碳納米管對樹突狀細(xì)胞成熟和T細(xì)胞分化作用研究

代亞麗 聶 欣 劉 健 孟 潔 許海燕

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，北京 100005)

碳納米管對樹突狀細(xì)胞成熟和T細(xì)胞分化作用研究

代亞麗 聶 欣 劉 健#孟 潔#*許海燕#*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，北京 100005)

Th分化在免疫應(yīng)答過程中起著關(guān)鍵性的作用，主要由樹突狀細(xì)胞來調(diào)控。碳納米管是由碳元素組成的空心管狀納米材料，可作為抗原載體。碳納米管對樹突狀細(xì)胞和Th分化的影響是決定其免疫響應(yīng)的關(guān)鍵因素。分析氧化多壁碳納米管(CNT)對小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(BMDCs)功能的影響，以及對過敏抗原多肽OVA323-339的 Th1和Th2免疫反應(yīng)的影響。實驗結(jié)果顯示，BMDCs大量吞噬CNT，但對其細(xì)胞表面活化標(biāo)志分子CD86、MHCII以及細(xì)胞因子TNF-α表達(dá)沒有明顯變化。CNT/抗原復(fù)合物可促進(jìn)BMDCs表面MHCII的表達(dá)和CD8+T細(xì)胞增殖，增殖細(xì)胞的比例由28.7%分別增加到40.6%、41.3%和29.6%。Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-13和IL-10的表達(dá)和CD4+T的增殖受到抑制，增殖細(xì)胞的比例由54.4%減少到38.9%、46.6%和39.8%。研究結(jié)果提示，CNT不影響DCs的成熟和活化，但CNT可以影響過敏抗原的Th分化平衡，可抑制Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)Th1型免疫響應(yīng)。

樹突狀細(xì)胞；碳納米管；Th分化；抗炎細(xì)胞因子；過敏抗原

引言

碳納米管具有典型的納米結(jié)構(gòu)和高比表面積，可以與生物大分子結(jié)合，易透過細(xì)胞膜被多種細(xì)胞攝取，可以作為生物分子的高效載體[1-5]。有研究將碳納米管與手足口病多肽抗原結(jié)合，發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)的鋁佐劑相比，碳納米管引起了更強(qiáng)的特異性抗體產(chǎn)生[6]，可顯著地促進(jìn)半抗原特異性抗體產(chǎn)生[7]。此外，有研究稱多壁碳納米管可加重小鼠的過敏性呼吸道炎癥反應(yīng)[8-9]。

Th分化在免疫應(yīng)答過程中起著關(guān)鍵性的作用，其中Th1分化促進(jìn)CD8效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒及吞噬功能，Th2分化促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體[10-11]。Th2分化在過敏反應(yīng)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用， Th2型細(xì)胞因子(特別是IL-4和IL-13)可激活Th2型免疫反應(yīng)[12-13]。OVA323-339多肽是卵清蛋白(ovalbumin，OVA)的過敏抗原表位，主要與MHCII分子結(jié)合，引起過敏反應(yīng)[14]。碳納米管是否促進(jìn)過敏抗原的免疫效應(yīng)，是值得關(guān)注的問題。本研究制備了水分散性的氧化多壁碳納米管，通過透射電鏡、特異性抗體、ELISA試劑盒等，檢測了碳納米管及其負(fù)載OVA323-339抗原后對小鼠骨髓細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞活化情況的影響，分析氧化多壁碳納米管對過敏抗原免疫反應(yīng)的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑與材料

健康雌性C57BL/6小鼠購自維通利華動物技術(shù)有限公司，重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)購自PEPROTECH公司，卵清蛋白抗原多肽OVA323-339購自南京金斯瑞生物科技有限公司，CpG寡聚核苷酸(ODN 1826)購自InvivoGen公司，抗小鼠CD11c、MHC II、CD86、CD4和CD8以及小鼠IL-4、IL-10、IL-13和TNF-α ELISA試劑盒購自eBioscience公司，原始多壁碳納米管(50 μm)購自中科院成都有機(jī)化學(xué)有限公司。

1.2 碳納米管的氧化處理

多壁碳納米管的氧化過程參考文獻(xiàn)[15]的方法，將原始多壁碳納米管加入到混合濃酸中(濃硝酸∶濃硫酸=1∶3)，超聲探頭處理后純水洗滌至中性并干燥，得到氧化碳納米管(oxidized carbon nanotubes，CNT)。將CNT滅菌處理后，在超聲探頭輔助下分散到培養(yǎng)基中，離心收集上清，得到CNT培養(yǎng)基溶液。

