酶輔助堿解豬毛提取角蛋白工藝優(yōu)化

郭思亞，向鵬妍，吳 婷，孟 婧，張

（成都大學(xué)肉類加工四川省重點(diǎn)實驗室，四川成都610106）

酶輔助堿解豬毛提取角蛋白工藝優(yōu)化

郭思亞，向鵬妍，吳 婷，孟 婧，*張

（成都大學(xué)肉類加工四川省重點(diǎn)實驗室，四川成都610106）

為了提高化學(xué)法水解豬毛提取角蛋白效率，探討了采用酶輔助堿解法提取豬毛中角蛋白工藝，并對提取工藝進(jìn)行了響應(yīng)面法優(yōu)化。通過比較鹽酸和氫氧化鈉對豬毛的水解效果，發(fā)現(xiàn)氫氧化鈉更有利于角蛋白的提取。通過比較酶輔助氫氧化鈉水解豬毛，發(fā)現(xiàn)酶輔助堿解豬毛顯著（p＜0.05）提高了角蛋白的提取效率。采用響應(yīng)面法對酶輔助堿解工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出堿濃度和堿解時間的共同作用對角蛋白的提取有顯著影響（p＜0.05）。擬合顯著性及驗證結(jié)果顯示，所建立的擬合模型具有可靠性。根據(jù)擬合模型，對酶輔助堿解工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出堿濃度0.4 mol/L，堿解時間3 h時，酶輔助堿解效果最好。

豬毛；酶解；工藝優(yōu)化

我國是生豬生產(chǎn)大國，生豬屠宰產(chǎn)生的豬毛副產(chǎn)物較多。目前，國內(nèi)的生豬屠宰企業(yè)對豬毛的回收利用較少，大多作為屠宰副產(chǎn)物被丟棄[1]。豬毛中角蛋白含量較高[2]。角蛋白是一種材料力學(xué)特性良好的生物可降解天然高分子，因其半胱氨酸含量高，含有二硫鍵，所以分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，堅固性和彈性好[3]，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、輕工業(yè)及日用化妝品等領(lǐng)域[4-7]。如果能將豬毛中的角蛋白回收利用，不僅可減少生豬屠宰企業(yè)的廢棄物排放量，而且可充分利用生豬屠宰副產(chǎn)物，降低生豬生產(chǎn)成本[2]。為此，國內(nèi)外研究人員對豬毛中角蛋白的提取工藝展開了廣泛研究。

羅海波等人[8]采用尿素-焦亞硫酸鈉降解制革廢棄豬毛制備角蛋白，得出在pH值6.5，焦亞硫酸鈉濃度1.0 mol/L，尿素濃度14 mol/L，十二烷基硫酸鈉濃度0.2 mol/L，時間8 h時水解效果較好；Joua C J G等人[9]采用微波輔助酸解法水解豬毛，結(jié)果發(fā)現(xiàn)較傳統(tǒng)的加熱條件下酸水解工藝的水解效果更優(yōu)；朱廣軍[10]研究了從豬毛中制取胱氨酸的新工藝，在控制pH值、活性炭用量條件下，豬毛中胱氨酸的得率達(dá)7.5%。但是，目前國內(nèi)外采用酶輔助堿解法提取豬毛角蛋白的研究少有報道。為此，探討了酶輔助堿解豬毛提取角蛋白工藝，以期為建立低污染的提取豬毛中角蛋白工藝提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

THZ-82型水浴恒溫振蕩器，常德澳華儀器有限公司產(chǎn)品；FE20-FiveEasyTM型pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；HZ85-2型磁力攪拌器，北京中興偉業(yè)儀器有限公司產(chǎn)品；XW-80A型渦旋混合器，江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠產(chǎn)品；UV-1800PC型紫外可見分光光度計，上海精密儀器儀表有限公司產(chǎn)品；PH2000型生物顯微鏡，鳳凰光學(xué)控股有限公司產(chǎn)品。

試驗所用豬毛，由四川欣康綠食品有限公司提供；牛血清蛋白（＞98%）、木瓜蛋白酶（≥50× 104U/g），北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；酒石酸鉀鈉、硫酸銅、碘化鉀及鹽酸（33%～36%），成都科龍化工試劑廠提供；氫氧化鈉，成都金山化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

參考李中和[11]的方法，按照水與30%氫氧化鈉溶液10∶1的比例混合，控制pH值在8.5～9.0。然后加入一定量的豬毛，剛好使其淹沒，不斷攪拌2 h后，濾去污水，用自來水反復(fù)沖洗，至溶液呈現(xiàn)中性為止（pH值7）。將豬毛晾干，在121℃高溫滅菌25 min，然后剪碎（長度大約1 cm），封口袋包裝，于室溫下貯藏。

