奶粉對聚偏二氟乙烯膜（PVDF）封閉2 h。分別與anti-HOXB8和anti-β-actin混合后，于4℃下孵育過夜。用磷酸緩沖鹽溶液-聚山梨酯（PBST，由PBS和聚山梨酯20配制）洗膜后，與HRP標記的二抗于室溫下孵育2 h，PBST洗膜后加發光液，于凝膠成像分析儀上成像并分析條帶灰度值。以β-actin的表達量為參照，計算HOXB8蛋白的相對表達水平。HOXB8蛋白的相對表達水平＝HOXB8灰度值/βactin灰度值。

1.3.3 巢式降落式甲基化特異性PCR（nMS-PCR）法檢測miR-27a-3p啟動子區DNA甲基化水平 按照試劑盒說明書提取宮頸癌組織的基因組DNA，并采用亞硫酸氫鹽法對基因組DNA進行甲基化修飾。在Ensembl Genome Browser（http：//www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi）中查找miR-27a-3p啟動子區序列并線上設計1對外引物和2對內引物（即甲基化引物和非甲基化引物）。外引物上游：5′-GGTTTTGTGTAGGGGAAATTTTATAG-3′，外引物下游：5′-CAACCCTATCCCCTTAAAATCTAAA-3′；甲基化引物上游：5′-TTGGGGTGAGATTATTTTTTTATTC-3′，甲基化引物下游：5′-CTAAAACCTAACTATACCCTCCGTT-3′；非甲基化引物上游：5′-GGGGTGAGATTATTTTTTTATTTGT-3′，非甲基化引物下游：5′-CTAAAACCTAACTATACCC-TCCATT-3′。外引物擴增的反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸30 s，20個循環，每個循環降0.5℃至52℃，72℃再延伸7 min。以外引物的PCR產物為模板，繼續進行內引物的擴增，其擴增反應條件同外引物。取PCR產物5 μL于2%瓊脂糖凝膠上進行電泳分析，并于凝膠成像分析系統成像，計算甲基化條帶及非甲基化條帶的光密度（OD），miR-27a-3p啟動子區DNA甲基化水平＝甲基化條帶的OD值/（甲基化條帶的OD值+非甲基化條帶的OD值）。

1.3.4 染色質免疫共沉淀-定量PCR（CHIP-qPCR）法檢測miR-27a-3p啟動子區組蛋白甲基化水平 將宮頸癌組織冰上勻漿后，以終體積分數為1%的甲醛室溫固定10 min。采用終濃度為0.125 mol/L甘氨酸作用5 min以終止交聯。以離心半徑6 cm、轉速5 000 r/min離心5 min后，棄去上清，PBS沖洗2遍。SDS裂解液重懸并裂解組織沉淀，冰上進行超聲破碎操作，使DNA破碎為100～1 000 bp大小的片段。以離心半徑6 cm、轉速12 000 r/min離心15 min后取上清液100 μL，加入anti-H3K9me2抗體，于4℃下孵育過夜，形成anti-H3K9me2-H3K9me2復合物；經蛋白A/G瓊脂糖結合沉淀后，形成Protein G Agarose-anti-H3K9me2-H3K9me2復合物，于65℃水浴中解除交聯，并采用DNA提取試劑盒、按說明書操作純化DNA，以純化后的DNA為模板，對miR-27a-3p啟動子區進行實時熒光定量PCR擴增反應。擴增反應體系及反應條件同“1.3.1”項，退火溫度為59℃。

1.3.5 細胞培養及轉染 用含10%FBS及1%抗生素的DMEM培養基，于37℃、5%CO2的培養箱中靜置培養SiHa細胞株。按每孔1×106個細胞鋪板：①取100 μL opti-MEM與適量Lipo2000混勻靜置5 min；②另取100 μL opti-MEM與適量miR-27a-3p mimic、inhibitor或陰性對照混勻靜置5 min；③將上述①②混勻后靜置20 min，加至細胞培養液中，于48 h后收集細胞，提取RNA進行后續試驗，步驟同“1.3.1”項。

1.4 統計學方法

應用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用Students’t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者宮頸癌組織中miR-27a-3p表達水平比較

HPV16（+）組患者宮頸癌組織中miR-27a-3p的表達水平顯著低于HPV16（－）組，差異有統計學意義（P＜0.01），詳見圖1。

2.2 兩組患者宮頸癌組織中HOXB8 mRNA和蛋白表達水平比較

圖1 兩組患者宮頸癌組織中miR-27a-3p表達水平比較Fig 1 Comparison of the expression of miR-27a-3p in cervical cancer tissue between 2 groups