1.3 體外誘導(dǎo)、培養(yǎng)小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞

將4周齡C57BL/6小鼠斷頸處死，浸入75% 酒精30 s后，在超凈臺中分離小鼠的股骨和脛骨。剪斷兩端骨帽后用RPMI 1640培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，經(jīng)洗滌、紅細(xì)胞裂解后，將含GM-CSF的完全培養(yǎng)基(10 ng/mL GM-CSF、10% FBS)加入到骨髓細(xì)胞中。隔天半量換液至第6 d，細(xì)胞表面可觀察到明顯的刺突形成，收集懸浮細(xì)胞，得到小鼠骨髓細(xì)胞來源樹突狀細(xì)胞(bone marrow derived dendritic cells，BMDCs)[16]。將CD11c抗體加入到細(xì)胞懸液中，4℃孵育1 h后流式細(xì)胞儀(Accuri C6，BD)檢測。將10 μL細(xì)胞懸液滴于載玻片上，自然晾干后用瑞士-吉姆薩溶液染色，中性樹脂封片后油鏡(Olympus IX53)觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4 CNT對BMDCs活性的影響

將不同濃度的CNT(0.01、0.03和0.1 mg/mL)加入到BMDCs中，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，將CD11c抗體加入到細(xì)胞中。利用流式細(xì)胞儀分析CNT對BMDCs活性的影響。在流式散點圖中，活細(xì)胞具有較大的前向光(FSC)和側(cè)向光(SSC)。通過圈門選出較大FSC和CD11c+細(xì)胞在所有細(xì)胞中的比例，可分析不同濃度CNT對BMDCs活性的影響。

1.5 BMDCs對CNT的攝取

將CNT(0.03 mg/mL)加入到BMDCs中，37℃、5% CO2孵育24 h后，收集細(xì)胞團(tuán)。經(jīng)戊二醛固定、洗滌、鋨酸固定、乙醇脫水和樹脂包埋后，將CNT處理的BMDCs細(xì)胞制備成超薄切片后，利用透射電鏡(TEM, JEM-1400-plus)觀察BMDCs對CNT的攝取情況。

1.6 CNT對BMDCs成熟和活化的影響

CNT/CpG混合物的制備：將CNT與CpG充分混合(0.03 mg/mL CNT:1 μM CpG)，室溫放置30 min后，得到均勻穩(wěn)定的混合液。將不同濃度的CNT溶液(0.01、0.03和0.1 mg/mL)、CpG(1 μM)和CNT/CpG混合液(CpG終濃度為1 μM)加入到BMDCs中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h后，分別收集上清和細(xì)胞。利用ELISA試劑盒檢測上清中TNF-α的表達(dá)；利用流式細(xì)胞儀，分析BMDCs活化標(biāo)志分子CD86和MHCII的表達(dá)。

1.7 CNT對BMDCs抗原提呈的影響

將OVA323-339(O-3)抗原加入到不同濃度的CNT溶液中，室溫條件下充分混合后放置30 min，得到O-3/CNT抗原復(fù)合物。將3種不同CNT濃度的復(fù)合物加入到BMDCs中，其中CNT的濃度分別為0.01、0.03和0.1 mg/mL，O-3的終濃度為10 μg/mL，37℃孵育48 h。將MHCI、MHCII抗體加入到復(fù)合物處理的BMDCs中，分析CNT對抗原提呈的影響。

1.8 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)

圖1 BMDCs的體外誘導(dǎo)、培養(yǎng)和碳納米管對細(xì)胞活性的影響。(a)小鼠骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)6 d后，細(xì)胞表面高表達(dá)CD11c，細(xì)胞表面可見大量刺狀突起，從左到右依次為空白細(xì)胞散點圖、CD11c標(biāo)記后散點圖、BMDCs的CD11c表達(dá)柱狀圖以及透射電鏡觀察到的BMDCs的形態(tài)圖，內(nèi)插圖為瑞士-吉姆薩染色的染色圖；(b)不同濃度CNT對BMDCs活性的影響，從左到右依次為對照、0.01、0.03和0.1 mg/mL處理的BMDCs的活細(xì)胞比例Fig.1 The induction and cultivation of BMDCs in vitro and the effects of CNT on BMDCs viability. (a) Bone marrow cells were induced to dendritic cells with spikes on the surface of cells and high CD11c expression; The plot of BMDCs cell, CD11c labeled BMDC plot and histogram, and cell morphology observed by TEM were showed from the left to the right. (b) The effect of CNT on BMDCs viability; the viable BMDCs cell ratio treated without CNT, 0.01, 0.03 and 0.1 mg/mL CNT were shown from the left to the right