1.2.2 酸堿水解豬毛效果比較

酸堿濃度均為0.2，0.4，0.8，1.6，2.0 mol/L，分別配制各濃度鹽酸及氫氧化鈉溶液50 mL于100 mL錐形瓶中，將各個錐形瓶依次加入1.0 g豬毛，并用錫箔紙封口，同時置于水浴鍋中，在溫度80℃條件下，分別水解2，4，6，8 h。到達(dá)相應(yīng)時間后，取出水解液，待溫度降至室溫后，分別用等摩爾量的酸或堿調(diào)節(jié)酶解液pH值至7，加蒸餾水定容至100 mL，吸取濾液。將所得的樣品溶液各取0.5 mL到不同試管中，采用雙縮脲法測蛋白質(zhì)含量[12]。

1.2.3 堿解與酶輔助堿解對比試驗

對單獨(dú)堿解和酶輔助堿解的水解效果進(jìn)行比較。分別配制不同濃度的堿溶液50 mL于100 mL錐形瓶中，置于水浴鍋中，在80℃下水解2 h和4 h。水解結(jié)束待錐形瓶冷卻后用等摩爾量的酸中和至pH值7，定容至100 mL。只用堿解的樣液直接過濾測定吸光度；酶輔助堿解的樣液加入0.1 g木瓜蛋白酶，在振蕩水浴鍋中，于55℃下水浴4 h，水浴完后過濾再測定吸光度，以木瓜蛋白酶的酸堿中和液為空白。

1.2.4 酶輔助堿解單因素試驗

（1）堿濃度對酶輔助堿解試驗結(jié)果的影響。豬毛用量1.0 g，在堿濃度0.2，0.4，0.8，1.6，2.0 mol/L條件下，分別堿解2 h，調(diào)節(jié)酶解液pH值至7，添加0.1 g木瓜蛋白酶，于55℃下水浴4 h，水浴完后過濾再測定吸光度，以木瓜蛋白酶的酸堿中和液為空白。

（2）堿解時間對酶輔助堿解試驗結(jié)果的影響。豬毛用量1.0 g，根據(jù)1.2.4（1）得出的最佳水解豬毛堿濃度，分別堿解1，2，3，4，5，6 h，然后調(diào)節(jié)水解液pH值至7，添加0.1 g木瓜蛋白酶，于55℃下水浴4 h，過濾再測定吸光度，以木瓜蛋白酶的酸堿中和液為空白。

1.2.5 酶輔助堿解優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以水解液蛋白含量為響應(yīng)值，選取堿溶液濃度和堿解時間為影響因子，采用一中心三水平旋轉(zhuǎn)設(shè)計，對酶輔助堿解豬毛工藝進(jìn)行優(yōu)化。

優(yōu)化試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 優(yōu)化試驗因素與水平設(shè)計

1.2.6 豬毛堿解后的表面特征分析

采用PH2000型生物顯微鏡，對堿解不同時間后豬毛的表面結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行觀察。

1.2.7 數(shù)據(jù)計算與處理

采用SAS 9.0對數(shù)據(jù)的顯著性進(jìn)行分析，采用Excel 2010對分析結(jié)果進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 酸和堿對豬毛水解提取角蛋白效果比較

由于豬毛難以被酶直接分解，所以首先采用酸或堿處理來破壞其天然結(jié)構(gòu)，以便進(jìn)一步酶解。為了選擇一種更有效破壞豬毛天然結(jié)構(gòu)的方法，根據(jù)文獻(xiàn)報道[13]，采用鹽酸和氫氧化鈉水解豬毛，并對兩者的水解效果進(jìn)行比較。

酸解與堿解對比試驗結(jié)果見圖1。

圖1 酸解與堿解對比試驗結(jié)果

由圖1可知，在相同堿濃度和水解時間條件下，堿解豬毛產(chǎn)生角蛋白的量均優(yōu)于酸解。豬毛中胱氨酸及精氨酸含量豐富[14]。胱氨酸通過在豬毛蛋白的肽鏈間形成二硫鍵而起到鏈接平行肽鏈的作用，而精氨酸更多的是存在于肽鏈中。當(dāng)酸解豬毛時，盡管鹽酸容易破壞二硫鍵，但不能很快使豬毛中的肽鏈斷裂。氫氧化鈉雖然對二硫鍵的破壞較鹽酸弱，但可以有效促進(jìn)肽鏈中精氨酸與其他氨基酸的鏈接處發(fā)生水解，導(dǎo)致豬毛天然結(jié)構(gòu)的破壞。這可能是出現(xiàn)圖1中氫氧化鈉較鹽酸對豬毛有更好水解效果的原因。

