肺上皮干/祖細胞種類和研究方法進展

鄧敏華 李進華 甘燁 陳平

因為肺與外界相通，所以肺上皮細胞持續(xù)暴露在過敏原、污染物、刺激物、煙霧、細菌/病毒感染等損傷因子下。若肺上皮細胞損傷和再生修復能力失衡，則導致疾病的發(fā)生發(fā)展。氣道上皮在刺激損傷后的修復過程可分為3個相輔相成的步驟：①鄰近上皮細胞通過局部擴散和遷移覆蓋受損裸露區(qū)域；②肺上皮干/祖細胞通過遷移和增殖重建上皮；③上皮干/祖細胞分化為各種特定細胞以修復氣道屏障和呼吸功能[1]。肺上皮干/祖細胞在維持肺內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和損傷后的再生修復中起重要作用，分離和鑒定肺上皮干/祖細胞，深入了解他們在肺臟生理病理條件下的具體作用機理，對肺臟疾病的防治意義深遠。肺干細胞是存在于肺組織內的成體干細胞，他們在穩(wěn)態(tài)下以極低的頻率分裂，具有長期自我更新和產生一種或多種高度分化功能細胞的能力；肺祖細胞也能分化為一種或多種高度分化細胞，但是通常被認為僅具有有限的自我更新能力。由于目前尚無公認的可評估自我更新能力的體內或體外實驗方法來區(qū)別肺干細胞和祖細胞，并且這種自我更新能力可能受微環(huán)境因素的影響，所以學者們多將肺干細胞和祖細胞一并討論。肺內的干/祖細胞包括肺上皮干/祖細胞、肺間充質干細胞和肺內皮祖細胞等，而且多種肺臟難治性疾病如肺癌、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺囊性纖維化、特發(fā)性肺纖維化等都可能與肺干/祖細胞的調節(jié)和功能異常密切相關。本文就已經鑒定的肺上皮干/祖細胞的種類、肺上皮干/祖細胞的研究方法以及他們和肺癌的關系的最新進展進行綜述。

1 肺上皮干/祖細胞種類

肺上皮干/祖細胞可能是兼職（faculative）干/祖細胞，即在正常情況下處于靜息狀態(tài)并參與肺臟呼吸功能，如一些干/祖細胞分泌對氣體交換至關重要的蛋白，但是當肺損傷時則迅速變?yōu)槎虝簲U充細胞參與損傷后的再生修復[2]。由不同類型的細胞、多種細胞外基質蛋白和一些生長因子組成的微環(huán)境構成“干細胞龕位（stem cell niches）”，這種龕位對于決定干/祖細胞的功能和分化效能起關鍵作用[3]。大多數學者認為肺內存在多種位于特定區(qū)域龕位內的上皮干/祖細胞，不同的肺上皮干/祖細胞在穩(wěn)態(tài)和損傷修復反應中可能發(fā)揮各自特定的作用，不同類型或程度的損傷啟動不同的肺上皮干/祖細胞參與修復[4]。表1列出了主要的肺上皮干/祖細胞及其表面標記，我們將按這些干細胞龕位所在部位的順序對肺上皮干/祖細胞進行闡述。

1.1 近端氣道（氣管-支氣管）肺上皮干/祖細胞 基底細胞（basal cells, BCs）是在小鼠的氣管和近端氣道以及人類的全氣道的穩(wěn)態(tài)與損傷后再生修復中起重要作用的干/祖細胞。將經過熒光激活細胞分選技術（fluoresence-activated cell sorting, FACS）分離的BCs（Trp63+NGFR+Krt5+）在基質膠中培養(yǎng)可形成克隆結構，并且這種克隆結構表達纖毛細胞和Clara細胞的表面標記。譜系示蹤技術也證明，BCs可自我更新并在穩(wěn)態(tài)與SO2吸入損傷后分化為纖毛細胞和Clara細胞[5]。最近，Watson等[6]利用長期譜系示蹤技術和單細胞基因轉錄組學分析發(fā)現基底細胞是由數量相近的基底干細胞（basal stem cells, BSCs）和基底腔祖細胞（basal luminal precursor cells, BLPCs）組成。他們都表達Trp63和Krt5，幾乎不表達Krt14，但是在受損后Krt14卻迅速表達上調，這提示Krt14可能是在再生上皮中鑒定活化干細胞的一個重要分子標記。在穩(wěn)態(tài)環(huán)境下，BSCs通過不對稱分裂生成一個新的BSC和一個BLPC，后者可進一步分化為Clara細胞或神經內分泌細胞。BLPCs的自我更新速率很低甚至可忽略，而且因為表達Krt8，有所區(qū)別于BSCs。有意思的是，Pardo-Saganta等[7]利用SO2損傷模型觀察到在Krt8+祖細胞形成之前，Trp63+基底細胞群便分離出兩個亞群，一個將分化為成熟Clara細胞，另一個將分化為纖毛細胞，而且這種現象并沒有在穩(wěn)態(tài)上皮中被觀察到，這說明BCs在損傷后產生不同于穩(wěn)態(tài)環(huán)境下的祖細胞亞群?；准毎梢宰鳛闅獾郎掀さ慕M織特異性干細胞，但是他們的異質性還有待于進行進一步研究[8]。

