氧化魚油對黃顙魚黑色素合成酶及內分泌激素的影響

程煒軒許國煥張 麗韓木蘭陳金濤魏逸峰

(1. 廣東省微生物研究所, 廣州 510070; 2. 廣東省菌種保藏與應用重點實驗室, 廣州 510070; 3. 廣東省微生物應用新技術公共實驗室, 廣州 510070; 4. 省部共建華南應用微生物國家重點實驗室, 廣州 510070; 5. 廣東碧德生物科技有限公司, 廣州 510663)

氧化魚油對黃顙魚黑色素合成酶及內分泌激素的影響

程煒軒1,2,3,4,5許國煥1,5張 麗1,5韓木蘭1,5陳金濤5魏逸峰5

(1. 廣東省微生物研究所, 廣州 510070; 2. 廣東省菌種保藏與應用重點實驗室, 廣州 510070; 3. 廣東省微生物應用新技術公共實驗室, 廣州 510070; 4. 省部共建華南應用微生物國家重點實驗室, 廣州 510070; 5. 廣東碧德生物科技有限公司, 廣州 510663)

實驗模擬自然氧化條件制備氧化魚油, 替代普通魚油加入飼料中, 研究其對黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)表皮黑色素、酪氨酸酶活力、血清與腦內分泌激素含量的影響。處理組分別為未替代組(C組)、50%氧化魚油替代組(Y50組)和100%氧化魚油替代組(Y100組), 結果表明: 隨著氧化魚油替代普通魚油的比例提高, 黃顙魚5級(黑色素占細胞面積80%以上)黑色素細胞比例上升; 酪氨酸酶活力上升, 但各組差異不顯著(P＞0.05); 皮質酮(CORT)在血清和腦組織中各組含量差異均不顯著(P＞0.05); 腎上腺皮質激素(ACTH)在腦組織中含量增加 (P＜0.05), 而血清中Y50組含量高于C組及Y100組(P＜0.05); 血清中促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)含量降低, Y50與Y100組之間差異不顯著(P＞0.05), 而腦組織中各組差異不顯著(P＞0.05); 血清中α-黑素細胞刺激素(α-MSH)含量, Y100組高于其他組(P＜0.05), 而腦組織中各組差異不顯著(P＞0.05)。上述結果表明,隨著氧化魚油替代普通魚油的比例提高, 5級黑色素細胞比例上升, 黃顙魚血清和腦組織中能互相轉換的ACTH與α-MSH總量提高, 變化趨勢與表皮黑色素含量和酪氨酸酶活性相一致。

黃顙魚; 氧化魚油; 黑色素; 酪氨酸酶; 內分泌激素

黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)屬于鯰形目(Siluriformes)、鲿科(Bagridae)、黃顙魚屬(Pelteobagrus Bleeker), 體色艷麗、肉質鮮嫩, 是一種優質名貴經濟魚類。在正常情況下, 體色呈古銅色。在人工養殖條件下, 由于飼料配方不合理及養殖條件惡化, 體色容易出現異常, 其中以黑體色異常的現象最為嚴重。據調查, 廣東出現黑體色異常的黃顙魚占了個體總數的10%—15%, 而個別養殖戶, 體色異常率更是在30%—50%。體色異常, 從視覺上難以被消費者接受, 嚴重影響黃顙魚的外觀及商品價值, 給養殖戶帶來重大經濟損失, 也給黃顙魚的產業化發展造成障礙。

黑體色的實現與黑色素細胞、黑色素的遷移和運輸密切相關。黑色素細胞的形成需要經過神經嵴分化、運輸到表皮, 逐漸成熟為黑色素細胞,當黑色素細胞受到刺激, 如紫外線照射或內分泌激素升高時, 黑色素細胞中的酪氨酸酶活力增強, 催化黑色素細胞從血液中攝取的酪氨酸, 經高爾基復合體變成多巴, 通過合成途徑合成黑色素[1]。在黑色素合成后, 黑色素細胞將黑色素通過細胞間的觸角狀連接轉運至周邊角質形成細胞, 使體色發黑。魚類與陸生動物一樣, 黑色素的作用主要是吸收光,起到光保護的作用。其次, 對于隱蔽自身、求偶等也起著重要作用[2]。黑色素的合成過程受到內分泌系統控制, 當內分泌系統受干擾時, 魚類黑色體色也可能受到影響[3]。

海產魚油富含ω-3系多不飽和脂肪酸(DHA和EPA), 而多種水產養殖品種自身不能合成多不飽和脂肪酸需要由飼料提供, 因此海產魚油在水產養殖飼料中使用范圍廣, 使用量也較大。然而海產魚油很容易氧化, 魚油氧化后顏色加深, 透明度降低, 黏稠, 流動性差, 刺鼻味道強烈。隨著飼料中魚油氧化程度的提高, 可導致瓦氏黃顙魚背部皮膚亮度呈下降趨勢[4], 但是魚油氧化對魚黑體色的影響機制目前還不清楚, 本研究模擬自然氧化條件制作氧化魚油, 替代普通魚油加入飼料中, 研究其對黃顙魚表皮黑色素細胞、酪氨酸酶、黑色素及相關激素的影響, 以期為氧化魚油對黑體色影響的機制研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

