CTLA-4、PD-1和PD-L1在小細胞肺癌外周血中的分布及臨床意義

李慧 劉巖 柳影 柳菁菁 趙丹丹 王瑩 程穎

肺癌是影響國民健康的頭號殺手，發病率和死亡率均居惡性腫瘤的首位，其中小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC ）約占肺癌總數的10%-15%。可進行手術切除的小細胞肺癌患者比例低，大部分患者需接受藥物治療，化療為主要治療藥物[1]。盡管SCLC患者對初始化療敏感，但易復發，可選擇的二線治療藥物較少，其耐藥機制不明。SCLC的疾病發生和進展機制復雜，盡管普遍存在Tp53和RB基因等缺失，但缺少有效的靶向藥物。近20年來SCLC的臨床治療缺乏突破，急需尋找新的治療靶點和藥物療效預測標志物來改善SCLC的治療現狀[2]。

腫瘤免疫治療成為腫瘤治療的一個重要研究領域，細胞毒性T淋巴細胞相關抗原（cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4, CTLA-4）、程序壞死因子（programmed death 1, PD-1）和程序壞死因子配體（programmed death ligand 1, PD-L1）的單藥或聯合用藥已經獲批用于臨床治療黑色素瘤、腎癌及非小細胞肺癌。在小細胞肺癌中，也有眾多免疫靶向治療臨床研究正在進行。然而免疫靶向藥物至今缺少療效預測的生物標志物，因此難以挑選適合靶向治療的人群，導致治療缺乏針對性，總體療效差[3,4]。

CTLA-4、PD-1和PD-L1高表達于腫瘤浸潤淋巴細胞或腫瘤中[5-11]，眾多研究將其作為腫瘤免疫靶向的療效預測標志物，但研究結果受標本、檢測方法、結果判讀標準的限制，目前缺乏統一共識。SCLC組織標本獲取困難，液態標本具有實時無創的特點，可作為SCLC生物標志物檢測的有效替代標本，本研究擬檢測SCLC患者外周血中PD-1、PD-L1及CTLA-4在淋巴細胞中的分布情況，探討其致病機制，分析上述生物標志物的臨床價值，為SCLC免疫靶向藥物的臨床實踐提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象 招募吉林省腫瘤醫院2014年1月-2016年1月住院并確診為SCLC患者290例，其中男性176例，女性114例；廣泛期114例，局限期176例；年齡39歲-71歲，中位年齡51歲。所有患者均未進行放化療或免疫治療，另外，選取60名健康志愿者作為對照組，男性33例，女性27例，年齡范圍30歲-60歲，中位年齡47歲。本研究已通過吉林省腫瘤醫院醫學倫理委員會批準，并簽署知情同意書。

1.2 標本采集 所有SCLC患者（采血點：化療前及化療2周期末）和健康志愿者均分別抽取外周靜脈血2 mL，4oC保存，2 h內檢測。

1.3 試劑與儀器 人SCLC細胞系H446和前列腺癌細胞系PC-3購自美國ATCC細胞庫，胎牛血清、DMEM培養液和胰酶均購自美國Hyclone公司；鼠抗人PE標記的PD-1/PD-L1單克隆抗體（CD279-PE/CD274-PE）、APC標記的CTLA-4單克隆抗體（CD152-PerCP）及鼠抗人CD3、FITC標記的鼠抗人CD4和CD25、PerCP標記的鼠抗人CD8單克隆抗體（CD8-PerCP）及流式細胞儀均購自BD公司。免疫化學染色試劑均購自中杉公司。

1.4 細胞培養 采用DMEM（含10% FBS）培養H446細胞和PC-3細胞，在37oC、5%CO2孵箱內培養，細胞達到90%覆蓋率時進行細胞傳代培養。

1.5 流式細胞儀檢測 100 μL抗凝血中分別加入5 μL抗體，室溫孵育30 min；應用200 μL紅細胞裂解液裂解紅細胞，渦旋振蕩30 s，待抗凝血顏色澄清后立即以2,000 rpm速度離心10 min，去除上清液，加入500 μL PBS重懸細胞沉淀，使用流式細胞儀上機檢測。

1.6 免疫細胞化學檢測蛋白表達 對數期生長的細胞消化后爬片培養24 h，4%多聚甲醛固定細胞，滴加一抗（1：200）濕盒中4oC冰箱孵育過夜。PBS洗滌3次后，滴加反應液（第二抗體），室溫下溫育30 min，DAB試劑盒顯色5 min-10 min或顯微鏡下觀察棕黃色反應后終止。流水沖洗后蘇木素復染，常規樹脂封片。PC-3細胞做陰性對照。

