RP-HPLC測定助孕丸中兩種蒽醌類成分的含量

劉菊，白明學，張紅偉，董玉珍

（1．鄭州市中醫院制劑室，河南 鄭州 450007；2．鄭州市食品藥品檢驗所，河南 鄭州 450007）

RP-HPLC測定助孕丸中兩種蒽醌類成分的含量

劉菊1，白明學1，張紅偉2，董玉珍2

（1．鄭州市中醫院制劑室，河南 鄭州 450007；2．鄭州市食品藥品檢驗所，河南 鄭州 450007）

目的：建立反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定助孕丸中兩種蒽醌類成分的含量。方法：采用RP-HPLC進行測定，以Angilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，以甲醇∶0.1%磷酸溶液（85∶15）為流動相，流速：1.0 mL/min，檢測波長：254 nm。結果：結果大黃素、大黃酚分別在0.026 8～0.134 μg，0.064 6～0.322 8 μg范圍內線性關系良好（r＝0.999 9，0.999 9），平均回收率分別為100.4%，99.8%。結論：該方法簡便、快速、準確，可有效地控制助孕丸中兩種蒽醌類成分的含量。

RP-HPLC；助孕丸；大黃素；大黃酚

助孕丸是由大黃、桃仁、枳殼、細辛等7味中藥制備而成的院內制劑，具有活血化瘀，補腎溫經的功效。用于排卵功能障礙，黃體功能不全，月經失調。目前助孕丸的質量標準比較落后，無含量測定項，為了有效控制本制劑質量，本研究建立反相高效液相色譜法（RP-HPLC）同時測定兩種蒽醌類成分（大黃素、大黃酚）的含量，現報道如下。

1 儀器、試劑和藥品

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），UV-2550紫外可見分光光度計（日本島津儀器設備有限公司），ME204電子分析天平（梅特勒-托利多稱重系統設備有限公司）。

1.2 試劑

大黃素對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量測定用，含量以98.7%計，批號：111756-201512），大黃酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量測定用，含量以100.0%計，批號：111796-200716），甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

1.3 藥品

助孕丸[批準文號：豫藥制字Z20130199（鄭），鄭州市中醫院制劑室生產，批號：160527，160807，161203]藥物組成：大黃、桃仁、枳殼、細辛、沉香、紫豆蔻、木香。

2 方法與結果

2.1 色譜條件[1-4]

色譜柱Angilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相甲醇∶0.1%磷酸溶液（85∶15），流速：1.0 mL/min，檢測波長：254 nm，柱溫為室溫。

2.2 對照品溶液的制備

取大黃素、大黃酚對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL含大黃素5.36 μg、大黃酚12.91 μg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備[5-8]

取研細后的樣品約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇25 mL，稱定質量，加熱回流1 h，放冷，用乙醇補足減失質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液10 mL，置燒瓶中，蒸干，加30%乙醇-鹽酸（10∶1）的混合溶液15 mL，置水浴中加熱回流1 h，立即冷卻，用三氯甲烷強力振搖提取4次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣用無水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）的混合溶液溶解，轉移至25 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 陰性溶液的制備

取缺大黃的陰性制劑約1 g，精密稱定，按照“2.3”項下供試品溶液方法制備。

2.5 系統性試驗

按“2.1”項下色譜條件，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性制劑溶液各10 μL，注入液相色譜儀中，記錄色譜峰。理論板數按大黃素峰計＞2000，分離度＞1.5，陰性無干擾，見圖1。

2.6 方法學考察

2.6.1 線性關系考察 取“2.2”項下對照品混合溶液，分別精密吸取5，10，15，20，25 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積。以進樣量（μg）為橫坐標，峰面積（mAU）為縱坐標繪制標準曲線，得大黃素、大黃酚回歸方程分別為：

Y＝2832.1X＋105，r＝0.999 9；

Y＝4560.8X＋397.5，r＝0.999 9。

結果表明大黃素、大黃酚在0.0268～0.134 μg和0.0646～0.3228 μg范圍內線性良好。

2.6.2 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，重復進樣6次，記錄峰面積，大黃素、大黃酚RSD分別為0.11%，0.21%，說明儀器精密度良好。見表1。

圖1 系統性試驗色譜圖

表1 精密度試驗

2.6.3 重復性試驗 取樣品（批號：160527）6份，按“2.3”項下方法制備，分別進樣10 μL，記錄峰面積，計算大黃素、大黃酚含量，結果RSD分別為1.4%，0.56%，說明重復性較好。見表2。