2.2 堿解與酶輔助堿解對比

為了進(jìn)一步比較酶輔助堿解豬毛提取角蛋白的水解效果，選擇氫氧化鈉濃度0.8 mol/L，在堿解豬毛基礎(chǔ)上，添加酶對豬毛進(jìn)行水解。

堿解與酶輔助堿解對比試驗見圖2。

圖2 堿解與酶輔助堿解對比試驗

由圖2可知，水解2 h后，酶輔助堿解所得酶解液的蛋白質(zhì)含量盡管較單獨(dú)堿解高，但二者無顯著差異（p＞0.05）；當(dāng)水解4 h后，酶輔助堿解所得酶解液的蛋白質(zhì)含量顯著（p＜0.05），高于單獨(dú)堿解。因此，采用酶輔助堿解，較單獨(dú)的堿解能有效提高豬毛的水解效率。堿解可有效破壞豬毛蛋白中精氨酸與其他氨基酸形成的肽鍵，因而可以促進(jìn)豬毛角蛋白的提取。但是，隨著水解程度的增加，水解產(chǎn)生的多肽羧基端易與氫氧化鈉發(fā)生中和反應(yīng)，因而在一定程度上會抑制堿對豬毛的水解。在堿解后采用酶輔助水解，可以在一定程度上彌補(bǔ)單純堿解的不足。短時間堿解對豬毛表面結(jié)構(gòu)的破壞不夠，導(dǎo)致酶解效果不佳。這些可能是導(dǎo)致圖2中2 h后酶輔助堿解的蛋白質(zhì)含量與單獨(dú)堿解無顯著差異，而4 h后酶輔助堿解能顯著提高豬毛水解效果的原因。

2.3 酶輔助堿解單因素試驗

由圖2可知，酶輔助堿解4 h能顯著提高豬毛蛋白的水解效果（p＜0.05）。因此，在保持酶用量不變條件下，對堿濃度和堿解時間進(jìn)行優(yōu)化，可在一定程度上提高水解效率。為此，對豬毛的酶輔助堿解工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

2.3.1 堿濃度對豬毛水解效果的影響

固定酶用量，保持堿解時間2 h，分別對堿濃度為0.2，0.4，0.8，1.6，2.0 mol/L時的水解效果進(jìn)行比較。

堿濃度對豬毛水解液中蛋白含量的影響見圖3。

圖3 堿濃度對豬毛水解液中蛋白含量的影響

由圖3可知，隨著堿濃度增加，酶解液中蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)先增加后降低趨勢。當(dāng)堿濃度為0.4 mol/L時，所得酶解液的蛋白質(zhì)含量顯著高于其他濃度（p＜0.05）；堿濃度為0.2 mol/L和0.8 mol/L時，所得酶解液的蛋白質(zhì)含量無顯著差異（p＞0.05）；類似結(jié)果出現(xiàn)在堿濃度為1.6 mol/L和2.0 mol/L時所得酶解液的蛋白質(zhì)含量。因此，在優(yōu)化試驗中，應(yīng)以0.3 mol/L和0.5 mol/L作為堿濃度的上限值和下限值。在堿解時間固定時，堿濃度越高，越有利于豬毛中肽鏈的斷裂，但是過高的堿濃度，容易促進(jìn)水解后的肽鏈的疏水端聚合，因而會在一定程度上阻礙豬毛蛋白的肽鏈進(jìn)一步水解。這可能導(dǎo)致圖3中，隨著堿濃度增加，水解液中蛋白質(zhì)含量先呈現(xiàn)顯著降低、隨后變化不顯著的原因。

2.3.2 堿解時間對豬毛水解效果的影響

堿解時間對豬毛水解液中蛋白含量的影響見圖4。

圖4 堿解時間對豬毛水解液中蛋白含量的影響

由圖4可知，隨著堿解時間增加，水解液的蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)先顯著增加（p＜0.05），而后顯著降低的趨勢（p＜0.05）。堿解3 h時，水解液中的蛋白質(zhì)含量顯著高于其他水解時間（p＜0.05）。因此，在優(yōu)化試驗中，應(yīng)以1.5 h和3.0 h作為堿解時間的上限值和下限值。在堿濃度不變條件下，隨著堿解時間增加，堿的消耗量增加，有效堿濃度降低，因而會減少堿對豬毛蛋白中肽鏈的分解作用。前期的堿解為后期的酶解提供物質(zhì)基礎(chǔ)，適當(dāng)?shù)膲A解時間，可以對豬毛表面結(jié)構(gòu)起到良好的破壞效果，為后期酶解提供良好條件。這可能就是導(dǎo)致圖4中出現(xiàn)隨著堿解時間增加，水解液中蛋白質(zhì)含量先出現(xiàn)顯著增加而后顯著降低的原因。