1.7 統計學分析 采用SPSS 17.0統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（Mean±SD）表示，組間差異比較應用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SCLC外周血中CTLA-4在調節性T細胞中高表達 在淋巴細胞、成熟T淋巴細胞（CD3陽性）和輔助性T淋巴細胞（CD4陽性）中，CTLA-4陽性細胞分別為（1.56±1.24）%、（4.87±5.18）%和（3.85±2.60）%，與健康對照組相比無明顯差異（P＞0.05）。在調節性T細胞（CD4和CD25陽性）中，CTLA-4陽性細胞明顯高于健康對照組（7.09±5.09）% vs（1.91±1.27）%，P＜0.001，提示SCLC免疫系統中的調節性T細胞可能通過高表達CTLA-4進一步發揮免疫抑制功能，從而幫助腫瘤實現免疫逃逸（圖1）。

2.2 PD-1在外周血效應性T細胞（CD8+T）中的分布表達 我們首先檢測了SCLC患者外周血中總淋巴細胞和T細胞（PD-1+和CD3+PD-1+）中陽性細胞表達，分別為（8.07±3.97）%和（26.63±9.04）%，對比健康對照組無統計學意義（P＞0.05）。進一步檢測輔助性T細胞（CD4）和效應性T細胞（CD8）中PD-1的表達水平后發現，與健康人相比，PD-1在效應性T細胞中表達水平明顯降低，分別為（22.56±4.21%） vs （11.47±5.85）%，P＜0.001，但在輔助性T細胞中無顯著差別，提示PD-1信號通路主要抑制效應性T細胞而不是輔助性T細胞（圖2）。

2.3 SCLC外周血中PD-1及CTLA4與臨床病理因素的關系CD4+CD25+CTLA-4+細胞和CD8+PD-1+細胞水平與患者的年齡、性別、吸煙狀況、臨床分期以及是否轉移等因素無關（P＞0.05）（表1）。但經2周期化療后CD4+CD25+CTLA-4+及CD8+PD-1+的表達水平比治療前降低，差異具有統計學意義，分別為（6.94±4.91）% vs（5.11±2.60）% 和（11.48±5.91）% vs（8.74±3.39）%，P均＜0.000,1（表2）。

2.4 PD-L1在SCLC外周血及細胞中的分布情況 本研究在SCLC外周血單個核細胞中（圖3A）及T淋巴細胞中（圖3B）均檢測到PD-L1極低水平的表達（0.01±0.001）%，但在SCLC細胞系H446細胞中PD-L1高表達（圖3C），并定位在細胞漿及細胞膜中（圖3D）。

表 1 SCLC患者外周血中CD8+PD-1+及CD4+CD25+CTLA-4+與臨床病理因素的關系Table 1 The relationship between CD8+PD-1+ and CD4+CD25+CTLA-4+ level and clinicopathologic parameters in the patients with SCLC

3 討論

免疫靶向藥物單藥或聯合用藥已經在美國和歐盟批準用于治療多種晚期實體腫瘤，包括晚期非小細胞肺鱗癌和廣泛期小細胞肺癌[12-14]，但缺少公認的療效預測生物標志物，因此難以在治療前對患者進行篩選和分層進行更精準的治療[15]。

腫瘤組織是進行生物標志物研究和檢測的可靠標本來源，但組織活檢由于取材創傷性和對活檢技術及操作人員要求高，組織存在異質性等，在實際臨床診療中具有局限性。以血液為代表的液態標本，具有取材便捷無創、不存在異質性、可多次取樣以實現動態監測的優點，滿足了臨床實踐需求，因此是臨床轉化性研究，尤其是肺癌研究領域的熱點。在非小細胞肺癌的治療中使用液態標本進行分子病理診斷得到廣泛認可，2016年《中國臨床腫瘤學會原發性肺癌診療指南》首次將液態標本（循環游離DNA）和液體活檢納入指南中[16]。可手術的SCLC患者僅占發病人數的5%左右，腫瘤標本獲取更加困難，因此采用血液標本發現新的生物標志物指導SCLC的診療更為迫切。

表 2 化療前后CD4+CD25+CTLA4及 CD8+PD-1的表達水平表 2 The level of CD4+CD25+CTLA4 and CD8+PD-1 prior to chemotherapy (baseline) and after the second cycle of chemotherapy (2nd cycle)

Erfani等[17]發現喉鱗狀細胞癌CTLA4既高表達在CD8+淋巴細胞中，也高表達在CD4+和CD19+淋巴細胞中，我們的結果顯示SCLC患者CD4+細胞表達CTLA-4，但CD4、CTLA-4雙陽性細胞在SCLC和健康人中表達水平無差異。我們對于CD4細胞進行了進一步的分類，發現SCLC CD4+CD25+陽性細胞與健康人無差別，但CD4+CD25+CTLA-4+三陽性細胞水平明顯高于健康人，平均水平約為3倍，因此我們認為SCLC中CTLA-4可能通過調節性T細胞發揮免疫抑制功能，這與龐春等[18]在肝癌中的研究結論一致，該研究認為CD4+CD25+CTLA-4+細胞是一群重要細胞，這類細胞數量的增多可以作為判斷侵襲性、進展的一個潛在重要指標。