表1 小鼠主要的肺上皮干/祖細胞Tab 1 Major lung epithelial stem and progenitor cell types in adult murine

導管細胞是位于氣管粘膜下腺體（submucosal glands,SMGs）導管部的多能干/祖細胞。Borthwick等[9]將導管細胞種植到去除上皮的氣管基底膜上，再將其一起移植到免疫缺陷小鼠皮下，發(fā)現這些細胞可在裸露的氣管內再生上皮樣表面。在嚴重的缺血缺氧損傷后，導管細胞可分化為粘膜下腺小管、導管細胞和氣道上皮細胞[10]。

1.2 細支氣管肺上皮干/祖細胞 Clara細胞已被譜系示蹤技術證明為可自我更新并能產生纖毛細胞的干/祖細胞[11]。在小鼠細支氣管區(qū)的神經內分泌小體（neuroendocrine body, NEB）周圍和細支氣管肺泡連接處（bronchioalveolar duct junction, BADJ）分別代表兩個不同的干細胞龕位。譜系示蹤實驗證明，CGRP+肺神經內分泌細胞（pulmonary neuroendocrine cells, PNECs）不僅在穩(wěn)態(tài)下可以自我更新，而且在萘損傷后可分化為Clara細胞和纖毛細胞，但是PNECs的去除對Clara細胞修復并無明顯影響[12]，這表明PNECs可能不是參與細支氣管修復的主要細胞。NEB周圍和BADJ都有變異Clara（variant Clara,vClara）細胞分布，他們是在萘損傷后位于終末細支氣管最早而且最主要的增殖細胞，并且可以自我更新并能分化為Clara細胞[13]。Teisanu等[14]通過包括三維培養(yǎng)技術、譜系示蹤技術等在內的多種技術，發(fā)現一種對萘耐受的細支氣管祖細胞，他們是CD45-CD31-CD34-EpCAM+Sca-1loAFlo細胞，而在CD45-CD31-CD34-EpCAM+Sca-1loAFhi（hi：high，高表達）細胞群中包含對萘敏感的Clara細胞。BADJ區(qū)內還分布極少量對萘耐受的細支氣管肺泡干細胞（bronchioalveolar stem cells, BASCs），他們共表達CCSP和pro-SPC，可在體外自我更新并能分化為Clara細胞、I型肺泡細胞（type I alveolar cell, ATI）和II型肺泡細胞（type II alveolar cell, ATII），但是不能分化為纖毛細胞[15,16]。利用CD31-CD45-Sca-1+表型可將BASCs陽性富集[17]。然而，另一項研究結果[15]顯示利用CD45-CD31-EpCAM+Sca-1loCD24lo表型可富集BASCs。此外，McQualter等[18]采用FACS分選出肺CD45-CD31-EpCAMhiCD49f+CD104+CD24lo細胞，將這些細胞進行三維培養(yǎng)時形成了表達氣道和/或肺泡系標記的克隆。