挑選體重(97.2±2.2) g的黃顙魚隨機分為3組,對照組、50%魚油替代組和100%魚油替代組, 每組設3個重復, 共9個實驗單元, 每單元投放魚30尾。養殖環境為室內養殖, 先用對照組飼料馴化2周后開始實驗, 每天07:00和18:00手工緩慢投喂至其表觀飽食, 投喂量約為魚體重的3%, 水溫保持在25—30℃, pH 7.2—7.6, 溶解氧不低于6.0 mg/L。養殖時間為8周, 在投喂后2h取樣, 確保飼料各組分充分消化吸收。

1.2 氧化魚油制作

實驗用油為未經精煉加工的鯖魚油, 取自福建高龍飼料有限公司。魚油運輸及儲存保持4℃以下。模擬天然氧化條件, 取出部分魚油制作氧化魚油[5], 制作過程為: 在魚油中添加質量分數為1%的水, 充分混合后, 于25℃條件下攪拌氧化, 在7d后參考GB/T 5538-1995方法測定過氧化值。氧化魚油過氧化值達到110.5 meq/kg。而未氧化魚油過氧化值為3.7 meq/kg。

1.3 實驗飼料

根據黃顙魚營養需求, 制作軟顆粒飼料[6,7](表 1), 按配比取料后, 干粉料先混合均勻, 魚油使用量為飼料總質量的8%, 按0、50%和100%比例用氧化魚油替代未氧化魚油, 加適量水混合制成軟顆粒飼料, 風干后–20℃冰箱中保存。各組飼料在制作完成后, 每飼料組取3個樣品, 各10 g, 粉碎、用石油醚溶解后、過濾, 濾液在30—40℃中, 經過真空抽氣泵回收石油醚后, 用于過氧化值檢測, 檢測方法與油脂過氧化值檢測方法相同。對照組標記為C組, 實測該組飼料過氧化值為(2.0±0.1) meq/kg。50%氧化魚油替代組標記為Y50, 實測該組飼料過氧化值為(8.9±0.2) meq/kg。100%氧化魚油替代組標記為Y100, 實測該組飼料過氧化值為(15.3±0.2) meq/ kg。商品飼料在天然條件、未加入抗氧化劑的情況下, 51d過氧化值為9.22 meq/kg, 與Y50組相近[8]。使用凱氏定氮法檢測飼料粗蛋白含量, 使用索氏抽提法檢測粗脂肪含量, 使用直接滴定法檢測淀粉含量, 每飼料組取3個樣品進行檢測, 結果顯示, 對照組飼料營養成分含量: 蛋白質(32.7±0.4)%、脂肪(12.3±0.1)%、淀粉(31.0±0.2)%。Y50組, 蛋白質(3 2.3±0.5)%、脂肪(1 2.0±0.2)%、淀粉(30.3±0.2)%。Y100組, 蛋白質(32.4±0.2)%、脂肪(11.7±0.2)%、淀粉(31.4±0.1)%。

表 1 實驗飼料組成Tab. 1 Composition of experimental diets (%)

1.4 皮膚、血液及腦組織取樣

每個實驗單元隨機選擇3尾魚, 每組共計9尾魚,檢測黑色素、酪氨酸酶活力及黑色素合成相關的內分泌激素的含量。

取樣前將實驗魚用MS222麻醉, 濃度為25 mg/ L, 時間為15—20min, 若魚體呈正常游動狀態, 保持靜止不動, 有聲響時僅尾部輕微擺動, 輕觸頭部時反應遲鈍, 用手去抓時不能及時逃避, 表明麻醉成功。

皮膚組織取樣, 將麻醉后的黃顙魚, 用鑷子小心剝取橫向: 背鰭基部至側線, 縱向: 頭身連接處至第一背鰭基部末端垂直方向一塊接近長方形的皮膚, 用手術刀片小心刮去皮膚表面黏液和下面銀色薄膜, 干紗布吸去皮膚表面水分, 使皮膚樣品透光,隨即進行顯微鏡觀察以及黑色素和酪氨酸酶的檢測。