有關外周血中PD-1在淋巴細胞中的分布及臨床意義尚無定論。Waki等[19]認為晚期或復發的NSCLC接種合成肽疫苗前后患者外周血中CD4+PD-1+細胞的含量均與總生存相關，而CD8+PD-1+細胞在接種疫苗后含量下降與預后總生存延長有關。Kamphorst等[20]發現經抗PD-1治療后70%的患者Ki-67+PD-1+CD8 T數量升高，該應答是腫瘤特異性的，增殖的CD8+T細胞共表達高水平的PD-1和CTLA-4。在本研究中，我們發現SCLC患者CD4和CD8細胞均表達PD-1，但只有CD8細胞中的PD-1水平比健康人低，而CD4細胞中的PD-1水平在兩組之間無顯著差異，我們認為SCLC外周血中CD8+PD-1+細胞水平對于預測PD-1免疫靶向治療可能具有臨床價值，該研究與Malaspina等[21]在口腔鱗狀細胞癌外周血中的發現不一致，她們認為PD-1+CD4+表達無差異，而CD8+PD-1+細胞比健康對照組高表達。

圖 1 CTLA-4在外周血淋巴細胞中CD4+CD25+上的分布。A：健康對照組；B：SCLC組。Fig 1 Distribution of CTLA-4 in CD4+CD25+ T cells in peripheral blood specimens. A: Healthy control group; B: SCLC group.

圖 2 PD-1在CD8+ T細胞中的分布情況。A：健康對照組；B：SCLC組。Fig 2 Distribution of PD-1 in CD8+ T cells in peripheral blood. A:Healthy group；B: SCLC patients.

圖 3 PD-L1在SCLC外周血和H446細胞中的表達及分布。A：左圖，外周血單個核細胞群（R1門）；右圖，R1門中PD-L1水平；B：左圖，CD3+ T細胞群（R2門）；右圖，R2門中PD-L1水平；C：PD-L1在H446表達（FACS法）；D：PD-L1在H446細胞中表達（ICC法）。PC-3細胞為陰性對照。FACS：流式細胞術；ICC：免疫細胞化學法。Fig 3 Distribution and expression of PD-L1 in peripheral blood of SCLC patients and H446 cells. A: Left, mononuclear cells in peripheral blood (Gate R1); Right, Level of PD-L1 in Gate R1; B: Left, CD3+ T cells(Gate R2); Right, PD-L1 in Gate R2; C: The expression of PD-L1 in H446 cells (FACS); D: PD-L1 expression in H446 cells (ICC) with PC-3 cell as negative control. FACS: flow cytometry; ICC: immunocytochemical method.

本項目還對比了SCLC患者化療前后CD4+CD25+CTLA-4+和CD8+PD-1+水平的變化，用以觀察治療療效與免疫關卡點蛋白表達水平的相關性。結果顯示化療后SCLC CD4+CD25+CTLA-4+細胞和CD8+PD-1+細胞水平相比治療前下降，說明該水平可能與腫瘤負荷相關，該結論與Wang等[22]的研究結果一致。Wang等[22]發現放療和免疫調節治療后癌癥患者外周血中PD-1的mRNA水平明顯升高，聯合分析外周血中PD-1、CTLA-4和其他免疫分子可以為抗PD-1或抗PD-L1治療提供線索。

文獻報道PD-L1高表達于SCLC腫瘤組織，我們在SCLC腫瘤組織（免疫組化法）和SCLC細胞系H446（細胞免疫組化和流式細胞術）中均檢測到高水平的PD-L1表達。我們采用Cellsearch法在循環腫瘤細胞中檢測到PD-L1表達（數據未列），但采用流式細胞術未發現外周血中有PD-L1的表達。這可能是由于外周血中循環腫瘤細胞數目稀少，需要采用比流式細胞術更敏感的方法進行檢測，或先需要富集陽性細胞再進行檢測。有關PD-L1在外周血中的表達研究報道較少，但Kronig等[23]發現III期和IV期黑色素瘤患者外周血Melan-A+CD8+PD1+T細胞與預后總生存無關，但Melan-A+CD8+PD-L1+的表達與預后有關。

本研究具有一定的局限性，我們僅檢測了外周血標本中免疫關卡點蛋白的表達，未檢測相應的配對組織標本；患者主要采用化療，治療方法單一；本研究為非干預性，臨床觀察研究，影響因素較多，后續還需要更多隨機對照研究進一步證實和驗證本研究的結論和發現。