將六周齡雌性C57BL/6小鼠斷頸處死后，浸泡到75%酒精中30 s。在超凈工作臺中解剖取出小鼠脾臟，研磨過篩得到脾細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液緩慢地加入到淋巴細(xì)胞分離液上層，400 g室溫離心30 min。輕輕取出中間淋巴細(xì)胞層到離心管中，加入PBS清洗2遍后計數(shù)。將CSFE加入到淋巴細(xì)胞中(終濃度為1 μM)，37℃孵育20 min后離心洗滌，得到CSFE標(biāo)記淋巴細(xì)胞。

將標(biāo)記后的淋巴細(xì)胞加入到不同濃度O-3/CNT復(fù)合物處理的BMDCs中，淋巴細(xì)胞和BMDCs的比例為10∶1。培養(yǎng)5 d后收集上清和細(xì)胞，利用ELISA試劑盒檢測上清中IL-4、IL-13和IL-10的量；利用CD4和CD8抗體標(biāo)記T淋巴細(xì)胞，檢測兩群細(xì)胞的增殖情況。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

每個實驗設(shè)3個重復(fù)樣，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。顯著性差異利用SPSS軟件單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行分析，流式數(shù)據(jù)用CFlowTM軟件(Accuri Cytometers)和FlowJo軟件(Treestar，美國)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 碳納米管對BMDCs活性的影響

小鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)GM-CSF體外誘導(dǎo)培養(yǎng)6 d后，細(xì)胞表面出現(xiàn)典型的刺突結(jié)構(gòu)，高表達(dá)DCs特異性標(biāo)志物CD11c。瑞士-吉姆薩染色顯示，細(xì)胞表面有大量褶皺和不規(guī)則突起，具有典型的DCs形態(tài)。在透射電鏡下觀察到細(xì)胞表面有較多的突起，細(xì)胞核偏于一側(cè)(見圖1(a))。這些結(jié)果確定得到的細(xì)胞為樹突狀細(xì)胞(BMDCs)。

根據(jù)CD11c的表達(dá)和前向光(FL1-A/FSC)的大小，可在流式散點圖上圈出BMDCs，分析CNT對BMDCs細(xì)胞活性的影響。將不同濃度的CNT與BMDCs孵育24 h后，3種濃度的碳納米管都降低了BMDCs的活性，由對照組的89.8%降低到86.9%、87.5%和84.1%，提示CNT對BMDCs活性無明顯影響(見圖1(b))。

2.2 BMDCs對碳納米管的攝取

將CNT與BMDCs孵育24 h后，在透射電鏡下可觀察到CNT被大量吞噬到細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞核內(nèi)未見(見圖2)。被BMDCs吞噬的碳納米管聚集成團(tuán)，有少量碳納米管單根存在。

圖2 利用透射電鏡觀察BMDCs攝取碳納米管情況。(a)CNT被BMDCs攝取；(b)為(a)的局部放大Fig.2 CNT uptake of BMDCs observed by TEM. (a) CNT was engulfed by BMDCs. (b) The partial magnification of (a)

2.3 碳納米管對BMDCs成熟和抗原提呈的影響

樹突狀細(xì)胞攝取抗原或被某些刺激因素處理后逐漸成熟，細(xì)胞表面高表達(dá)CD86和MHCII分子，同時釋放細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-12等)。CpG可直接激活樹突狀細(xì)胞，上調(diào)共刺激分子的表達(dá)，加強(qiáng)免疫反應(yīng)。實驗結(jié)果表明，3個濃度的CNT(0.01、0.03、0.1 mg/mL)都不影響B(tài)MDCs表面CD86和MHCII的表達(dá)，CpG可顯著提高BMDCs表面MHCII的表達(dá)，使CD86的表達(dá)略有增加，但與對照組相比沒有顯著性差異。CNT/CpG復(fù)合物可以進(jìn)一步促進(jìn)BMDCs表面CD86和MHCII的表達(dá)，但與單獨CpG相比沒有顯著性差異(見圖3(a)、(b))。