Kumar等[19]報道了當亞致死劑量的H1N1流感病毒感染小鼠后，一群Trp63+Krt5+細胞遷移至細支氣管及其周圍肺泡區(qū)域，增殖修復受損的肺泡上皮。近期兩篇發(fā)表于Nature的研究對此細胞的來源和作用機制進行了進一步探討。雖然這些細胞，有些學者稱之為遠端氣道干細胞（distal airway stem cells, DASCs）和氣管基底干細胞具有類似的分子標記，但是卻與基底干細胞在體外培養(yǎng)和體內移植實驗中表現出不同特性。氣管基底干細胞在體外和體內研究中生成的都是更接近近端的氣道上皮，而這些細胞在體外可形成肺泡球狀物，在體內可產生肺泡細胞和Clara細胞，并且krt5譜系研究表明這些細胞是在肺損傷后才產生的[20]。Zuo等[20]為了更進一步明確DASCs在H1N1所致肺損傷修復中的作用，利用轉基因技術去除了小鼠的DASCs，發(fā)現相比于對照組小鼠，這些小鼠在感染H1N1后出現了肺功能下降并且富集的白細胞也未消散的情況。令人驚訝的是，將從健康小鼠分離出的DASCs經擴增后通過氣管內滴注移植入小鼠肺內，上述現象得到了緩解。Zuo和Vaughan兩者的團隊[20,21]都通過譜系示蹤技術對于H1N1感染誘導出的krt5+細胞的細胞來源進行研究，但兩者的結果卻不一致。Zuo等[20]觀察到超過50%的這些細胞來自于已存在的krt5+譜系細胞，而Vaughan的團隊卻只追蹤到13%來源于krt5+譜系。這原因可能是兩者采用不同的報告系統（Zuo等采用使用一個帶有牛krt5啟動子的轉基因，而Vaughan等[21]是在內源性krt5基因的3'端未轉譯區(qū)敲入一個轉基因）。Vaughan等的研究結果顯示這些誘導出的krt5+細胞也不是來源于SPC+譜系或CC10+譜系，因而他們稱之為譜系陰性上皮祖細胞（lineagenegative epithelial progenitor, LNEPs）。在Vaughan等的實驗中這些細胞也出現于博來霉素損傷后，盡管數量程度低于流感病毒感染后，但是也提示krt5+再生過程并不是流感病毒感染后的特異性過程。Vaughan等還發(fā)現這些細胞可能來源于整合素β4+CD200+上皮干/祖細胞，這與Quantius等[22]的研究結果一致。他們觀察到高致病性的流感病毒雖然可以感染小鼠肺內多種細胞群，但對一個具有高增殖能力的上皮細胞亞群（EpCAMhiCD24lowintegrinα 6high）表現出強烈的趨向性。這些細胞表達Sca-1，高度富集整合素β4+CD200+上皮干/祖細胞，且促進流感病毒感染后的Trp63+Krt5+再生過程。

1.3 肺泡上皮干/祖細胞 ATII細胞早于1974年就被鑒定為肺泡上皮的干/祖細胞[23]。Desai等[24]綜合運用分子標記、譜系追示和三維培養(yǎng)等方法發(fā)現在胚胎肺發(fā)育過程中ATI和ATII細胞都來源于一種雙能祖細胞，而在出生后新生的ATI細胞來自于少量的具有自我更新能力的成熟ATII細胞，并且ATII細胞的這種干細胞特性在ATI細胞受損后迅速被廣泛地激活。Liu等[25]采用譜系示蹤技術發(fā)現參與綠膿桿菌介導的肺泡損傷后修復的是ATII細胞的一種亞群，即Sca-1+ATII細胞。這些細胞不表達整合素β4、Trp63和CCSP，是不同于其他遠端氣道祖細胞及Sca-1+BASCs的。除了ATII細胞，還有其他干/祖細胞參與肺泡上皮的穩(wěn)態(tài)維持和損傷后修復。利用譜系示蹤技術在CCSP-CreER（Cre recombinase-modified estrogen receptor fusion protein）小鼠（CCSP驅動的可誘導性Cre重組酶，利用此基因重組小鼠可以譜系示蹤CCSP+細胞）中，Rawlins等[11]發(fā)現在穩(wěn)態(tài)或高氧損傷后的肺泡內，CCSP+細胞并沒有增加，提示這種細胞不分化為肺泡上皮細胞；然而Rock等[26]報道當此種小鼠被博來霉素肺損傷后，CCSP+細胞分化為ATI和ATII兩種細胞，提示CCSP+細胞如BASCs或Clara細胞，參與肺泡萘損傷后的修復。這兩種不同的結論支持了前述觀點，即不同類型或程度的損傷啟動不同的肺上皮干/祖細胞參與修復。Chapman等[27]的研究表明在博來霉素肺損傷后再生的ATII細胞大部分是來源于肺泡上皮細胞的一種新亞群，這種新的祖細胞表達層粘連蛋白受體4（α6+β4+），但pro-SPC表達量很少或缺失，在體外克隆實驗中可分化為pro-SPC+細胞，并在移植實驗中能形成氣道和肺泡結構。這種α6+β4+細胞可能與McQualter等[18]發(fā)現的CD45-CD31-EpCAMhiCD49f+CD104+CD24lo細胞相交叉。