HPV16（+）組患者宮頸癌組織中HOXB8 mRNA和蛋白的表達水平均顯著高于HPV16（－）組患者，差異均有統計學意義（P＜0.05），詳見圖2。

2.3 兩組患者宮頸癌組織中miR-27a-3p啟動子區DNA甲基化水平比較

圖2 兩組患者宮頸癌組織中HOXB8 mRNA和蛋白表達水平比較Fig 2 Comparison of the expression of HOXB8 mRNA and protein in cervical cancer tissues between 2 groups

在線（http：//www.urogene.org/methprimer/）查看miR-27a-3p啟動子區CpG位點和CpG島分布情況，結果顯示，miR-27a-3p啟動子區富含CpG島，詳見圖3。

HPV16（+）組患者宮頸癌組織中miR-27a-3p啟動子區DNA甲基化水平顯著高于HPV16（－）組患者，差異有統計學意義（P＜0.01），詳見圖4、圖5。

圖3 miR-27a-3p啟動子區CpG位點和CpG島分布情況Fig 3 Distribution of CpG islands and CpG sites in miR-27a-3p promoter region

2.4 兩組患者宮頸癌組織中miR-27a-3p啟動子區組蛋白甲基化水平比較

圖4 nMS-PCR產物電泳圖Fig 4 Electrophoretogram of nMS-PCR product

圖5 兩組患者宮頸癌組織中miR-27a-3p啟動子區DNA甲基化水平比較Fig 5 Comparison of DNA methylation levels of miR-27a-3p promoter region in cervical cancer tissues between 2 groups

HPV16（+）組患者宮頸癌組織中miR-27a-3p啟動子區組蛋白甲基化水平顯著高于HPV16（－）組患者，差異有統計學意義（P＜0.05），詳見圖6。

2.5 miR-27a-3p對HOXB8表達的影響

在人宮頸癌細胞系SiHa細胞株中分別轉染miR-27a-3p mimic和inhibitor后，檢測miR-27a-3p和HOXB8 mRNA表達的變化。結果顯示，在SiHa細胞轉染miR-27a-3p mimic后，miR-27a-3p的表達水平顯著升高，而HOXB8 mRNA的表達水平顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.01）；轉染miR-27a-3p inhibitor后，miR-27a-3p的表達水平顯著降低，而HOXB8 mRNA的表達水平則顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.01），詳見圖7。

圖6 兩組患者宮頸癌組織中miR-27a-3p啟動子區組蛋白甲基化水平比較Fig 6 Comparison of histone methylation levels of miR-27a-3p promoter region in cervical cancer tissues between 2 groups

3 討論

宮頸癌是女性生殖系統惡性腫瘤，HPV感染是引起宮頸癌的主要原因之一。HPV是一種雙鏈DNA病毒，低危險性HPV可引起良性的生殖器疣，而高危險性HPV與宮頸癌的發生與發展密切相關。其中，HPV16是HPV最常見的類型，是導致宮頸癌的重要因素[3，11-12]。本研究以HPV16（+）和HPV16（－）宮頸癌患者為研究對象，初步探討HPV16的致病機制。

圖7 miR-27a-3p對HOXB8表達的影響Fig 7 Effect of miR-27a-3p on the expression of HOXB8

3.1 HOXB8與miRNAs

HOXB8是同源盒家族成員，能夠編碼具有HOX DNA結合結構域的核蛋白。研究表明，HOXB8與結直腸癌、胃癌和宮頸癌的發生、發展密切相關[4，13-14]。本研究結果顯示，在HPV16（+）宮頸癌患者組織中HOXB8的表達水平顯著升高，與文獻[4]報道一致，但其具體機制尚不清楚。miRNAs是一類大小約為18～22個核苷酸的內源性小分子非編碼RNA，可通過結合靶mRNA 3′-非翻譯（UTR）區使其降解或翻譯一致，從而實現在轉錄后調控基因表達的目的。Yang H等[15]研究發現，miR-497可靶向轉酮酶調控宮頸癌對鉑化療的敏感性；Zhou N等[16]研究發現，miR-138可通過調控人端粒逆轉錄酶（hTERT）的表達水平抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲；Lai XJ等[17]研究表明，miR-421可通過下調Bcl-xL從而介導c-33a宮頸癌細胞的凋亡，這提示多種miRNAs可通過調控靶基因的表達參與宮頸癌的發生與發展。本研究結果顯示，在人宮頸癌細胞系SiHa細胞株中，轉染miR-27a-3p mimic（即過表達miR-27a-3p）后，HOXB8 mRNA的表達水平顯著降低；而轉染miR-27a-3p inhibitor（即抑制miR-27a-3p的表達）后，HOXB8 mRNA的表達水平顯著升高，提示miR-27a-3p可能直接或間接靶向調控HOXB8的表達，但具體機制尚有待進一步研究。

