黑素皮質素受體4（MC4R）基因在5個地方雞種中的遺傳多態性分析

周艷+雷秋霞+韓海霞+李福偉+高金波+劉瑋+逯巖+曹頂國

摘要：本試驗采用PCR-SSCP和PCR-RFLP方法分析了黑素皮質素受體4（MC4R）基因在5個地方雞種中的遺傳多態性，結果在5個供試雞群體中檢測到兩個突變位點。在NC_006089.4：g.54 C>G位點中，CC基因型在萊蕪黑雞和瑯琊雞中均沒有檢測到，CG雜合型在汶上蘆花雞中表現為優勢基因型，突變型GG基因型在其余4個群體中表現為優勢基因型，等位基因G在所有供試群體中表現為優勢等位基因。在NC_006089.4：g.315位點中，GT雜合型在汶上蘆花雞中表現為優勢基因型，GG野生型在其余4個群體中表現為優勢基因型，等位基因G在除汶上蘆花雞以外的4個群體中表現為優勢等位基因。

關鍵詞：雞；MC4R基因；PCR-SSCP；PCR-RFLP；遺傳多態性

中圖分類號：S831.2 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2017）08-0127-04

Abstract The SNPs of MC4R gene in five Chinese indigenous Chicken Breeds were detected by PCR-SSCP and PCR-RFLP methods. As a result， two mutations in MC4R gene were identified. In NC_006089.4：g.54 C>G， genotype CC was not found in Laiwu Black chickens and Langya chickens， the frequency of genotype CG was higher than that of the other genotypes in Wenshang Barred chickens， and GG showed to be the advantageous genotype in the other four populations； allele G was dominant in all the five populations. In NC_006089.4： g.315， heterozygous genotype GT was advantageous in Wenshang Barred chickens， and GG was advantageous in other four populations； allele G was dominant in the four populations except Wenshang Barred chickens.

Keywords Chicken； MC4R gene； PCR-SSCP； PCR-RFLP； Genetic polymorphism

黑素皮質素受體4（melanocortin-4 receptor，MC4R）基因屬于黑素皮質素受體家族，為G蛋白耦聯受體超家族的一員。目前，人們已經在5個物種（人、豬、鼠、雞和牛）中分離并克隆出所有的MCRs亞型[1]。已有研究表明，MC4R主要在控制體重、采食量和能量穩態的過程中發揮重要作用[2，3]。MC4R基因多個單堿基突變已被認為與人類肥胖病癥關系密切[4-7]； MC4R-/-小鼠表現為極度肥胖[8]；豬MC4R基因被認為是影響生長肥育性狀的主效基因之一[9]；中國西門塔爾牛MC4R基因表達量也被認為與背膘厚度呈顯著相關[10]。

雞MC4R基因被定位在2號染色體的2q12處，由長996 bp的單一外顯子構成，編碼332個氨基酸，在腎上腺、性腺、脾、脂肪等組織中廣泛表達[11]。目前雞MC4R基因的相關研究結果表明，MC4R基因對雞生長和體組成性狀有顯著影響[12，13]，但對雞脂肪性狀的影響還未有定論。我國地方雞品種資源非常豐富，以肉質鮮美而聞名，本研究采用PCR-SSCP技術和PCR-RFLP技術檢測MC4R基因在我國地方雞種中的遺傳多樣性，以期為我國地方雞種的創新利用提供科學資料和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

5個地方雞種汶上蘆花雞（WL）、濟寧百日雞（JB）、萊蕪黑雞（LH）、瑯琊雞（LY） 和石岐雜雞（SQZ）均來自山東省地方雞品種資源活體基因庫，飼養全階段由專人管理，營養水平一致。每品種隨機抽取30只個體，公母各半，翅靜脈采血，EDTA抗凝，酚/氯仿抽提基因組DNA。-20℃保存備用。

1.2 引物設計

根據雞MC4R基因DNA序列（GenBank號： NC_006089.4），采用Primer Premier 5.0和Oligo 6軟件設計P3引物，P2引物參考李國輝等[14]擴增外顯子區域，引物由上海英俊生物工程有限公司合成。引物2為SSCP引物，擴增目的片段長度為210 bp，引物3為FbrⅠ酶切引物，目的片段長度為610 bp。各引物序列如下：

P2F：5′CCATAAGATGAATTTCACCCAG3′，

P2R：5′TTGCCACAATGACCAAGACG3′；

P3F：5′TAGCCAAGAACAAGAACC3′，

P3R：5′GGGCAGGAGATGTAGAAA3′。

1.3 PCR擴增

PCR擴增體系（10 μL）：2×Taq PCR MasterMix（北京天根）5 μL，ddH2O 3.6 μL，引物（10 pmol/μL） 各0.3 μL，模板DNA（50 ng/μL）0.8 μL。

PCR程序：94℃ 5 min；94℃ 40 s，55.6℃（P2）/50.6℃（P3）40 s，72℃ 1 min，35個循環；最后72℃延伸10 min。endprint

