血根堿對宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移能力影響機(jī)制研究

李貞彩，姜 平，王秋宇，楊 麗，符鵬曉，張金茹

(河南省南陽市中心醫(yī)院婦科 473003)

論著·基礎(chǔ)研究

血根堿對宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移能力影響機(jī)制研究

李貞彩，姜 平，王秋宇，楊 麗，符鵬曉，張金茹

(河南省南陽市中心醫(yī)院婦科 473003)

目的 探討血根堿對宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移能力的影響機(jī)制。方法 分別用MTT法、流式細(xì)胞儀、細(xì)胞劃痕實驗、 Transwell小室檢測血根堿作用后的宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲能力。Western blot檢測經(jīng)血根堿作用后宮頸癌細(xì)胞中E-Cadherin、PTEN、β-catenin、MMP2的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 0.6、0.8 μmol/L血根堿對宮頸癌細(xì)胞增殖具有抑制作用。0.8 μmol/L血根堿作用48 h后宮頸癌細(xì)胞HeLa和Siha凋亡率高達(dá)(45.68±2.26)%和(31.89±3.80)%。0.8 μmol/L血根堿作用3 h后宮頸癌細(xì)胞HeLa和Siha黏附率僅有(67.45±2.13)%和(73.59±2.61)%。0.8 μmol/L血根堿作用16 h后宮頸癌細(xì)胞HeLa和Siha侵襲數(shù)目僅有(39.64±1.98)個和(43.87±2.83)個。經(jīng)血根堿作用后的宮頸癌細(xì)胞中E-Cadherin和PTEN的表達(dá)量增加，β-catenin和MMP2的表達(dá)量減弱。結(jié)論 血根堿對宮頸癌細(xì)胞具有抑制增殖及促凋亡作用，其機(jī)制可能與黏附蛋白E-Cadherin、β-catenin和PTEN、MMP2有關(guān)。

宮頸腫瘤;血根堿;侵襲;遷移;增殖

宮頸癌是一種常見的女性惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計，每年宮頸癌的發(fā)病率在女性惡性腫瘤中僅次于乳腺癌[1]。宮頸癌發(fā)病率高，世界范圍內(nèi)有85%的宮頸癌患者來自于發(fā)展中國家。在我國每年有13萬的新增宮頸癌患者，占世界宮頸癌發(fā)病率的25%以上。20歲以下女性很少患病，40～50歲是宮頸癌的高發(fā)年齡段[2]。宮頸癌傳統(tǒng)的治療方法有手術(shù)治療和放療。這些治療方法療效有限，而且不良反應(yīng)大。尋找新的安全有效的治療方法是目前研究的熱點。血根堿(sanguinarine)是罌粟科植物博落回的提取物。血根堿具有多種藥理活性，具有抗菌、消炎、殺蟲、抗病毒、抗氧化、抗真菌等多種藥理作用，可以改善肝功能，提高免疫力。近年來研究發(fā)現(xiàn)，血根堿具有抗腫瘤的作用[3]。血根堿對胰腺癌、肝癌都具有治療效果。血根堿對宮頸癌的作用機(jī)制尚少見相關(guān)報道。本研究以宮頸癌細(xì)胞HeLa和Siha為研究對象，探討血根堿對宮頸癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移能力的影響機(jī)制，以期為治療宮頸癌提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌細(xì)胞HeLa和Siha均由本科實驗室保存;兔抗E-Cadherin多克隆抗體、兔抗β-catenin多克隆抗體、兔抗PTEN多克隆抗體、兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)多克隆抗體、鼠抗人β-actin抗體購自美國Cell Signaling。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)用含10%FBS，100 U/mL青霉素，0.1 mg/mL鏈霉素，2 mmol/L谷氨酰胺的DMEM細(xì)胞生長液。培養(yǎng)條件為37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱。細(xì)胞傳代用0.25%的胰蛋白酶。