2.4 酶輔助堿解工藝優(yōu)化

2.4.1 優(yōu)化方案及試驗結(jié)果

根據(jù)酶輔助堿解的單因素試驗結(jié)果，選擇堿濃度0.3 mol/L和0.5 mol/L，堿解時間1.5 h和3.0 h作為優(yōu)化限制，以水解液中蛋白含量作為響應(yīng)值，對酶輔助堿解工藝進(jìn)行優(yōu)化，

豬血腸制作工藝優(yōu)化試驗方案及試驗結(jié)果見表2。

表2 豬血腸制作工藝優(yōu)化試驗方案及試驗結(jié)果

2.4.2 擬合顯著性分析

對表2中所得試驗結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。

擬合顯著性分析見表3。

表3 擬合顯著性分析

表3中pX1=0.446 8＞0.05，pX3=0.260 5＞0.05的結(jié)果顯示，堿濃度和堿解時間對水解效果無顯著影響；但是pX1X1=0.045 9＜0.05，pX2X2=0.003 9＜0.01，p二次項= 0.007 4＜0.01的結(jié)果顯示，堿濃度和堿解時間的組合對水解效果影響顯著。因此，堿解濃度和堿解時間的共同作用對豬毛的堿解效果產(chǎn)生顯著影響。

表3中p主模型=0.032 9＜0.05，p失擬項=0.555 5＞0.05，并且結(jié)合擬合相關(guān)性系數(shù)的平方為0.771 7可知，通過對堿濃度和堿解時間與水解效果的擬合，所得擬合模型式（1）具有一定可靠性。

2.4.3 擬合模型可靠性驗證

為了進(jìn)一步確保擬合模型式（1）的可靠性，以確保所得優(yōu)化結(jié)果可靠，對式（1）計算的蛋白含量與實際測定的蛋白含量進(jìn)行比較。

表2中測定和計算的水解液中蛋白含量的相對誤差結(jié)果顯示，均小于8%。由此可知，所得擬合模型具有一定可靠性，可用于酶輔助堿解最優(yōu)工藝的預(yù)測。

2.4.4 優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)擬合模型，對最優(yōu)酶輔助堿解工藝進(jìn)行預(yù)測，得出氫氧化鈉溶液濃度為0.4 mol/L，堿解時間為3 h時，所得水解液的蛋白濃度最高，對應(yīng)的水解液中蛋白含量為103.274 mg/g。通過重復(fù)試驗，對最優(yōu)工藝進(jìn)行實測驗證，得出樣液中蛋白含量為110.780±3.02 mg/g，與預(yù)測值103.274 mg/g相比，相對誤差為6.77%。因此，預(yù)測結(jié)果與實際測定結(jié)果較吻合，氫氧化鈉濃度0.4 mol/L，堿解時間3 h為酶輔助堿解豬毛制備角蛋白的最優(yōu)工藝。

堿濃度和堿解時間對豬毛水解效果影響見圖5。

圖5 堿濃度和堿解時間對豬毛水解效果影響

2.5 堿解對豬毛微觀結(jié)構(gòu)影響

選取堿解5，15，25 min后的豬毛，觀察其微觀結(jié)構(gòu)變化。

不同堿解時間下豬毛的結(jié)構(gòu)變化見圖6。

由圖6可知，未堿解的豬毛表面光滑、結(jié)構(gòu)完整；堿解5 min后，豬毛局部出現(xiàn)表面結(jié)構(gòu)破壞；堿解15 min和25 min后，豬毛整體出現(xiàn)絲狀。由此可見，堿解可有效破壞豬毛的天然結(jié)構(gòu)。這也進(jìn)一步驗證了前面所提及堿解破壞豬毛的表面結(jié)構(gòu)，為后期酶解提供物質(zhì)基礎(chǔ)的猜測。

圖6 不同堿解時間下豬毛的結(jié)構(gòu)變化

3 結(jié)論

通過比較鹽酸和氫氧化鈉對豬毛的水解效果，發(fā)現(xiàn)氫氧化鈉更有利于豬毛的水解。比較酶輔助氫氧化鈉水解豬毛，發(fā)現(xiàn)酶輔助堿解豬毛能顯著提高豬毛的水解效果（p＜0.05）。對酶輔助堿解工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出堿濃度0.4 mol/L，堿解時間3 h時，所得堿解液中的蛋白含量最高。

[1]黃兆華，肖德寶，黃曦.豬毛制取L-胱氨酸研究（Ⅰ）——水解條件[J].福州大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），1997，25（4）：92-94.