1.4 PCR-SSCP分析

10 μL引物2的PCR產物98℃變性8 min后，冰浴5 min，12%非變性聚丙烯酰胺凝膠（Acr∶Bis=29∶1）電泳，250 V電泳30 min后160 V繼續電泳16～17 h。電泳結束后進行銀染顯帶并記錄結果。

1.5 PCR-RFLP分析

酶切反應體系15 μL，其中FbrⅠ內切酶0.5 μL（10 U/μL），10×Buffer G 1 μL，P3引物PCR產物8 μL，ddH2O 5.5 μL，37℃恒溫水浴過夜。

電泳檢測：2.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V電泳1 h，于紫外燈下觀察并拍照，檢測酶切產物。

1.6 序列分析

經PCR-SSCP和PCR-RFLP基因分型后，每個基因型取兩個不同個體的PCR擴增產物在濟南科益科技有限公司進行獨立測序。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

用設計的兩對引物對5個地方雞種的基因組DNA進行擴增，所得PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖1。引物2的擴增片段長度為210 bp，引物3的擴增片段長度為610 bp，擴增條帶均單一、明亮，片段長度符合預期要求，無非特異性條帶產生，可以用于后續分析。

2.2 基因分型結果

在12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳條件下，對5個地方雞種引物2的PCR產物進行SSCP分析，對引物3進行FbrⅠ酶切檢測，結果每對引物各檢測到 3種基因型，具體見圖2。

引物2的3種基因型分別命名為CC、CG、GG。引物3的分別命名為GG、GT、TT，其中TT型條帶為244、208、112 bp和46 bp，GG型條帶為320、244 bp和46 bp，GT型條代為320、244、208、112 bp和46 bp。

2.3 不同基因型個體的序列測定結果

測序結果（圖3）表明， P2引物和P3引物位點多態性均由該段序列中的1個核苷酸的點突變造成， 分別為54 bp處發生點突變C→G（反向測序）， 命名為NC_006089.4：g.54 C>G和315 bp處發生點突變由G→T，命名為NC_006089.4：g.315 G>T。我們將與GenBank發布序列一致的純合基因型命名為野生型，根據這個原則，NC_006089.4：g.54 C>G位點，基因型CC為野生型，GG為突變型；NC_006089.4：g.315 G>T位點GG為野生型，TT為突變型。

2.4 各多態位點的基因型頻率和等位基因頻率

對汶上蘆花雞、萊蕪黑雞、濟寧百日雞、石岐雜雞和瑯琊雞進行了MC4R基因兩個多態位點的基因型檢測，計算了各品種的基因型頻率和等位基因頻率，結果見表1。

由表1可知，在NC_006089.4：g.54 C>G多態性位點中，CC基因型在萊蕪黑雞和瑯琊雞中均沒有檢測到，CG雜合型在汶上蘆花雞中表現為優勢基因型，突變型GG基因型在其余4個群體中表現為優勢基因型，等位基因G在所有供試群體中表現為優勢等位基因。在NC_006089.4：g.315多態位點中，GT雜合型在汶上蘆花雞中表現為優勢基因型，GG野生型在其余4個群體中表現為優勢基因型，等位基因G在除汶上蘆花雞以外的4個群體中表現為優勢等位基因。

3 討論與結論

中樞黑皮素神經系統在攝食行為及能量代謝中起著重要作用，而MC4R基因在這個復雜的信號通路中起關鍵作用，其V103I突變被證實與人類肥胖密切相關[15，16]。劉桂蘭等[17]研究表明MC4R基因多態性與豬平均背膘、腰椎間膘厚等脂肪性狀顯著相關，李長龍等[18]也證實MC4R基因多態性與豬肌內脂肪和背膘都有顯著相關性。除與脂肪性狀密切相關外，MC4R基因多態性也被表明與兔[19]、鴿[20]和鵝[21]的生長及體組成相關。李國輝等[14]在培育品種京海黃雞中檢測到MC4R基因的2個突變位點，隨后陶勇等[22]分析了其中一個位于編碼區662位點的突變與京海黃雞生長性能的相關性，結果表明該位點突變與京海黃雞4、8、12和16周齡體重顯著相關。

本研究分析了MC4R基因的兩個突變位點共6種基因型在5個地方雞種中的分布，結果表明所檢測的兩個突變位點在5個供試群體中的多態性并不豐富，NC_006089.4：g.54 C>G多態性位點CC基因型在萊蕪黑雞和瑯琊雞中均沒有檢測到，這與陶勇等[22]、李國輝等[14]就該位點在京海黃雞中的研究結果一致，表明該位點在我國部分地方雞種及其培育品種中的分布基本一致。值得注意的是，所檢測的兩個突變中，汶上蘆花雞的優勢基因型均與其他4個地方雞種表現不一致，這是否暗示汶上蘆花雞與其他雞種的遺傳距離較遠還需進一步驗證。但在所有5個地方雞種中，兩個突變位點的優勢等位基因表現一致，而我國地方雞種以肉質鮮美而聞名，所以本研究檢測到的優勢基因型和等位基因可否作為肉質性狀的分子標記應用于我國地方雞種的創新利用有待于進一步驗證。

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