CMIA與HPLC監(jiān)測(cè)新生兒萬古霉素血藥濃度的比較研究

唐喆，王菲，童鑫，賈巖巖

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院，江蘇 南京 210004）

CMIA與HPLC監(jiān)測(cè)新生兒萬古霉素血藥濃度的比較研究

唐喆，王菲，童鑫，賈巖巖

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院，江蘇 南京 210004）

目的：比較化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法（CMIA）和高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定新生兒血漿中萬古霉素濃度所得結(jié)果的區(qū)別與相關(guān)程度。方法：建立測(cè)定新生兒萬古霉素血藥濃度的HPLC，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。收集新生兒患者萬古霉素峰谷濃度血漿樣本，分別用CMIA與HPLC進(jìn)行測(cè)定，比較兩種測(cè)定方法的異同。結(jié)果：CMIA和HPLC檢測(cè)的新生兒萬古霉素血藥濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HPLC測(cè)定結(jié)果均值高于CMIA，Passing-Bablok回歸結(jié)果顯示兩種測(cè)定方法相關(guān)性較好，一致性欠佳。結(jié)論：CMIA和HPLC測(cè)定新生兒萬古霉素血漿藥物濃度所得結(jié)果有明顯差異，臨床進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)時(shí)應(yīng)予以注意，避免跨系統(tǒng)監(jiān)測(cè)。

化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法；高效液相色譜法；萬古霉素；新生兒；血藥濃度監(jiān)測(cè)

萬古霉素是一種糖肽類抗生素，臨床用于治療革蘭氏陽性菌特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）所致的嚴(yán)重感染。萬古霉素具有一定的腎毒性與耳毒性，臨床應(yīng)用時(shí)個(gè)體差異較大，用于新生兒時(shí)尤其應(yīng)謹(jǐn)慎使用，避免血藥濃度過高，防止不良反應(yīng)發(fā)生。但萬古霉素血藥濃度過低，易誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥菌，導(dǎo)致治療失敗。因此，萬古霉素應(yīng)用于新生兒時(shí)必須進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)，并根據(jù)監(jiān)測(cè)結(jié)果及時(shí)調(diào)整萬古霉素劑量[1-2]。

監(jiān)測(cè)萬古霉素血藥濃度的主要技術(shù)方法有高效液相色譜法（HPLC）、化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法（CMIA）、酶放大免疫法（EMIT）等。國(guó)外近期研究顯示，不同的檢測(cè)技術(shù)方法對(duì)新生兒萬古霉素血藥濃度的監(jiān)測(cè)有重大影響，直接影響臨床個(gè)體化給藥[3]。《萬古霉素臨床應(yīng)用中國(guó)專家共識(shí)（2011年版）》也并未提示不同血藥濃度檢測(cè)方法之間的差異[4]。因此不同方法所得測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性、一致性亟待驗(yàn)證。

目前，國(guó)內(nèi)比較HPLC與CMIA測(cè)定萬古霉素血藥濃度的研究較少，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)方法選擇不當(dāng)?shù)那闆r[5]。本次研究收集使用萬古霉素治療的新生兒血樣119份，分別用HPLC與CMIA進(jìn)行測(cè)定，評(píng)價(jià)兩種方法的相關(guān)性與一致性，為臨床提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀（1525泵，2487紫外檢測(cè)器，2707自動(dòng)進(jìn)樣器，Empower 3色譜工作站）；Architect I1000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀；Mettler XS105DU分析天平；Eppendorf 5424R 高速冷凍離心機(jī)。

1.2 試藥

萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130360-201302，純度99.2%）；色譜純甲醇、乙腈；分析純磷酸二氫鉀、高氯酸、磷酸；注射用水（安徽雙鶴藥業(yè)，批號(hào)：1502106A）；萬古霉素試劑盒、標(biāo)準(zhǔn)曲線盒與質(zhì)量控制試劑盒（Abbott公司）；空白成人血漿由南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。

