人參養榮湯對顱腦外傷大鼠TGF-β1／Smad信號通路相關因子的干預實驗研究

賴躍平，陳建松，陳實

（廈門大學附屬福州第二醫院，福建福州350007）

人參養榮湯對顱腦外傷大鼠TGF-β1／Smad信號通路相關因子的干預實驗研究

賴躍平，陳建松，陳實

（廈門大學附屬福州第二醫院，福建福州350007）

目的通過人參養榮湯干預大鼠顱腦外傷模型探討TGF-β1／Smad信號通路在顱腦創傷發生后的作用。方法建立大鼠顱腦外傷模型后，分為正常組、模型對照組（只做開顱重物擊傷）、實驗組（開顱重物擊傷＋人參養榮湯），采用HE染色大鼠腦組織，ELISA法檢測血清中的Decorin、TGF-β1、Smad2、Smad3含量，Western Blot檢測腦組織中的TGF-β1、Smad2、Smad3、TF蛋白含量。結果HE染色顯示：模型對照組腦組織出現了較嚴重的皮質與海馬神經細胞變性、丟失，實驗組次之；正常組血清中Decorin的表達最高，實驗組次之，模型對照組最低，各組比較均有顯著性差異（P＜0.05）；TGF-β1、Smad2、Smad3、TF蛋白的表達，模型對照組最高，實驗組次之，正常組最低，各組比較均有顯著性差異（P＜0.05）。結論人參養榮湯能通過TGF-β1／Smad信號通路改善顱腦創傷。

顱腦外傷；大鼠；人參養榮湯；TGF-β1／Smad信號通路

顱腦外傷是常見的神經外科疾病，近年來隨著經濟、交通的發展，我國顱腦外傷發生率及因顱腦外傷致死致殘的傷員逐年增加。有研究顯示：顱腦損傷后的神經細胞損害及死亡主要是由于繼發炎性反應所致［1］。在創傷后由于急性應激，體內短時間內會分泌大量的TGF-β1，而過多的TGF-β1沉積又加重局部炎性反應。Smad為TGF-β1的胞內信號傳導蛋白，TGF-β1／Smad形成通路系統參與繼發性炎性反應的調控［2］。人參養榮湯出自于《太平惠民和劑局方》，研究表明：人參養榮湯能夠改善骨髓造血功能，對機體防御系統功能紊亂有修復作用，可抑制大腦皮質神經元密度的下降等，同時對顱腦損傷引起的炎癥反應有明顯抑制作用［3-4］。本研究擬建立大鼠顱腦外傷模型，采用人參養榮湯干預大鼠顱腦外傷模型，檢測損傷后不同組別血清、腦組織中TGF-β1／Smad信號通路的關鍵因子，探討人參養榮湯通過TGF-β1／Smad信號通路在顱腦創傷發生后的干預作用，探討其治療顱腦損傷可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及藥物3月齡SPF級SD雄性大鼠40只，上海西斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2013-0002，合格證編號：2007 000562039，體重（350±20）g，飼養于福建醫科大學動物實驗中心鼠類實驗室。藥物制作方法：首先將人參、黃芪、白術、茯苓、當歸、白芍、熟地黃、陳皮等干品等量混合，用75%乙醇回流提取2～3次，每次溶媒用量約為生藥量的8～12倍，每次提取時間為1～2 h，合并提取液后濃縮至干，并進一步干燥，得人參養榮湯提取物。

1.1.2 分組及模型建立應用隨機數字表法分組，每組10只，分為正常組、模型對照組（只做開顱重物擊傷）、實驗組（開顱重物擊傷＋人參養榮湯），人參養榮湯提取液最佳濃度9 g／（kg·d）。正常組、模型對照組采用生理鹽水灌胃，實驗組采用人參養榮湯提取液灌胃。手術大鼠前3 d單獨喂養，術前禁食8 h，實驗時腹腔內注射水合氯醛進行麻醉，俯臥位固定于腦立體定向儀上。消毒皮膚，頭部正中切開，剝離骨膜，暴露右頂骨，用牙科鉆在冠狀縫后、中線旁區域鉆一直徑5 mm骨窗，保持硬膜完整。將撞桿置于硬膜上，用祛碼于一定高度沿外周導管墜落，撞擊撞桿從而撞擊硬膜，使腦組織產生瞬間形變，致頂葉腦挫裂傷，迅速將裝置移開保證只有1次撞擊。撞擊后切口內滴注4萬U硫酸慶大霉素4～5滴，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮。