以上實驗表明，許多新發(fā)現的推定的肺上皮干/祖細胞具有異質性或處于爭論狀態(tài)，尚需多種體內和體外實驗方法來進一步鑒定和驗證，也提示我們不僅需要在表型上深入了解特異的細胞表面標記以利于分選和鑒定肺上皮干/祖細胞，還需要完善包括譜系示蹤在內的功能性實驗來評估細胞的增殖分化能力。

1.4 人肺上皮干/祖細胞 鼠類的肺臟與人類之間有相同的形態(tài)和功能，但也存在一些差異，如基底細胞僅分布于小鼠氣管和主支氣管上皮，而在人體可分布至細支氣管；呼吸性細支氣管在小鼠中缺如。目前關于人肺上皮干/祖細胞所知甚少。Fujino等[28]獲得了人肺泡上皮祖細胞（alveolar epithelial progenitor cells, AEPCs），這些細胞擁有ATII細胞和間充質干細胞的一些基因，提示他們在肺泡上皮細胞和間充質干細胞之間的表型重疊。實事上，AEPCs能夠在間質和上皮之間表型轉換，說明他們在肺組織修復中的潛在能力。多參數流式細胞分析顯示那些推測的人氣道上皮干/祖細胞具有一些與鼠類對應干/祖細胞相似的表達譜，如人NGFR+α6+Trp63+基底細胞可分化形成由Krt14+Trp63+基底細胞、Krt8+管腔細胞和纖毛細胞組成的囊性類器官結構[29]。Kajstura等[30]報道c-kit+細胞在組織培養(yǎng)時可分化為內胚層和中胚層兩種細胞系，并且人c-kit+細胞在注入經低溫冷凍后的小鼠肺內后參與氣道、肺泡和肺血管的修復。此研究結果還有待在穩(wěn)態(tài)和損傷的情況下利用轉基因小鼠和譜系示蹤等多種方法行進一步驗證。若以上得到證實，則推翻了目前被普遍接受的觀點，即在肺內不存在一種單一的可分化形成平滑肌、血管、氣道和肺泡的肺多能干/祖細胞。Oeztuerk-Winder等[31]也可能分離出一種新的人肺上皮干細胞即E-Cad/Lgr6+細胞，這種細胞在體內外實驗中具自我更新和分化特性，并且將單個E-Cad/Lgr6+細胞移植入腎囊后形成分化的支氣管肺泡組織并保留自我更新的能力。

2 肺上皮干/祖細胞的研究方法

由于肺臟復雜的內在結構以及尚未發(fā)現肺上皮干細胞特異的表面標記等原因，肺上皮干/祖細胞的分選和鑒定相比其他組織干細胞更具挑戰(zhàn)性。目前肺上皮干/祖細胞的研究方法主要包括肺損傷模型、譜系示蹤技術、三維培養(yǎng)體系、移植、單細胞轉錄組學分析等，這些方法在分離和鑒定肺上皮干/祖細胞的應用中并不是孤立存在，而是相互結合，相互驗證的。