進(jìn)一步對碳納米管影響B(tài)MDCs釋放TNF-α的情況進(jìn)行了分析。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CNT(0.03 mg/mL)可略降低TNF-α的表達(dá)，但沒有顯著性差異；CpG刺激可顯著促進(jìn)TNF-α的表達(dá)，CNT/CpG復(fù)合物可稍抑制TNF-α的表達(dá)，但不具有顯著性差異(見圖3(c))。這些結(jié)果提示，CNT不影響B(tài)MDCs的成熟和活化，也不干擾CpG引起的BMDCs的成熟和活化。

圖3 CNT對BMDCs成熟的影響。(a)不同處理因素對BMDCs表面CDMHCII平均熒光強(qiáng)度的影響;(b)不同處理因素對BMDCs表面CD86平均熒光強(qiáng)度的影響；(c)不同處理因素對BMDCs表達(dá)TNFα的影響(*P<0.05,**P<0.01 vs Con)Fig.3 The effect of CNT to BMDCs maturation. (a) Mean fluorescence intensity of MHCII； (b) Mean fluorescence intensity of MHCII expression on the surface of BMDCs after different treatment； (c) TNFα expression with different treatment (*P<0.05,**P<0.01 vs Con)

樹突狀細(xì)胞攝取抗原后，經(jīng)過胞內(nèi)途徑與MHCI或MHCII類分子結(jié)合，形成MHC-抗原復(fù)合物被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞膜上，提呈給CD8+或CD4+T細(xì)胞。膜表面MHCI和II分子的表達(dá)是決定樹突狀細(xì)胞抗原提呈的關(guān)鍵分子。實驗結(jié)果顯示，低濃度的O-3/CNT抗原復(fù)合物(0.01 mg/mL)可促進(jìn)MHCI類分子的表達(dá)；高濃度的CNT/抗原復(fù)合物處理后，BMDCs表達(dá)MHCI分子的水平降低。3個濃度的CNT/抗原復(fù)合物都提高BMDCs細(xì)胞表面MHCII類分子的表達(dá)，且具有CNT濃度依賴性，CNT濃度越高，復(fù)合物對MHCII表達(dá)的促進(jìn)作用越明顯(見圖4)。

圖5 O-3/CNT復(fù)合物處理BMDCs對淋巴細(xì)胞功能的影響。(a)3個CNT濃度的O-3/CNT復(fù)合物處理的BMDCs對淋巴細(xì)胞IL-4、IL-13和IL-10表達(dá)的影響(*P<0.05，**P<0.01 vs O-3 without CNT);(b)3個CNT濃度的O-3/CNT復(fù)合物處理的BMDCs對CD4+T和CD8+T細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Mix lymphocytes reaction induced by the mixture of O-3/CNT treated BMDCs.(a)IL-4, IL-13 and IL-10 expression of lymphocyte measured by ELISA kit (*P<0.05,**P<0.01 vs O-3 without CNT);(b)CD4+T and CD8+T cell proliferation.

圖4 O-3/CNT復(fù)合物對BMDCs細(xì)胞表面MHCI(a)和MHCII類分子(b)表達(dá)的影響Fig.4 The mixture of O-3/CNT antigen influences on the MHCI (a) and MHCII (b) expression of BMDCs

2.4 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)

將O-3/CNT抗原復(fù)合物處理的BMDCs與同種小鼠脾淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，分析淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)和增殖情況。實驗結(jié)果顯示，O-3/CNT復(fù)合物處理的BMDCs細(xì)胞可顯著降低Th2型細(xì)胞因子IL-4和IL-13的表達(dá)，對IL-10的表達(dá)略有影響(見圖5(a))。淋巴細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示3個CNT濃度的抗原復(fù)合物處理的DCs降低了CD4+T淋巴細(xì)胞增殖，低CSFE表達(dá)的CD4+T的比例從對照組的54.4%降低到38.9%、46.6%和39.8%。與CD4+T細(xì)胞反應(yīng)不同，O-3/CNT復(fù)合物處理DCs可以顯著促進(jìn)CD8+T淋巴細(xì)胞增殖。特別是0.01和0.03 mg/mL的CNT，分別將低CSFE表達(dá)的CD8+T細(xì)胞比例從對照組的28.7%提高到40.6%和41.3%。但是，高濃度(0.1 mg/mL)O-3/CNT復(fù)合物處理的DCs對CD8+T細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用較弱(見5(b))。