1.1.3 主要試劑與儀器TGF-β1、Smad2、Smad3、TF抗體（美國Santa Cruz公司）；WesternBreeze（美國Invitrogen公司）；PVDF膜（美國Amersham公司）；Decorin、TGF-β1、Smad2、Smad3酶聯免疫吸附測試試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；石蠟切片機（CUT 4060型，德國Leica Biosystems公司）；OLYMPUS電子顯微鏡（日本TKO光學儀器株式會社產品）；HMIAS－2000顯微圖像分析系統（武漢千屏影象技術有限責任公司）；GEL DOC 2000凝膠成像系統（美國伯樂BIO-RAD公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 取材各組均于造模后連續干預30 d后取材。大鼠經腹腔注射10%水合氯醛麻醉，常規胸腹聯合切口，經左心室插管，分別用生理鹽水、多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液灌注，注畢取出大腦放人4%多聚甲醛溶液內，4℃固定48 h后樣本切片，作尼氏體染色。腹主動脈取血，離心，取血清，冷凍、待檢。

1.2.2 ELISA法檢測血清中的Decorin、TGF-β1、Smad2、Smad3含量取各組血清，按要求分別加入樣品、稀釋液、標準品各50 μL，37℃30 min溫育。再加入酶標偶合液洗板，加入底物反應15 min后加入終止液，酶標儀450 nm處讀取OD值。

1.2.3 Western Blot檢測腦組織中的TGF-β1、Smad2、Smad3、TF蛋白的含量各組腦組織低溫充分勻漿后，用Bradford法進行蛋白定量；取20 μg蛋白樣品，10%SDS-PAGE電泳，100 V轉移1 h至硝酸纖維素薄膜，放入封閉液中37℃封閉1 h；一抗（TGF-β1、Smad2、Smad3、TF）4℃過夜；同時，另1張用不含抗體TBS-T液孵育，作為陰性對照；反復洗膜后，將膜與堿性磷酸酶（AP）標記的抗IgG抗體孵育，室溫輕搖1 h；洗膜后，用Western Blot印跡觀察，用圖像分析測定各帶吸光度（A）值做定量分析。

1.3 統計學方法運用SPSS 18.0軟件包進行數據分析。計量資料屬正態分布用（x±s）表示，采用多組間單因素方差分析方法（F檢驗）。

圖1 正常組腦組織尼氏體染色結果（×400）

圖2 實驗組腦組織尼氏體染色結果（×400）

圖3 模型對照組腦組織尼氏體染色結果（×400）

表1 3組血清中Decorin、TGF-β1、Smad2、Smad3含量變化

2 結果

2.1 各組大鼠腦組織尼氏體染色結果正常組尼氏體為細顆粒；模型對照組尼氏體為細塵狀顆粒，胞漿著色淺，胞體腫脹，細胞變為圓形，胞核移至位于軸突起始部對側邊緣部；而實驗組仍可見部分正常尼氏體。見圖1～圖3。