2.1 肺損傷模型 因為肺上皮更新緩慢，絕大多數肺上皮干/祖細胞處于靜息狀態(tài)G0期，所以通過建立不同的肺損傷模型來激活肺上皮干/祖細胞。每種模型引發(fā)特定的損傷修復過程從而顯露出存活細胞的增殖分化潛能，同時也有助于了解肺上皮干/祖細胞在各損傷模型所代表的肺疾病的發(fā)生發(fā)展過程中的作用。萘可特異性殺傷大多數Clara細胞，繼而對萘耐受的vClara細胞通過增殖、分化和自我更新恢復這些Clara細胞群。vClara細胞對萘耐受的原因是他們不表達可將萘代謝為毒性產物的細胞色素P450 Cyp2f2[32]。然而，關于在萘損傷后遠端肺內vClara細胞是否是唯一能自我更新并參與修復的細胞群的問題尚待解決，于是Reynolds等[33]建立了肺內Clara細胞表達單純皰疹病毒胸苷激酶的轉基因CCtK小鼠品系，通過給予更昔洛韋可清除所有Clara細胞而不受Cyp2f2表達的影響，研究顯示在所有Clara細胞被去除后，氣道上皮不能修復再生。Hong等[4]利用CCtK小鼠結合后述的[3H]胸腺嘧啶標記法發(fā)現PNECs也能自我更新，但尚不足以修復氣道上皮。這些結果提示vClara細胞是氣道上皮干/祖細胞或對干/祖細胞的維持至關重要。博來霉素可致小鼠ATII和ATI細胞損傷，用于研究肺泡上皮細胞的干/祖細胞[16,27]。Ding等[34]采用單側肺切除術首次證明了上皮細胞和內皮細胞之間的相互作用啟動和維持肺損傷后的肺泡再生。亞致死劑量的H1N1流感病毒感染小鼠后引起廣泛的細支氣管和肺泡損傷，導致Clara細胞、纖毛細胞和ATII細胞的損失，在隨后的肺再生過程中發(fā)現Trp63+Krt5+細胞可能是遠端氣道干細胞[19]。

2.2 譜系示蹤 譜系示蹤是基于特定類型細胞和他的任一子代細胞持續(xù)表達可通過組織學或活體影像學方法檢測的報告蛋白的一種技術[35]。此方法有雙重目的：①在不同條件下（穩(wěn)態(tài)或損傷）追蹤被標記細胞及其子代細胞的命運，這就可能明確特定細胞或細胞群在相應條件下的發(fā)育潛能和命運；②檢測隨著時間推移，在這些標記的細胞群中有多少比例的細胞被維持或被稀釋，由此可判斷一個細胞群隨著時間推移是自我維持還是更新于另外一種未被標記的細胞群。譜系示蹤方法是目前追蹤一種細胞及其子代細胞的最佳手段，可以評判一種細胞的功能到底是干細胞、短暫擴充細胞、祖細胞、自我更新的未分化細胞還是終末分化細胞。Rawlins等[11]在運用此方法追蹤推定的可分化為Clara細胞和肺泡上皮細胞的BASCs的子代細胞時，發(fā)現這些細胞無論是在肺損傷后還是在正常胚胎肺發(fā)育過程中都只產生傳導氣道上皮而無肺泡上皮。這在很大程度上削弱了可分化為所有肺細胞類型的“單一肺多能干細胞”的概念。

2.3 三維培養(yǎng)體系 三維培養(yǎng)體系指將不同類型的細胞、不同三維結構的載體如基質膠和生長因子同時在體外培養(yǎng)，使細胞能在類似于機體內環(huán)境的三維空間結構中遷移、分化和生長，形成三維復合物。此方法已成為鑒定肺干/祖細胞的增殖、分化和自我更新特性及研究上皮細胞和基質間的細胞和分子交互作用機制等的一種重要工具[36]。深入了解干/祖細胞龕位和關鍵信號通路調節(jié)因子的作用有助于探索出最優(yōu)載體，從而使此體系不斷完善。將永生的人支氣管上皮細胞[37]或新鮮分離的人近端氣道上皮細胞[38]在基質膠中行三維培養(yǎng)時都可形成由分化的氣道上皮細胞組成的三維復合類器官結構。目前應用較多的是球體培養(yǎng)體系（spheroid culture system）。Chimenti等[39]報道這種球體培養(yǎng)體系可以形成對人肺祖細胞具有類似于龕位功能的微環(huán)境，能夠影響成熟肺祖細胞的表型，并且還能分泌特定的旁分泌因子。

2.4 移植 腎囊移植模型用于在體內檢測干細胞自主特性[30]。評估祖細胞潛能的新方法還有用基質膠皮下注射肺多能干細胞[40]和體外去細胞和再細胞化（decellularization and recellularization）肺模型[41]。后者指去除肺內所有細胞成分，僅留下細胞外基質的全肺支架作為平臺再結合三維培養(yǎng)研究肺干/祖細胞的再細胞化[42]。近年，Kajstura等[30]首次成功將人肺上皮細胞移植入經低溫冷凍的小鼠肺內。Hajj等[43]將分離出的囊性纖維化（cystic fibrosis, CF）患者和非CF患者的氣道上皮細胞，分別接種至去除上皮的氣管移植物中，再種植到裸鼠皮下，發(fā)現相比于非CF患者，CF患者的氣道上皮細胞存在分化延遲、增殖活躍及基底細胞增生的現象。