3 討論

有研究表明，樹突狀細(xì)胞通過調(diào)節(jié)抗原與MHC類分子結(jié)合和釋放細(xì)胞因子，調(diào)控Th分化[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，BMDCs可以大量吞噬碳納米管，其表面活化分子MHCII、CD86和TNF-α表達(dá)沒有明顯變化。有研究發(fā)現(xiàn)，功能化多壁碳納米管對骨髓來源的樹突細(xì)胞細(xì)胞表面活化標(biāo)志物表達(dá)沒有影響，碳納米管對樹突狀細(xì)胞抗原遞呈作用的促進(jìn)來源于其促進(jìn)抗原的攝取[18]。通常OVA323-339抗原多肽被DCs攝取后，與MHCII分子結(jié)合，激活CD4細(xì)胞，抑制CD8細(xì)胞增殖，促進(jìn)Th2分化。少量抗原-MHCII復(fù)合物可以通過“交叉呈遞”的方式，進(jìn)入MHCI類抗原呈遞途徑，促進(jìn)CD8+T增殖和Th1分化。碳納米管運載抗原在樹突狀細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運過程與單獨抗原分子可能不同。碳納米管負(fù)載OVA323-339后，促進(jìn)BMDCs表面MHCII分子的表達(dá)，抑制Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的增殖。這提示碳納米管有可能促進(jìn)OVA323-339抗原通過MHCII類分子途徑遞呈給CD8+T細(xì)胞，同時抑制Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核菌素-單壁碳納米管復(fù)合物可以促進(jìn)免疫反應(yīng)由Th2型向Th1型轉(zhuǎn)變，促進(jìn)IFN-γ的表達(dá)[19]。氧化多壁碳納米管可以促進(jìn)多肽特異性的CD8+T細(xì)胞的增殖，促進(jìn)抗腫瘤免疫治療效果[20]。多壁碳納米管如何調(diào)控Th分化和抗原交叉遞呈的相關(guān)機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

BMDCs可以大量吞噬CNT，增加MHCII的表達(dá)，促進(jìn)OVA323-339多肽抗原的呈遞和CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖，抑制Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-10和IL-13的表達(dá)，使免疫反應(yīng)由Th2向Th1型轉(zhuǎn)變。CNT可以通過增加抗原的攝取和交叉提呈，促進(jìn)細(xì)胞免疫響應(yīng)，有望成為一種新型抗原載體。

[1] Gottardi R,Douradinha B. Carbon nanotubes as a novel tool for vaccination against infectious diseases and cancer[J]. J Nanobiotechnology, 2013,11:1-7.

[2] Dumortier H, Lacotte S, Pastorin G, et al. Functionalized carbon nanotubes are non-cytotoxic and preserve the functionality of primary immune cells[J]. Nano Lett, 2006, 6(7): 1522-1528.

[3] de Faria PC, dos Santos LI, Coelho JP, et al. Oxidized multiwalled carbon nanotubes as antigen delivery system to promote superior CD8(+) T cell response and protection against cancer[J]. Nano Lett, 2014, 14(9): 5458-5470.

[4] Chen Xing, Kis A, Zettl A, et al. A cell nanoinjector based on carbon nanotubes[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(20): 8218-8222.

[5] Kam NW, Dai Hongjie. Carbon nanotubes as intracellular protein transporters: generality and biological functionality[J]. J Am Chem Soc, 2005, 127(16): 6021-6026.

[6] Pantarotto D, Partidos CD, Graff R, et al. Synthesis, structural characterization, and immunological properties of carbon nanotubes functionalized with peptides[J]. J Am Chem Soc, 2003, 125(20):6160-6164.

[7] Parra J, Abad-Somovilla A, Mercader JV, et al. Carbon nanotube-protein carriers enhance size-dependent self-adjuvant antibody response to haptens[J]. J Control Release, 2013, 170(2):242-251.

[8] Park EJ, Cho WS, Jeong J, et al. Pro-inflammatory and potential allergic responses resulting from B cell activation in mice treated with multi-walled carbon nanotubes by intratracheal instillation[J]. Toxicology, 2009, 259: 113-121.

[9] Inoue K, Koike E, Yanagisawa R, et al. Effects of multi-walled carbon nanotubes on a murine allergic airway inflammation model[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2009, 237: 306-316.

[10] Koido S, Homma S, Takahara A,et al.Current Immunotherapeutic Approaches in Pancreatic Cancer[J]. Clin Dev Immunol, 2011, 2011: 267539.

[11] Bradley LM, Yoshimoto K, Swain SL. The cytokines IL-4, IFN-gamma, and IL-12 regulate the development of subsets of memory effector helper T cells in vitro[J]. J Immunol, 1995,155(4):1713-1724.