1.2.2 MTT檢測細(xì)胞增殖情況 宮頸癌細(xì)胞HeLa和Siha經(jīng)血根堿終濃度為0.6、0.8 μmol/L的含藥培養(yǎng)基作用0、6、12、24、48、72 h。MTT法檢測細(xì)胞增殖情況，計算細(xì)胞抑制率[4]。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況 宮頸癌細(xì)胞HeLa和Siha經(jīng)0(對照組)、0.8 μmol/L(藥物作用組)的血根堿作用48 h后，取1 mL細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞后，加入5 μL PI和5 μL Annexin-V，避光反應(yīng)10 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡[5]。

1.2.4 血根堿對宮頸癌細(xì)胞黏附力影響 宮頸癌細(xì)胞HeLa和Siha經(jīng)0、0.6、0.8μmol/L的血根堿作用于宮頸癌細(xì)胞，經(jīng)0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，觀察細(xì)胞貼壁情況，顯微鏡下計數(shù)每個時間點的細(xì)胞貼壁數(shù)量，計算細(xì)胞黏附率[6]。

1.2.5 血根堿對宮頸癌細(xì)胞遷徙能力影響 移液槍槍頭在宮頸癌細(xì)胞單層細(xì)胞上輕輕劃出一道細(xì)痕，經(jīng)0.6、0.8 μmol/L的血根堿作用24、48 h后，觀察細(xì)胞劃痕寬度，分析細(xì)胞遷徙能力[7]。

1.2.6 血根堿對宮頸癌細(xì)胞遷移能力影響 0、0.6、0.8 μmol/L的血根堿作用宮頸癌細(xì)胞，Transwell 小室檢測細(xì)胞48 h遷移能力[8]。收集各組中下室的細(xì)胞，在顯微鏡下計數(shù)，計算細(xì)胞遷移數(shù)。

1.2.7 血根堿對宮頸癌細(xì)胞侵襲力影響 用培養(yǎng)基DMEM稀釋Matrigel配置成基質(zhì)膠，在24孔的Transwell小室中加入基質(zhì)膠。宮頸癌細(xì)胞HeLa和Siha經(jīng)0.6、0.8 μmol/L的血根堿作用后16 h，Transwell檢測細(xì)胞侵襲能力，顯微鏡下觀察細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)量。

1.2.8 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 取經(jīng)0、0.6、0.8 μmol/L藥物作用48 h后的宮頸癌細(xì)胞HeLa和Siha，按照常規(guī)方法[9]提取細(xì)胞總蛋白。蛋白濃度測定按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書操作。提取蛋白變性后，SDS-PAGE凝膠電泳后，4 ℃轉(zhuǎn)膜90 min。經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后，依次與一抗(500倍稀釋)和二抗(1 000倍稀釋)孵育反應(yīng)后，在暗室中顯影定影。

2 結(jié) 果

2.1 MTT檢測細(xì)胞增殖情況 血根堿對宮頸癌細(xì)胞HeLa和Siha增殖有明顯的抑制作用，抑制作用隨著作用時間的增加而增加，見圖1。

圖1 MTT檢測血根堿對宮頸癌細(xì)胞HeLa和Siha抑制情況

2.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果 0.8 μmol/L的血根堿作用后的HeLa細(xì)胞凋亡率與對照組相比顯著升高(P<0.01)，0.8 μmol/L的血根堿作用后的Siha細(xì)胞凋亡率與對照組相比顯著升高(P<0.01)，見圖2。

2.3 血根堿對宮頸癌細(xì)胞黏附率影響 宮頸癌細(xì)胞HeLa和Siha經(jīng)血根堿作用后細(xì)胞黏附率與血根堿(0 μmol/L)相比有所降低。宮頸癌細(xì)胞的黏附率隨著血根堿藥物作用濃度的增加而降低，隨著藥物作用時間的延長而減弱，見表1、2。

A：血根堿作用后的HeLa細(xì)胞凋亡情況；B：血根堿作用后的Siha細(xì)胞凋亡情況；C：HeLa細(xì)胞凋亡率；C：Siha細(xì)胞凋亡率；a：P<0.01，與對照組比較

