玳玳果降脂提取物急性毒性試驗研究

陳紅，馬國萍，陳丹，黃嬌，謝平，朱仙慕

（1.福建省立醫院干一科臨床老年病研究所，福建福州350001；2.福建中醫藥大學藥學院，福建福州350122）

玳玳果降脂提取物急性毒性試驗研究

陳紅1，馬國萍2，陳丹2，黃嬌2，謝平2，朱仙慕2

（1.福建省立醫院干一科臨床老年病研究所，福建福州350001；2.福建中醫藥大學藥學院，福建福州350122）

目的觀察玳玳果降脂提取物小鼠急性毒性，初步評價其用藥安全性。方法取40只體質量24～29 g昆明種小鼠，隨機分成給藥組與空白組各20只，雌雄各半，選用最大耐受量（MTD）法試驗。給藥組按玳玳果降脂提取物可以灌胃的最大濃度（0.8 018 g／mL）及小鼠可承受的最大體積（0.4 mL／10 g）一次性口服灌胃，空白組蒸餾水（0.4 mL／10 g）灌胃。灌胃給藥1次，連續觀察14 d，記錄小鼠的毒性反應、死亡情況。結果無法得出玳玳果降脂提取物LD50；給藥后連續觀察14 d，小鼠未見中毒反應，無動物死亡；給藥14 d后解剖小鼠，肉眼未見臟器異常；臟器指數評價，2組比較無顯著性差異（P＞0.05）。結論小鼠灌胃給藥最大耐受劑量為32.07 g／kg，相當于臨床成人日用量的285.07倍，提示玳玳果降脂提取物口服毒性小，臨床劑量下用藥安全。

玳玳果降脂提取物；最大耐受量；急性毒性試驗

玳玳（Citrus aurantium L.var daidai Tanaka）屬蕓香科柑桔亞屬，為酸橙變種，藥食同源植物，在我國福建閩北、浙江、四川一帶廣為栽培。玳玳又稱代代，其果在民間作為蘇枳殼被應用于中醫臨床，資源豐富且藥材相關不良反應少，是一種具有廣泛開發應用價值的藥用植物［1］。課題組以往研究表明：閩產玳玳果中含有黃酮、生物堿、揮發油等化學成分［2-4］，由其分離制備的玳玳果黃酮提取物具有良好的降脂抗氧化作用［5-8］。本研究根據中藥、天然藥物急性毒性研究的相關指導原則［9］，以最大給藥濃度和小鼠最大灌胃體積給藥，考察玳玳果降脂提取物的急性毒性反應，評價其口服用藥安全性，為獲得質量穩定、安全的玳玳果降脂提取物提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 受試藥物玳玳果降脂提取物（總黃酮含量82.7%，批號20170405），實驗室自制，取玳玳果藥材適量，6倍量75%乙醇回流提取3次，回收乙醇，減壓干燥，得玳玳果總黃酮粗提物；經AB-8型大孔吸附樹脂純化，收集50%乙醇洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，得玳玳果總黃酮提取物。

1.2 動物體質量24～29 g昆明種小鼠60只，雌雄各半，清潔級，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證編號：2015000520265。實驗前均在福建中醫藥大學實驗動物中心適應性飼養7 d，使用許可證號：SCXK（滬）2012-0002。

1.3 主要儀器ARA 520百分之一電子天平及AR 2140萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；100 mL三角燒瓶；50 mL燒杯；2 mL注射器。

1.4 統計學方法采用SPSS 18.0軟件進行數據處理，計量資料屬正態分布以（x±s）表示，采用t檢驗。

2 方法與結果

2.1 藥液配制取玳玳果降脂提取物24.06 g，臨用時用30 mL蒸餾水溶解，配制成具有一定黏稠度的混懸液，黏稠度以灌胃針測試，至抽藥吸取較難但不至于無法吸取的程度為止，即得玳玳果降脂提取物的最大濃度藥液（0.8 018 g／mL）。

2.2 小鼠急性毒性LD50預實驗取昆明種小鼠20只，雌雄各半，體質量24～29 g，給藥前禁食不禁水16 h，灌胃給藥玳玳果降脂提取物藥液1次，按本品可以灌胃的最大濃度（0.8 018 g／mL），小鼠可承受的最大體積（0.4 mL／10 g）灌胃給藥，給藥后自由進食和進水，并連續觀察7 d，觀察小鼠死亡數、體征變化及生理反應，擬找出100%死亡率，即Dm值。實驗結果表明：各組小鼠無死亡，狀況良好，無明顯中毒反應，無數據計算玳玳果降脂提取物LD50，故實驗選用玳玳果降脂提取物的最大耐受量（MTD）法試驗。

2.3 玳玳果降脂提取物急性毒性MTD法實驗取體質量24～29 g昆明小鼠40只，隨機分為給藥組與空白組各20只，雌雄各半，給藥前禁食不禁水16 h，給藥組按提取物可以灌胃給藥的最大濃度（0.8 018 g／mL）、小鼠可承受的最大體積（0.4 mL／10 g）灌胃給藥，空白組蒸餾水灌胃（0.4 mL／10 g）。灌胃給藥1次。給藥當天密切觀察4 h內2組小鼠灌胃后的癥狀，給藥4 h后自由進食進水。連續觀察14 d，觀察記錄小鼠外觀、行為、分泌物、排泄物、中毒癥狀以及死亡情況；同時稱量給藥前后14 d內的體質量，觀察小鼠體質量變化；若有小鼠死亡，立刻將死亡小鼠解剖，肉眼觀察小鼠各臟器；待第14天稱重后脫頸處死各組小鼠，肉眼觀察小鼠主要臟器組織是否有肉眼可見病變，若發現肉眼可見病變，則進行病理組織形態學檢查；同時稱取2組小鼠的各臟器濕重，計算臟器指數。小鼠癥狀、體征觀察指標見表1。