3.2 miRNAs與表觀遺傳學修飾

以往研究多集中于miRNAs對其靶基因的調控作用，而忽視了miRNAs表達變化的機制。表觀遺傳學修飾是指在基因核苷酸序列不發生改變的情況下，基因表達發生可逆、可遺傳的改變。表觀遺傳的現象很多，已知的有DNA甲基化（DNA methylation）、組蛋白甲基化（Histone methylation）、基因組印記（Genomic imprinting）、母體效應（Maternal effects）、基因沉默（Gene silencing）、核仁顯性、休眠轉座子啟動和RNA編輯（RNAediting）等[18]。其中，DNA甲基化和組蛋白甲基化是表觀遺傳學調控的重要方式，文獻報道DNA甲基化和H3K9me2均為基因沉默的標志，且二者可能具有協同調控基因表達的作用[9，19]。趙麗等[20]研究表明，miR-124啟動子區DNA甲基化在動脈粥樣硬化的發生與發展過程中發揮了重要的作用。然而，DNA甲基化和組蛋白甲基化是否參與HPV16（+）宮頸癌組織miR-27a-3p的表達調控仍不清楚。本研究結果顯示，HPV16（+）組患者宮頸癌組織中miR-27a-3p啟動子區DNA和組蛋白甲基化水平均顯著高于HPV16（－）組患者，提示DNA甲基化和組蛋白甲基化參與了HPV16（+）宮頸癌組織中miR-27a-3p的表達調控。DNA甲基化和組蛋白甲基化的發生需要相應酶的催化，如DNA甲基轉移酶1（DNMT1）、組蛋白甲基化酶G9a等，但其在HPV16（+）宮頸癌中是否發生改變尚需進一步研究。

綜上所述，HPV16可能通過啟動子區DNA甲基化和組蛋白甲基化下調miR-27a-3p的表達，從而影響宮頸癌的發生與發展；HOXB8蛋白可能是其作用靶點，HOXB8基因可能是miR-27a-3p的靶基因。本研究為HPV16（+）宮頸癌患者的臨床治療提供了理論基礎和治療靶點。但miR-27a-3p啟動子區發生DNA甲基化和組蛋白甲基化的機制仍不明確，還需后續深入研究。

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（編輯：張元媛）

Expression Difference and Its Mechanism Study of miR-27a-3p and HOXB8 Protein in Cervical Cancer Tissues of HPV16-positive and HPV16-negative Patients

LI Huiying，WANG Huizhi，ZHANG Ziyang（Dept.of Obstetrics and Gynecology，Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College，Heilongjiang Mudanjiang 157011，China）

OBJECTIVE：To investigate the expression difference and its mechanism of miR-27a-3p and HOXB8 protein in cervical cancer tissues of HPV16-positive and HPV16-negative patients.METHODS：A total of 120 patients with cervical cancer in our hospital during Jan.2012-Jan.2016 were divided into HPV16-positive group（60 cases）and HPV16-negative group（60 cases）according to HPV16 infection situation.The expression of miR-27a-3p mRNA and HOXB8 mRNA in cervical cancer tissue were detected by RT-qPCR.The expression of HOXB8 protein was detected by Western blotting assay.DNA methylation level of miR-27a-3p promoter region was detected by nested-down methylation specific PCR（nMS-PCR）.Histone methylation level of miR-27a-3p promoter region was detected by chromatin immunoprecipitation PCR（CHIP-PCR）.The expression of miR-27a-3p mRNA and HOXB8 mRNA were detected after transfecting miR-27a-3p mimic and inhibitor into Human cervical cancer cell line SiHa，respectively.RESULTS：The expression of miR-27a-3p in HPV16-positive group was significantly lower than HPV16-negative group，while HOXB8 mRNA and protein expression，DNA and histone methylation levels of miR-27a-3p promoter region were significantly higher than HPV16-negative group，with statistical significance（P＜0.05 or P＜0.01）.After transfecting miR-27a-3p mimic into SiHa cells，the expression of miR-27a-3p was increased significantly，while that of HOXB8 mRNA was decreased significantly；after miR-27a-3p inhibitor transfection，the expression of miR-27a-3p was decreased significantly，while that of HOXB8 mRNA was increased significantly，with statistical significance（P＜0.01）.CONCLUSIONS：HPV16 may down-regulate the expression of miR-27a-3p through DNA methylation and histone methylation of promoter region，so as to influence the generation and development of cervical cancer.HOXB8 may be the target protein of miR-27a-3p.

Human papilloma virus type 16；Cervical cancer；miR-27a-3p；Homeobox B8 protein；DNA methylation；Histone methylation

R711.74

A

1001-0408（2017）23-3169-06

2016-12-22

2017-06-15）

＊副主任醫師，碩士。研究方向：婦產科學。電話：0453-6602036。E-mail：huiying26@163.com

#通信作者：副主任醫師。研究方向：婦產科學。電話：0453-6602036。E-mail：1403355759@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.23.01