2.23 組血清中Decorin、TGF-β1、Smad2、Smad3含量比較見表1。

2.33 組腦組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、TF蛋白表達比較見表2、圖4。

3 討論

顱腦損傷后的繼發的炎性反應常常導致神經細胞的損害及死亡［5］。創傷后應激促進體內炎癥介質刺激組織因子（tissue factor，TF）大量分泌，激活外源性凝血途徑，激發整個凝血過程，進一步加劇神經細胞的損害［6－7］。正常生理狀態下，血漿中TF水平表達非常低，血液中的單核細胞和接觸血漿的血管內皮細胞不表達TF，而在創傷應激情況下，血漿中的TF活性可增加至14倍［8］。有研究發現：若顱腦外傷患者入院時TF大量表達，則其凝血功能就存在異常，則有很大概率發生繼發性腦損傷，TF對凝血功能異常程度及判斷腦組織受損程度和評估預后具有重要價值［9］。本研究結果顯示模型對照組中TF蛋白表達最高，正常組最低，與此觀點一致。

腦組織中的星形細胞、神經元、少突細胞、小膠質細胞等細胞都能產生TGF-β1，病理狀態下TGF-β1可在腦組織中大量表達，并可促進神經細胞的增殖、細胞外基質的形成以及促進顱腦損傷后的組織修復［10］。Smad蛋白質群是一類細胞內信號傳導蛋白，參與TGF家族成員的信號傳導，Smad2和Smad3是激活TGF-βs信號通路的作用底物，在細胞核中直接地應答TGF-β的轉錄功能［11］。

當腦損傷發生后，腦組織中大量表達TGF-β1，并激活具有絲氨酸、蘇氨酸激酶活性的TGF-β受體，活化后的受體進一步激活Smad2和Smad3等蛋白，使其發生絲氨酸磷酸化，磷酸化后的Smads蛋白聚集形成復合物后進入細胞核，與特異性的DNA連接蛋白結合，最后影響腦組織中神經細胞的分化。Decorin是一種普遍存在于細胞外基質的富含亮氨酸的小分子蛋白多糖，是TGF-β最重要的負調節劑，能降低TGF-β生物學活性［12］。本研究結果顯示：當顱腦外傷發生后，大鼠體內TF大量分泌，血液中的炎癥介質向腦損傷區聚集，釋放TGF-β1使血細胞或免疫細胞產生的TGF-β1進入腦損傷區，同時激活TGF-β1／Smad信號通路，表現為模型對照組血清中TGF-β1、Smad2、Smad3含量最高，正常組最低；Decorin的表達與之相反，正常組最高，模型對照組最低；而腦組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、TF蛋白表達趨勢也與血清中一致。表明TGF-β1／Smad信號通路與顱腦創傷診斷及損傷程度的判斷關系密切，TGF-β1信號因子可作為顱腦創傷的診斷、治療、預后的判斷指標。

我國傳統醫學認為顱腦損傷的病機為外力撞擊腦部，導致脈絡破損，氣機逆亂，離經之血瘀阻于清竅；瘀阻氣滯而化痰，痰瘀互阻而蒙竅，導致而清陽不升，濁陰不降，至元神失主，神機失用而昏厥。人參養榮湯由人參、白芍、黃芪、茯苓、白術、熟地黃、當歸、陳皮等十幾味中藥組成，具有扶正固本，改善機體內環境，增強和調動機體自身抗病能力從而減低并發癥發生率。有實驗研究表明：人參養榮湯中含皂甙、糖類、氨基酸、維生素等多種成分，具有輔佐細胞存在下改善造血功能；刺激單核細胞活性；可促進脾集落生成單位的增加及成紅細胞系的恢復，繼而刺激CSF的產生，促進淋巴細胞、單核細胞、粒細胞的分化，刺激IL-6的生成等作用，修復機體防御系統功能，提高抗應激能力及抗疲勞的作用［13-16］。本實驗結果顯示：采用人參養榮湯干預大鼠顱腦外傷模型后血清與蛋白的Decorin、TGF-β1、Smad2、Smad3、TF均較模型對照組有所升高，表明人參養榮湯能通過TGF-β1／Smad信號通路改善外傷后顱腦的損傷程度。

表2 3組腦組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、TF蛋白表達比較

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R285.5

A

1000-338X（2017）04-0027-03

2017-04-08

福州市科技資助項目（2014-S-137-9）

賴躍平（1963—），男，主任醫師，主要從事神經外科臨床工作。