[12] Shipkowski KA, Taylor AJ, Thompson EA, et al. An Allergic Lung Microenvironment Suppresses Carbon Nanotube-Induced Inflammasome Activation via STAT6-Dependent Inhibition of Caspase-1[J]. PLoS ONE, 2015, 10(6):e0128888.

[13] Finkelman FD, Hogan SP, Hershey GK, et al. Importance of cytokines in murine allergic airway disease and human asthma[J]. J Immunol, 2010, 184: 1663-1674.

[14] Janssen EM, van Oosterhout AJ, van Rensen AJ, et al. Wauben MH.Modulation of Th2 responses by peptide analogues in a murine model of allergic asthma: amelioration or deterioration of the disease process depends on the Th1 or Th2 skewing characteristics of the therapeutic peptide[J]. J Immunol, 2000, 164(2):580-588.

[15] Meng Jie, Cheng Xuelian, Liu Jian, et al. Effects of long and short carboxylated or aminated multiwalled carbon nanotubes on blood coagulation[J]. PLoS ONE, 2012, 7(7): e38995.

[16] Li Yue, Zeng Xiaoli, He Lijuan, et al. Dendritic cell activation and maturation induced by recombinant calreticulin fragment 39-272[J]. Int J Clin Exp Med, 2015, 8(5): 7288-7296.

[17] 陳冰, 朱一蓓, 張學(xué)光. 樹突狀細(xì)胞表達(dá)的共刺激分子與Th細(xì)胞分化[J].中國腫瘤生物治療雜志, 2007, 14(2):197-200.

[18] Hassan HA, Smyth L, Rubio N, et al.Carbon nanotubes' surface chemistry determines their potency as vaccine nanocarriers in vitro and in vivo[J].J Control Release, 2016, 225:205-216.

[19] Zeinali M, Jammalan M, Ardestani SK, et al. Immunological and cytotoxicological characterization of tuberculin purified protein derivative (PPD) conjugated to single-walled carbon nanotubes[J].Immunol Lett, 2009, 126(1-2):48-53.

[20] Luo Wenhui, Yang Yawun. Activation of antigen-specific CD8(+) T cells by poly-DL-lactide/glycolide (PLGA) nanoparticle-primed Gr-1(high) cells[J]. Pharm Res, 2016, 33(4):942-955.

Carbon Nanotubes Influence Dendritic Cells Maturation and T Cell Polarization

Dai Yali Nie Xin Liu Jian#Meng Jie#*Xu Haiyan#*

(InstituteofBasicMedicalSciencesChineseAcademyofMedicalSciences&SchoolofBasicMedicinePekingUnionMedicalCollege,Beijing100005,China)

Th differentiation play a key role in modulating immune response, which is mainly controlled by dendritic cells (DCs). Carbon nanotubes are unique nanomaterials composed of carbon element with hollow tube structures, which could be used as antigen carrier. The interaction of carbon nanotubes with DCs is key factor modulating following immune responses. This work studied the interaction between oxidized multiwalled carbon nanotubes (CNT) and DCs, and the mixture of CNT and allergic antigen peptide OVA323-339(O-3) on DCs and DCs-mediated Th1/Th2 responses. Our results showed that CNT was engulfed by DCs, and the expression of MHCII, CD86 and TNF-α of DCs was unchanged by CNT. The mixture of CNT/O-3 treated DCs induced increased CD8+T cell proliferation. The proliferation ratio of CD8+T cells increased from 28.7% of control to 40.6%, 41.3% and 29.6%. Th2 cytokines expression of IL-4, IL-10 and IL-13 was significantly inhibited. The proliferation ratio of CD4+T cells were decreased from 54.5% of control to 38.9%, 46.6%, and 39.8%. All the results indicated that CNT did not influence the maturation of DCs but promote Th1 polarization of T cells by inhibiting the Th2 cytokines expression of allergic peptide antigen.

dendritic cells; carbon nanotubes; Th polarization; anti-inflammatory cytokines; allergic antigen

10.3969/j.issn.0258-8021. 2017. 04.011

2017-03-15， 錄用日期:2017-04-30

北京市自然基金(7162128)；協(xié)和青年基金(3332016136)

R318

A

0258-8021(2017) 04-0464-06

# 中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會會員(Member, Chinese Society of Biomedicial Engineering)

*通信作者(Corresponding author)，E-mail: mengjie@ibms.pumc.edu.cn； xuhy@pumc.edu.cn