[2]董敏玉，王海濱，范海濤，等.豬毛水解蛋白粉的研制及其營養(yǎng)價值評價[J].肉類工業(yè)，1992（10）：37-41.

[3]賈如琰，何玉鳳，王榮民，等.角蛋白的分子構(gòu)成、提取及應(yīng)用[J].化學(xué)通報，2008（4）：265-271.

[4]Tachibana A，F(xiàn)uruta Y，Takeshima H，et al.Fabrication of wool keratin sponge scaffolds for long-term cell cultivation[J].Journal of Biotechnology，2002（2）：165-170.

[5]莊媛.羽毛殘渣制備角蛋白海綿膜及其在環(huán)境治理中的應(yīng)用[D].上海：東華大學(xué)，2013.

[6]Tachibana A，Kaneko S，Tanabe T，et al.Rapid fabrication of keratin-hydroxyapatite hybrid sponges toward osteoblast cultivation and differentiation[J].Biomaterials，2005，26（3）：297-302.

[7]Gaidau C，Petica A，Micutz M，et al.Progresses in treatment of collagen and keratin-based materials with silver nanoparticles[J].Central European Journal of Chemistry，2013，11（6）：901-911.

[8]羅海波，柴玉葉，蘭云軍.利用制革廢棄豬毛提取角蛋白[J].精細(xì)化工，2013，30（7）：744-750.

[9]Joua C J G，Chen Y S，Wang H P，et al.Hydrolytic dissociation of hog-hair by microwave radiation[J].Bioresource Technology，1999（1）：111-113.

[10]朱廣軍.從人發(fā)和豬毛中制取脫氨酸的新工藝[J].中小企業(yè)科技，2001（3）：29-30.

[11]李中和.利用豬毛生產(chǎn)胱氨酸新工藝[J].中小企業(yè)科技，2006（1）：47.

[12]劉世清，劉洪玉.四種蛋白質(zhì)測定方法的比較研究[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2012（3）：39-40.

[13]向鵬妍，吳婷，孟婧，等.畜禽毛發(fā)中角蛋白的分解工藝及應(yīng)用現(xiàn)狀[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2016（12）：71-74.

[14]王少華，楊宏德，吳士良.豬毛水解液中精氨酸的分離[J].蘇州大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），1988，8（1）：61-62.◇

Process Optimization of Enzyme Assisted Alkaline Hydrolysis to Extract Keratin from Pig Hair

GUO Siya，XIANG Pengyan，WU Ting，MENG Jing，*ZHANG Yin
（Sichuan Provincial Key Laboratory of Meat Processing，Chengdu University，Chengdu，Sichuan 610106，China）

To improve the efficiency of alkaline hydrolysis to extract keratin from pig hair，effect of enzyme assisted alkaline hydrolysis on extraction ratio of keratin is investigated，and the extraction process is optimized with response surface method. By comparing effect of acid and alkaline hydrolysis on extraction ratio of keratin，it is found that sodium hydroxide is more efficiency for hydrolysis of pig hair.By comparing enzyme assisted sodium hydroxide to hydrolyze pig hair，it is found that enzyme assisted alkali solution significantly（p＜0.05）improved the hydrolysis efficiency.The results of response surface optimization indicate that the combined effect of alkali concentration and alkaline hydrolysis time had a significant effect（p＜0.05）on the hydrolysis of pig hair.The ANOVA of fitting results show that the obtained fitting model is reliable to be used to predict the optimal process of enzyme assisted alkaline hydrolysis of pig hair.According to the fitting model，the enzyme assisted alkali hydrolysis process is optimized，the results show that the extraction ratio of keratin is the highest when the alkali concentration is 0.4 mol/L and the alkaline hydrolysis time is 3 h.

pig hair；enzyme hydrolysis；process optimization

TS251.92

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.08.006

1671-9646（2017）08a-0019-05

2017-06-08

四川省應(yīng)用基礎(chǔ)項目（2017JY0086）；四川省教育廳重點(diǎn)項目（17ZA0084）。

郭思亞（1994—），女，碩士，研究方向為畜產(chǎn)品加工與保藏。

*通訊作者：張崟（1981—），男，博士，副教授，研究方向為畜產(chǎn)品加工與保藏。