圖2 血根堿作用后的宮頸癌細(xì)胞凋亡情況表1 宮頸癌HeLa細(xì)胞經(jīng)血根堿作用后的黏附率

a：P<0.05，b:P<0.01，與0 μmol/L比較

表2 宮頸癌Siha細(xì)胞經(jīng)血根堿作用后的黏附率±s，%)

a：P<0.05，b:P<0.01，與0 μmol/L比較

2.4 血根堿對宮頸癌細(xì)胞遷徙能力影響 0.6、0.8 μmol/L的血根堿作用24、48 h后細(xì)胞劃痕與0 μmol/L血根堿相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

a：P<0.01，與0 μmol/L比較

圖3 血根堿對細(xì)胞遷徙能力影響

2.5 血根堿對宮頸癌細(xì)胞遷移能力影響 0.6 μmol/L和0.8 μmol/L的血根堿作用后的宮頸癌細(xì)胞與0 μmol/L血根堿相比遷移數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

a：P<0.05；b:P<0.01，與0 μmol/L比較

圖4 血根堿對宮頸癌細(xì)胞遷移能力影響

2.6 血根堿對宮頸癌細(xì)胞侵襲力影響 血根堿作用后宮頸癌細(xì)胞的侵襲能力減弱。隨著血根堿作用濃度的增加，侵襲力減弱越明顯，見圖5。

a：P<0.01，與0 μmol/L比較

圖5 血根堿對宮頸癌細(xì)胞侵襲力影響

2.7 Western blot檢測細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá) 經(jīng)血根堿作用后的宮頸癌細(xì)胞中E-Cadherin和PTEN的表達(dá)量與0 μmol/L相比明顯增加，隨著藥物濃度的增加表達(dá)量也增加。經(jīng)血根堿作用后的宮頸癌細(xì)胞中β-catenin和MMP2的表達(dá)量與0 μmol/L相比明顯減弱，隨著藥物濃度的增加表達(dá)量也減弱,見圖6。

1：0 μmol/L；2：0.6 μmol/L；3：0.8 μmol/L

圖6 Western blot檢測血根堿作用后宮頸癌細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平

3 討 論

宮頸癌發(fā)病率在發(fā)展中國家高于發(fā)達(dá)國家，農(nóng)村高于城市。目前宮頸癌的治療方法主要有手術(shù)治療、放療等。隨著治療方法的不斷改進(jìn)，宮頸癌的治療也越來越規(guī)范，但這些治療方法仍然存在很大的局限性。癌細(xì)胞的遷徙和侵襲是宮頸癌治療失敗和復(fù)發(fā)的重要原因[10]。研究宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力對于治療宮頸癌具有重要意義。血根堿具有消炎、抗菌、增強(qiáng)免疫力等多種作用，在細(xì)胞凋亡和增殖中具有重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，血根堿對胰腺癌、肝癌都具有很好的治療效果，對癌細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、侵襲都具有一定作用[11]。本研究中MTT檢測血根堿藥物作用后的宮頸癌細(xì)胞增殖能力明顯降低，且隨著藥物作用時間的增加而增加。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，血根堿可以顯著促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的凋亡。

腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤發(fā)生和發(fā)展中關(guān)鍵的階段。腫瘤細(xì)胞從發(fā)病部位擴(kuò)散到遠(yuǎn)處的正常器官需要癌細(xì)胞黏附于正常組織，穿過血管內(nèi)皮下基底膜進(jìn)入血液中，隨著血液擴(kuò)散到周圍組織中，黏附于靶器官內(nèi)皮細(xì)胞中，在靶器官中克隆生長，促進(jìn)轉(zhuǎn)移灶的發(fā)生。細(xì)胞黏附有兩種，一種是細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附，另一種是細(xì)胞與基質(zhì)之間的黏附[12]。黏附蛋白(E-cadherin)在細(xì)胞間的黏附中起重要作用，是一種鈣依賴型的跨膜糖蛋白。有研究表明，E-cadherin在結(jié)腸癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌中表達(dá)下調(diào)，E-cadherin表達(dá)量越高，癌癥的預(yù)后越好[13]。本研究通過檢測宮頸癌細(xì)胞經(jīng)血根堿作用后的細(xì)胞黏附力證明，血根堿可以抑制宮頸癌細(xì)胞的黏附力。Western blot檢測結(jié)果表明，藥物作用后的宮頸癌細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)量明顯上升，說明血根堿抑制宮頸癌細(xì)胞黏附力作用機(jī)制與E-cadherin蛋白有關(guān)。