2.6.4 日內穩定性試驗 精密吸取供試品溶液（批號：160527），分別在0，2，4，6，8，12 h按“2.1”項下色譜條件進樣10 μL，記錄大黃素、大黃酚峰面積，RSD分別為0.13%，0.16%，表明溶液在12 h內穩定，見表3。

2.6.5 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品（批號：160527）10份，每份0.5 g，精密稱定，分別加入大黃素、大黃酚，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，計算回收率，結果平均回收率為100.4%，99.8%，RSD分別為0.47%，0.44%，結果見表4，表5。

2.7 供試品含量測定

取助孕丸三批，按照“2.3”項下方法制備，分別吸取對照品溶液、供試品溶液各10 μL，按照“2.1”項下色譜條件注入液相色譜儀，記錄峰面積，以外標一點法計算供試品中兩種蒽醌類成分含量，結果見表6。

表2 重復性試驗

表3 日內穩定性試驗

表4 大黃素加樣回收率試驗

表5 大黃酚加樣回收率試驗

表6 樣品測定結果

3 討論

3.1 最大吸收波長確定

實驗中，將一定濃度兩種蒽醌類成分對照品溶液加甲醇溶解稀釋至合適濃度，用紫外分光光度計在200～400 nm范圍內進行波長掃描，結果在254 nm處有最大吸收，因此波長確定為254 nm。

3.2 流動相、流速確定

參照《中華人民共和國藥典》（2015年版）及相關文獻[9-14]，選擇甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水、甲醇-0.2%磷酸水3種系統作為流動相調試，結果，甲醇-0.1%磷酸水出峰效果較好，然后甲醇-0.1%磷酸水不同比例進行調試，甲醇∶0.1%磷酸水比例在（85∶15）時供試品溶液中兩種蒽醌類成分峰分離良好，且陰性無干擾，由此試驗確定流動相比例為甲醇∶0.1%磷酸水（85∶15）。將流速分別調為0.8，1.0，1.2 mL/min，結果1.0 mL/min，分離度、保留時間均較好，流速定為1.0 mL/min。

本文首次建立高效液相色譜法同時測定助孕丸中兩種蒽醌類成分含量，為今后質量控制提供參考。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2015年版)一部[S].北京:中國醫藥科技出版社,2015:23,494.

[2] 方既明,章懷奮.高效液相色譜法同時測定麻仁丸中大黃素、大黃酸、大黃素甲謎、蘆薈大黃素的含量[J].中南藥學,2011,9(5):342-346.

[3] 薛小平,鹿燕敏,王倩,等.HPLC法測定清熱解毒方蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲謎的含量[J].中國實驗方劑學雜志,2009,15(7):6-8.

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[6] 崔玉芹,董振敏,門金玉,等.高效液相色譜法測定通舒口爽膠囊中大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲謎的含量[J].中南藥學,2009,7(1):20-23.

[7] 王洪志,范俊婷,劉勇,等.HPLC法測定清胰片中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚的含量[J].中國實驗方劑學雜志,2008,14(9):13-15.

[8] 許乾麗,茅向軍,宋曉寧,等.HPLC法同時測定六味安消膠囊中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲謎的含量[J].藥物分析雜志,2010,,30(10):1841-1844.

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本文編輯：魯守琴

Content Determination of Two Anthraquinones in Zhuyun Pills by RP-HPLC

Liu Ju1, Bai Ming-xue1, Zhang Hong-wei2, Dong Yu-zhen2
(1. Drug Preparation Room, Zhengzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, Henan Zhengzhou 450007,China ; 2. Zhengzhou Institute for Food and Drug Control, Henan Zhengzhou 450007,China)

Objective：To establish a method of RP-HPLC which determinate the content of two anthraquinones in zhuyun pills. Methods：The RP-HPLC was adopted to determinate and the Angilent C18(4.6 mm× 250 mm, 5 μm)was chosen as chromatographic column. The mobile phase set as methanol∶0.1% phosphoric acid (85∶15). The fow rate was 1.0 mL/min and using 254 nm as detection wavelength. Results：The linear relationship of emodin and chrysophanol was good (r＝0.999 9, 0.999 9), which between 0.026 8～0.134 μg or 0.064 6～0.322 8 μg, respectively. The average recovery was 100.4% and 99.8%, respectively. Conclusion：This method is simple, fast and accurate, which can effectively control the content of two anthraquinones in zhuyun pills.

RP-HPLC; Zhuyun Pills; Emodin; Chrysophanol

R917

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.07.019

2017 - 04 - 20

河南省中醫藥科學研究專項課題（編號：2015ZY02077）

劉菊，女，碩士，主管藥師。研究方向：中藥制劑、藥物分析。通訊作者E-mail：61843889@qq.com