2.5 慢性標記細胞法 慢性標記細胞法的理論是干細胞在自我更新分裂過程中不對稱性分離染色體，引起老的（“永生”） DNA雙鏈保留于子代干細胞而新合成的DNA雙鏈被隔離到正在分化的細胞，從而干細胞通過不對稱性染色體分離或因為分裂緩慢而能夠保留溴脫氧尿苷（bromodeoxyuridine, BrdU）或[3H]胸腺嘧啶等DNA標記物[44]。Borthwick等[9]用BrdU標記小鼠肺損傷模型，發(fā)現標記物主要位于氣管和近端支氣管的SMGs導管處，推斷該處可能存在具有干細胞特征的細胞類型。然而，將此方法用于鑒定干細胞在近年出現了爭議。Kiel等[44]對新生小鼠、經環(huán)磷酰胺和粒細胞集落刺激因子處理的小鼠和成年小鼠給予BrdU 4天-10天，然后停用70天。通過特征性的表面標記高度分離、純化造血干細胞，發(fā)現僅不足6%的造血干細胞保留BrdU，而在BrdU標記的骨髓細胞中造血干細胞少于0.5%，這說明將BrdU作為造血干細胞標記的特異性和敏感性均很低。因此，將BrdU應用于標記氣管干細胞尚須進一步驗證。

2.6 單細胞轉錄組學分析 單細胞轉錄組學分析是近年逐漸發(fā)展起來的技術，旨在研究不同的時間點單個細胞的增殖、分化、功能及細胞與細胞間相互作用等。此方法不需事先對細胞進行提純或對潛在的細胞有一定的了解就可直接檢測不同的細胞類型和細胞譜系，能用于在分子水平勾畫特定細胞類型、鑒定祖細胞和其譜系子細胞以及研究譜系特異的調節(jié)因子[45-47]。Watson等[6]采用單細胞基因表達譜分析發(fā)現基底細胞具有異質性，主要由BSCs和BLPCs組成。

3 肺上皮干/祖細胞與肺癌

肺癌是世界范圍內最常見的致死病因之一，主要根據他的表型和在氣道中的不同解剖來源而分為兩大類：小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），其中NSCLC占所有肺癌患者近85%，主要分為肺鱗癌、肺腺癌和大細胞肺癌。腫瘤干細胞理論認為肺癌干細胞具有自我更新和分化為腫瘤內所有細胞的能力，是肺癌的發(fā)生、進展、復發(fā)、侵襲轉移、耐藥等的“根源”[48]。Gu的團隊[49]首次采用經FACS分離出的小鼠肺干/祖細胞而不是腫瘤細胞系或已形成的腫瘤來研究肺癌干細胞。他們發(fā)現多能轉錄因子Oct-4的過表達足以誘導小鼠肺干/祖細胞的轉化。這些轉化的細胞不僅具有腫瘤發(fā)生和耐藥潛能，還顯著表達一些促血管生成因子，參與腫瘤血管生成。

大量來自基因工程小鼠模型的數據提示各肺癌亞型可能起源于不同的肺上皮干/祖細胞群。比如，具有神經內分泌特征的SCLC很可能起源于神經內分泌小體內的CGRP+PNECs[12,50,51]。對于肺腺癌，研究報道SPC+CCSP+BASCs是在腫瘤基因Kras活化后最早增殖的細胞群[16]。但是，譜系示蹤研究結果卻表明Kras+肺腺癌可能起源于ATII細胞[52]。Desai等[24]也觀察到EGFR/KRAS信號通路選擇性刺激ATII細胞增殖，將ATII細胞轉化為快速生長的單克隆腫瘤，他們推測人肺腺癌主要來源于ATII細胞。肺鱗癌具鱗狀分化的特性，并常表達基底細胞的表型p63、CK5和轉錄因子Sox2，提示肺鱗癌可能起源于基底細胞[53]，但這尚需基因工程小鼠等實驗進一步驗證。