E-cadherin在細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中與Catenins有密切關(guān)系，E-cadherin傳遞細(xì)胞信號時需要與Catenins蛋白結(jié)合誘導(dǎo)肌動蛋白發(fā)揮作用。Catenins水平降低可以阻斷Wnt信號通路，抑制癌細(xì)胞的發(fā)展。MMP2是一種基質(zhì)蛋白，在惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要作用，MMP2在癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[14]。PTEN是一種抑癌基因，在癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。PTEN的缺失和突變是癌癥發(fā)生的一個標(biāo)志性事件[15]。本研究中通過細(xì)胞劃痕實驗檢測血根堿對宮頸癌細(xì)胞遷徙能力的影響，血根堿作用后的宮頸癌細(xì)胞的遷徙能力與對照組相比明顯下降。經(jīng)過Transwell小室檢測到血根堿可以抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力，藥物濃度越大，抑制能力越強(qiáng)。Western blot檢測藥物作用后的宮頸癌細(xì)胞中E-cadherin、β-Catenin、PTEN、MMP2的表達(dá)水平的變化，血根堿可以抑制β-Catenin、MMP2的表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin和PTEN的表達(dá)，說明E-cadherin、β-Catenin、MMP2、PTEN參與了血根堿抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制。

綜上所述，血根堿可以抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、黏附、遷徙、轉(zhuǎn)移、侵襲能力，抑制能力隨著血根堿藥物濃度的增加而增加。血根堿可以促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的凋亡。作用抑制機(jī)制與E-cadherin、β-Catenin、MMP2、PTEN蛋白有關(guān)，為進(jìn)一步研究血根堿對癌細(xì)胞的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為治療宮頸癌提供了新的思路和方法。

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Study on effect mechanism of sanguinarine on proliferation,apoptosis,invasion and migration of cervical cancer cells

LiZhencai,JiangPing,WangQiuyu,YangLi,FuPengxiao,ZhangJinru

(DepartmentofGynecology,AffiliatedNanyangCentralHospitalofZhengzhouUniversity，Nanyang,Henan473003,China)

Objective To investigate the effect mechanism of sanguinarine on the proliferation,apoptosis,invasion and migration abilities of cervical cancer cells.Methods MTT,flow cytometer,cell scratch test and Transwell chamber assay were respectively used to detect the cellular proliferation,apoptosis,migration and invasion abilities after sanguinarine action.The expression levels of E-Cadherin,PTEN,β-catenin and MMP2 protein of cervical cancer cells after sanguinarine action were detected by Western blot.Results 0.6,0.8 μmol/L sanguinarine had the inhibitory effect on the proliferation of cervical cancer cells.After 0.8 μmol/L sanguinarine action for 48 h,cervical cancer HeLa and Siha cells apoptosis rate were up to (45.68±2.26)% and(31.89±3.80)% respectively.0.8 μmol/L sanguinarine action for 3 h,cervical cancer cells HeLa and Siha adhesion rates were only (67.45±2.13)% and(73.59±2.61)%.0.8 mol/L sanguinarine action for 16 h,the invasion numbers of cervical cancer Hela and Siha cell were (39.64±1.98) and (43.87±2.83) respectively.The expression amount of E-Cadherin and PTEN in cervical cancer cells after sanguinarine action was increased,while the expression amount of E-Cadherin and PTEN was weakened.Conclusion Sanguinarine has the proliferation inhibiting and apoptosis promoting effect on cervical cancer cells,its mechanism may be related to adhesion protein E-Cadherin,β-catenin and PTEN,MMP2.

uterine cervical neoplasms;sanguinarine;invasion;migration;proliferation

李貞彩(1987-)，主治醫(yī)師，本科，主要從事婦科疾病的診治研究。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.22.005

R737.33

A

1671-8348(2017)22-3039-04

2016-12-19

2017-03-07)