1.3 樣本

樣本來源于2015年1月- 2016年12月南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院使用萬古霉素治療的新生兒患者，于第4劑或第5劑給藥前采血測(cè)定谷濃度（C谷），于萬古霉素靜滴結(jié)束后0.5 h采血測(cè)定峰濃度（C峰）。每份采集到的血樣離心后分成兩份血漿樣品，4℃冰箱內(nèi)保存，分別用于HPLC和CMIA測(cè)定萬古霉素血藥濃度，取樣后24 h內(nèi)完成檢測(cè)。

2 方法

2.1 HPLC

2.1.1 溶液的配制 精密稱取萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品50 mg于100 mL容量瓶中，加入注射用水稀釋至刻度，搖勻，得萬古霉素儲(chǔ)備液，4℃避光保存。將萬古霉素儲(chǔ)備液稀釋成濃度為12.5，25.0，50.0，125.0，250.0，500.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。精密稱取磷酸二氫鉀6.8 g，加注射用水溶解至1000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.2，0.45 μm微孔濾膜濾過，超聲脫氣后備用。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：Waters SunFire C18柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液（V/V，20∶80，pH＝3.2）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：236 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.1.3 樣品前處理 取血清樣品300 μL于1.5 mL EP管中，加入225 μL沉淀劑（甲醇-乙腈-6%高氯酸:1∶1∶6，V/V/V）沉淀蛋白，渦旋混勻1 min，13 500 r/min離心10 min，取上清經(jīng)0.45 μm針頭過濾器濾過后，轉(zhuǎn)入樣品瓶中待測(cè)。

2.1.4 方法學(xué)考察 ①線性關(guān)系考察。取“2.1.1”項(xiàng)下萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液75 μL，加入空白血清300 μL，配制成含萬古霉素2.5～100.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)濃度血漿樣本，按“2.1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行預(yù)處理，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。記錄萬古霉素的保留時(shí)間（tR），以樣品峰面積（Y）對(duì)濃度（C）進(jìn)行線性回歸。②專屬性考察。使用萬古霉素進(jìn)行治療的新生兒患者往往合并使用多種抗菌藥治療感染，可能會(huì)對(duì)萬古霉素血藥濃度測(cè)定造成潛在影響。配制含萬古霉素、頭孢他啶、阿莫西林、頭孢哌酮、哌拉西林、頭孢曲松、美羅培南、氟康唑的血漿樣本，預(yù)處理后進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各抗菌藥色譜峰與萬古霉素色譜峰之間的分離度。③回收率、精密度、穩(wěn)定性考察。配制萬古霉素濃度為2.5，25.0，100.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)濃度血樣各5份，每個(gè)質(zhì)量濃度連續(xù)測(cè)量3次，連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算3個(gè)質(zhì)量濃度日內(nèi)精密度和日間精密度。所測(cè)得藥物峰面積代入回歸方程計(jì)算，以計(jì)算測(cè)得量與加入量之比即方法回收率；所測(cè)得藥物峰面積除以同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液所得峰面積，以計(jì)算提取回收率。3種質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)濃度血樣于4℃冰箱內(nèi)保存，于0，4，8，12，24 h取樣測(cè)定，計(jì)算峰面積RSD值即穩(wěn)定性。

2.1.5 患者血漿測(cè)定 取待測(cè)血漿，按“2.1.3”項(xiàng)下所述方法處理分析，用相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中萬古霉素的含量。

2.2 CMIA

取質(zhì)量濃度為0.0，5.0，10.0，25.0，50.0，100.0 μg/mL的萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品，以萬古霉素試劑盒檢測(cè)，得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，運(yùn)行后儀器進(jìn)行自動(dòng)測(cè)試與標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合。精密度、回收率、線性、專屬性等性能指標(biāo)均按照ARCHITECT系統(tǒng)操作手冊(cè)執(zhí)行。每次檢測(cè)患者樣品時(shí)均按照儀器標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范測(cè)定，儀器自行取樣、分析測(cè)定，每批血漿樣本測(cè)定時(shí)需進(jìn)行質(zhì)控樣品的平行測(cè)定。

2.3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)得到的C谷和C峰進(jìn)行分別比較。采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)樣本正態(tài)性。如符合正態(tài)分布，則用配對(duì)t檢驗(yàn)比較兩組測(cè)定結(jié)果有無差異，反之則用Wilcoxon配對(duì)檢驗(yàn)。回歸分析采用Passing-Bablok。采用R軟件（R i386 3.2.5）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3 結(jié)果