肺癌干細胞的深入研究有助于開發(fā)出特異性針對肺癌干細胞的藥物，如拮抗表面分子標記、去除干細胞的龕位、抑制發(fā)展干細胞的信號通路等[54]，且逐漸從基礎走向臨床。已發(fā)現的用于分離和研究肺癌干細胞的表面分子標記主要有CD133、CD166、CD44、CD90、乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase, ALDH）和轉錄因子Nanog。Alamgeer等[55]報道CD133和ALDH1A1的共表達與已行外科切除的早期NSCLC患者的不良預后強相關，這也符合干細胞表面標記的表達水平與復發(fā)相關的假設，因他們可間接反映干細胞的自我更新能力。Yeh等[56]將抗精神病藥甲哌氯丙嗪聯合吉非替尼或順鉑對富集的CD133+/CD44+肺癌干細胞進行處理后，發(fā)現這些細胞的腫瘤干細胞相關基因表達下調、Wnt信號通路受到抑制以及化療敏感性增加。戒酒硫（disulfiram）之前一直被用于治療酒精中毒，最近作為ALDH抑制劑在腫瘤治療領域受到關注。戒酒硫已被報道在多種實體瘤中具有抗腫瘤特性，包括肺癌。Nechushtan等[57]進行了一項II期臨床試驗評估在順鉑和長春瑞濱化療基礎上加用戒酒硫治療晚期NSCLC患者的療效，結果發(fā)現試驗組患者的生存期延長。有意思的是，在所有試驗者中有兩例長期存活者，且這兩例均位于戒酒硫試驗組。一些高度保守的信號通路主要包括Wnt/β-catenin信號通路、Sonic hedgehog信號通路和Notch信號通路，對于維持正常干細胞的功能至關重要，而腫瘤干細胞常表現出上述一條或多條信號通路的持續(xù)活化[58]。目前已研制出多種針對這些信號通路的單克隆抗體、siRNA或小分子抑制劑，具有抗腫瘤作用或增強腫瘤對現有治療的敏感性。一項關于DKN-01在復發(fā)或難治性NSCLC患者中的抗腫瘤活性的I期臨床研究（NCT01457417）已完成。DKN-01是細胞外dickkopf-1（DKK-1）的高親和力中和單克隆抗體，而DKK-1是經典Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑。NCT01457417的臨床研究結果[59]表明這些NSCLC患者的中位無進展生存期為2.2個月，總生存期為6.6個月，其中一個患者得到疾病的完全控制。SMO是細胞表面G蛋白偶聯受體，Sonic hedgehog信號通路通過SMO的激活啟動信號級聯反應。今年，一些新研發(fā)的小分子SMO拮抗劑，比如LDE-225（NCT01579929）、GDC-0449（NCT00887159）及BMS-833923/XL139（NCT 00927875），已經進入治療廣泛期SCLC患者的臨床試驗。Notch信號通路抑制劑的研究主要集中于γ-分泌酶抑制劑（γ-secretase inhibitors,GSIs）。γ-分泌酶可將Notch的胞內結構域從細胞膜上釋放出來，使之進入細胞核內參與Notch靶基因的表達。GSI不僅具有直接的抗腫瘤活性，還能增強腫瘤細胞對現有治療的敏感性。GSI可以阻止放療誘導的Notch通路的活化，提示GSI的應用可能阻止Notch誘導的放療耐受[60]。Arasada等[61]發(fā)現EGFR突變的肺癌細胞系（HCC4006, HCC827）在接受厄洛替尼處理后，通過EGFR依賴的Notch3活化富集了ALDH+干細胞樣細胞，而GSI可逆轉這種表型。

4 展望

肺上皮干/祖細胞的研究可能將會集中在鑒定特異的細胞表面標記以富集同質性肺上皮干/祖細胞群，以及采用各種體內體外實驗或發(fā)展新的功能性分析方法全方位驗證各上皮干/祖細胞群的自我更新和分化潛能。同時，明確肺癌干細胞、肺上皮干/祖細胞、肺上皮干/祖細胞龕位之間的關系及相關的信號通路也至關重要。肺上皮干/祖細的深入研究不僅對于明確肺癌在內的肺部疾病的發(fā)生發(fā)展過程有重要意義，而且在再生醫(yī)學、靶向治療等領域對于肺癌在內的難治性肺部疾病的治療提供了一種新的方向。