2.4 小鼠給藥后癥狀小鼠灌胃給藥后，密切觀察給藥當天4 h內各組小鼠的癥狀，并連續觀察14 d。實驗結果表明：給藥后30 min內，小鼠靜臥抱團，閉眼不動，無叫聲異常、流涎、流涕、呼吸困難、腹瀉等現象；但30 min后，小鼠大多逐漸恢復正常活動，在鼠籠內攀爬竄動，主動進食飲水；觀察14 d期間，小鼠排便恢復正常，由起初給藥后的黑灰色轉變為正常的豆黃色，活動自如，進食良好，毛色正常，觀察期間無小鼠死亡。

2.5 小鼠體重變化小鼠給藥后，連續觀察14 d并稱取各組小鼠體重。實驗結果表明：觀察14 d期間給藥組小鼠體重正常增長，與空白組比較，體重變化均無顯著性差異（P＞0.05），見表2。玳玳果降脂提取物MTD實驗小鼠體重自身差異曲線圖見圖1、圖2。

表1小鼠癥狀、體征觀察指標

圖1 MTD試驗雄性小鼠體重變化圖

2.6 小鼠臟器指數小鼠在給藥后第14天稱取體重后，脫頸處死，進行解剖，肉眼觀察心、肝、脾、胃、腎、胸腺等重要臟器變化，稱取各臟器濕重，計算臟器指數。臟器指數＝臟器濕重（mg）／小鼠體重（g）。實驗結果表明：小鼠實質器官肉眼觀察大致正常，無心肺瘀血，無肝脾腫大；給藥組小鼠各主要臟器的質地、顏色，與空白組小鼠各臟器的質地、顏色比較無異常，2組臟器指數比較，無顯著性差異（P＞0.05），見表3。

3 討論

3.1 課題組以往研究表明：玳玳果含有黃酮等活性物質，具有較好藥理和食療作用，由閩產玳玳果制備的玳玳果總黃酮提取物具有顯著的降脂、清除自由基及抗氧化作用，具有良好的藥用開發價值［2－4］。

3.2 預實驗以玳玳果降脂提取物可以灌胃的最大濃度（0.8 018 g／mL），小鼠可承受的最大體積（0.4mL／10 g）灌胃給藥1次，連續觀察7 d，無Dm值（100%死亡率），故玳玳果降脂提取物的急性毒性試驗選用最大耐受量（MTD）法。另外，給藥組小鼠在給藥后開始幾天，體重增加緩慢甚至減輕，主要原因是對小鼠的滿負荷灌胃導致的，經過幾天適應期后，小鼠體重逐漸恢復正常。

3.3 玳玳果降脂提取物小鼠急性毒性試驗經灌胃口服給藥未能測出玳玳果降脂提取物的LD50，根據《中藥、天然藥物急性毒性研究技術指導原則》［9］選用MTD法測定，結果表明：小鼠對玳玳果降脂提取物的最大耐受量為32.07 g／kg，玳玳果成人（體重以60 kg計）民間食用習慣的日口服最大劑量6.75 g／d，玳玳果降脂提取物的最大耐受量相當于臨床用量的285.07倍。一般以小鼠最大給藥量相當于成人臨床日用劑量的100倍以上為安全的［9］，提示玳玳果降脂提取物的毒性極低或基本無毒，規定劑量下口服用藥是安全的。

圖2 MTD試驗雌性小鼠體重變化圖

表3 2組小鼠臟器指數比較（x±s）

［1］陳丹，林超，劉永靜，等.代代的研究進展［J］.福建中醫藥大學學報，2008，18（1）：61-63.

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［3］曾令軍，陳丹，鄭利，等.玳玳黃酮降脂提取物的鑒別及其特殊雜質檢測［J］.中國中醫藥科技，2014，21（1）：42-43.

［4］曾令軍，陳丹，鄭利，等.玳玳黃酮提取物的質量標準研究［J］.中國藥品標準，2013，14（5）：337-341.

［5］陳丹，劉永靜.一種玳玳果總黃酮有效部位的制備方法［P］中國：CN201010556341，2011-5-18.

［6］劉永靜，陳丹，邱紅鑫，等.玳玳黃酮有效部位提取物降血脂作用的研究［J］.中國中醫藥科技，2013，20（6）：622-623.

［7］劉永靜，陳丹，邱紅鑫，等.玳玳果總黃酮體外抗氧化作用的研究（英文）［J］.中國現代應用藥學，2012，29（2）：97-101.

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［9］國家食品藥品監督管理局.藥物研究技術指導原則［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2006：209-216.

R285.5

A

1000-338X（2017）04-0037-03

2017-05-27

福建省醫學創新項目（2016-CX-45）；福建省科技計劃項目（2010Y2004）。

陳紅（1966—），女，副主任醫師，主要從事老年病學研究。

陳丹（1961—），女，博士，教授。E-mail：gscd2@163.com