3.1 HPLC方法學(xué)考察結(jié)果

在上述色譜條件下，萬古霉素tR為7.219 min，與其他內(nèi)源性物質(zhì)分離完全（見圖1），在濃度2.5～100.0 μg/mL的范圍內(nèi)線性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：

Y＝9606.8C－6962.4，r＝0.9996（n＝5）。

HPLC的定量限為2.5 μg/mL，檢測(cè)限為1.0 μg/mL。

據(jù)圖2可知，萬古霉素與阿莫西林、頭孢哌酮、頭孢他啶的分離度均大于1.5，而哌拉西林、頭孢曲松、美羅培南、氟康唑在該前處理和色譜條件下不出峰，可見上述藥物在臨床與萬古霉素合并使用時(shí)，不會(huì)對(duì)萬古霉素血藥濃度監(jiān)測(cè)產(chǎn)生影響。

由表1可見，萬古霉素的回收率和精密度符合生物樣本的測(cè)定要求。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，萬古霉素血漿樣本24 h內(nèi)在4℃環(huán)境下保持穩(wěn)定。

圖1 HPLC檢測(cè)萬古霉素血漿樣品色譜圖

圖2 含多種抗生素的萬古霉素血漿樣品色譜圖

表1 HPLC回收率、精密度、穩(wěn)定性結(jié)果

3.2 HPLC與CMIA的比較

本次研究從臨床采集萬古霉素谷濃度血漿樣品84例，峰濃度樣品35例。將每份樣品分別用HPLC與CMIA進(jìn)行檢測(cè)。正態(tài)分布性結(jié)果顯示，兩種方法所得C谷、C峰，兩種方法測(cè)定差值均呈正態(tài)分布。應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)比較兩種方法所得C谷和C峰，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

計(jì)算兩種方法所得測(cè)定值的相對(duì)偏差（RE）：

RE（%）＝（兩種方法測(cè)定差值/兩種方法測(cè)定均值）×100%

并以RE為縱坐標(biāo)，兩種方法測(cè)定均值為橫坐標(biāo)，分別繪制C谷和C峰的Bland-Altman偏差圖（圖3）。對(duì)于C谷，有5.95%的點(diǎn)在95%的一致性界限以外；對(duì)于C峰，有5.71%的點(diǎn)在95%的一致性界限以外。此外，HPLC所得測(cè)定值明顯高于CMIA，RE絕對(duì)值最大為35.65。可見兩種方法測(cè)定值相差幅度較大，故認(rèn)為兩種方法測(cè)定值的一致性欠佳。

Passing-Bablok回歸結(jié)果見表2和圖4。回歸方程的截距和斜率的95%置信區(qū)間提示兩種檢測(cè)方法之間的固定誤差和比例誤差大小。C谷和C峰所得回歸方程的斜率非常接近于1，表明兩種方法測(cè)定的結(jié)果之間比例誤差很小，且存在著良好的直線相關(guān)關(guān)系（Spearman系數(shù)＞0.95）。C谷和C峰所得回歸方程的截距明顯遠(yuǎn)離原點(diǎn)，表明兩種檢測(cè)方法之間存在一定的固定誤差，這也與Bland-Altman偏差圖顯示的結(jié)果一致。

圖3 Bland-Altman偏差圖

圖4 Passing-Bablok回歸圖

表2 HPLC與CMIA的回歸和相關(guān)性分析

4 討論

本次研究納入萬古霉素血漿樣本數(shù)量較多，所得結(jié)果與以往研究有所差別。本次研究結(jié)果顯示，CMIA與HPLC測(cè)定值之間相關(guān)性良好，一致性欠佳，HPLC測(cè)定結(jié)果明顯高于CMIA。兩種檢測(cè)方法均會(huì)受到萬古霉素代謝產(chǎn)物、血漿中內(nèi)源性物質(zhì)及臨床樣本條件的影響。CMIA的原理為：以樣本、萬古霉素抗體包被順磁微粒子后，與吖啶酯標(biāo)記的丙戊酸結(jié)合物混合，制成反應(yīng)混合物，萬古霉素抗體包被的微粒子與樣本中的吖啶酯標(biāo)記的萬古霉素結(jié)合物結(jié)合，沖洗，加入預(yù)激發(fā)液和激發(fā)液到反應(yīng)混合物中，測(cè)量其發(fā)生的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。血漿樣本中的蛋白、鹽等內(nèi)源性物質(zhì)含量各有不同，對(duì)樣本中的萬古霉素和抗體結(jié)合的影響也各有不同，特別是對(duì)于萬古霉素濃度較低的樣本[6]。本次研究結(jié)果也顯示，C谷的相對(duì)偏差大于C峰。HPLC在方法研究時(shí)，難以取得新生兒空白血漿配制標(biāo)準(zhǔn)濃度血漿樣本，新生兒空白血漿的色譜圖與成人有明顯不同，造成方法開發(fā)時(shí)存在一定局限性。HPLC的前處理較為簡(jiǎn)單，但使得檢測(cè)結(jié)果易受到血漿基質(zhì)效應(yīng)的影響，檢測(cè)背景偏高。這可能是造成HPLC的測(cè)定值高于CMIA的原因。

比較兩種分析方法時(shí)，除了關(guān)注兩種方法的測(cè)定值是否相關(guān)以外，更重要的是考察兩者的差異程度。研究方法主要有回歸法和圖解法。回歸法分析中，最小二乘法易受到數(shù)據(jù)的分布形態(tài)、線性關(guān)系、異常值等因素的影響，此外，最小二乘法假定測(cè)量方法不存在誤差。考慮到這些局限性，在比較儀器分析方法結(jié)果時(shí)，宜采用Passing-Bablok回歸等[7-9]。在差值呈正態(tài)分布的前提下，可使用Bland-Altman偏差圖法直觀地反映兩種檢測(cè)方法之間的差異性[10-11]。

綜上所述，臨床均可應(yīng)用HPLC與CMIA監(jiān)測(cè)新生兒萬古霉素血藥濃度，兩種方法所得結(jié)果相關(guān)性較好，但差異明顯，使用二者的檢測(cè)結(jié)果以及在閱讀萬古霉素血藥濃度測(cè)定相關(guān)專業(yè)文獻(xiàn)時(shí)，需要考慮檢測(cè)方法的差異，臨床上也應(yīng)避免跨系統(tǒng)監(jiān)測(cè)。

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本文編輯：魯守琴

The Comparative Study of Comparing Chemiluminescent Micro-particle Immunoassay (CMIA) and High Performance Liquid Chromatography (HPLC) for Determination of Serum Vancomycin Concentrations from Neonates

Tang Zhe, Wang Fei, Tong Xin, Jia Yan-yan
(Obstetrics and Gynecology Hospital Affliated to Nanjing Medical University, Jiangsu Nanjing 210004,China)

Objective：To compare the difference and correlation of Chemiluminescent Micro-particle Immunoassay (CMIA) and High Performance Liquid Chromatography (HPLC) for determination of serum vancomycin concentrations from neonates. Methods：A HPLC method to determine vancomycin serum concentrations from neonates was established and verified. The plasma sample of vancomycin in peak valley concentration were collected and detected by CMIA and HPLC, respectively. At last, the similarities and differences of two methods were compared. Results：The significant difference was existed between this two methods (P＜0.05), and the average concentrations of HPLC was higher than CMIA. The Pass-Bablok regression indicated that the correlation of two methods was satisfactory while the consistency was limited. Conclusion：The signifcant difference is existed between two methods when vancomycin serum samples from neonates are analyzed by CMIA and HPLC. More attention should be paid to monitoring serum concentration in clinical, and cross-system monitoring should be avoided.

Chemiluminescent Micro-particle Immunoassay (CMIA); High Performance Liquid Chromatography (HPLC); Vancomycin; Neonates; Blood Concentration Monitoring

R969；R927.2

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.07.018

2017 - 05 - 08

南京藥學(xué)會(huì)－常州四藥醫(yī)院藥學(xué)科研基金（2015YX013）

唐喆，女，碩士，主管藥師。研究方向：藥物分析。E-mail：tjj870520@hotmail.com

王菲，女，副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。E-mail：361998364@qq.com