血液取樣及處理, 迅速抽取麻醉后的黃顙魚尾靜脈血液至采血管中, 4000 r/min離心6min, 分離得到血清。

腦組織取樣, 將麻醉成功的黃顙魚于頭蓋骨末端處垂直向下迅速剪斷, 剪取頭部后, 用剪刀將頭蓋骨從中間剪開, 撐開頭蓋骨后取出腦組織。

1.5 皮膚中黑色素含量的測定

標準品烏賊黑色素(Sigma M-2649)購自Sigma公司, 采用分光光度法來檢測[9], 其處理方法如下:在1.5 mL EP管中, 依次加入1 mL 1 mol/L NaOH、0.1 g黑色素標準品、10 μL 3% H2O2, 于沸水浴中煮30min, 混勻, 待黑色素標準品完全溶解后, 分別按0、5%、10%、15%、20%、30%和40%的比例稀釋, 在402 nm處測定吸光度值, 繪制標準曲線。

剪刀配合眼科鑷準確剪取約0.1000 g (精確到0.0001 g)皮膚。先用95%乙醇固定皮膚樣品24h, 然后用1% HCl 60℃水浴1h以脫鈣。脫鈣后的皮膚樣品用蒸餾水反復沖洗3次, 最后用0.2% NaOH沸水浴煮1h以提取黑色素。用紫外分光光度計測量上清液在402 nm處的吸光度值, 與標準曲線比對算出黑色素的濃度。

1.6 皮膚中酪氨酸酶活力的檢測

參考諸葛燕等[10]的測定方法。準確稱取約0.2000 g (精確到0.0001 g)皮膚, 用50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 6.8)勻漿, 組織勻漿液4℃ 5000 r/mim離心20min, 將上清液取出并置于冰上用于檢測酪氨酸酶含量。先將1 mL 0.5 mmol/L L-DOPA加入5 mL離心管, 再加入2 mL組織勻漿上清液并立即混勻,于475 nm測定吸光度值A0; 將此混勻液于28℃水浴中精確反應10min, 并于475 nm再次測定吸光度值A10, 計算兩次吸光度值之差ΔA475=A10–A0。酪氨酸酶活力的計算方法為: 酪氨酸酶活力(U)=ΔA475/ (V×T×0.001), 式中: V為組織勻漿液的總體積(mL), T為反應時間(min), 酪氨酸酶活力的單位為U/g皮膚。

1.7 黑色素合成相關的內分泌激素含量檢測

使用放射免疫方法檢測促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質激素(ACTH)、皮質酮(CORT)、黑色素細胞刺激素(α-MSH)含量, 試劑盒購自北京華英生物技術研究所。取約3 mm3腦組織, 加到1 mL 100℃生理鹽水中煮沸5min后迅速冷卻, 再加0.5 mL 1 mol/L醋酸制成勻漿, 置4℃1—2h后, 2000 r/min離心15min, 取上清, 冷凍干燥后用RIA緩沖液進行復溶, 而血液激素方面的檢測,則是取出50 μL血清, 進行內分泌激素含量測定。

測定方法: 采用平衡法, 分別在不同的聚苯乙烯管中加入樣品、標準品、緩沖液和抗體。置4℃24h后, 加入含125I核素的標記抗原, 4℃放置24h后,加入分離劑, 震蕩3min, 3000 r/min離心3min, 棄上清, 測沉淀放射性強度, 通過標準品的放射性強度制作標準曲線, 然后根據樣品的放射性強度計算樣品含量。

1.8 數據統計分析

采用SPSS 15.0對數據進行統計分析, 組間所有數據均以平均值±標準差(Mean±SD)表示, 統計學顯著性水平為P＜0.05, 統計學比較方法采用單因素方差分析(ANOVA), S-N-K, Duncan’s進行多重比較, 區分顯著性差異水平。

2 結果

2.1 表皮黑色素細胞觀察

將黑色素擴散范圍占黑色素細胞的比例大小分為6級[11]: 0級, 無黑色素; 1級, 黑色素占黑色素細胞面積在0—20%; 2級, 黑色素占黑色素細胞面積在20%—40%; 3級, 黑色素占黑色素細胞面積在40%—60%; 4級, 黑色素占黑色素細胞面積在60%—80%; 5級, 黑色素占黑色素細胞面積在80%以上。表皮黑色素細胞鏡檢結果顯示, C組3級、4級、5級黑色素細胞分別占黑色素細胞總數的30.8%、38.2%和31%; Y50組3級、4級、5級黑色素細胞分別占黑色素細胞總數的15.5%、30.3%和54.2%; Y100組4級、5級黑色素細胞分別占黑色素細胞總數的10.5%和89.5%, 3個組黑色素細胞排列較為均勻(圖 1)。

2.2 黑色素含量

隨著氧化魚油替代普通魚油的比例提高, 表皮黑色素含量有上升趨勢, Y100組高于C組(P＜0.05),而C組與Y50, Y50與Y100組之間差異不顯著(P＞0.05) (圖 2)。

圖 1 氧化魚油不同替代比例對黃顙魚表皮黑色素細胞的影響Fig. 1 Effects of different replacement ratios of dietary oxidized fish oil on epidermal melanin cellsA. C組, B. Y50組, C. Y100組, 標尺為100 μmA. C group, B. Y50 group, C. Y100 group, Rulers are 100 μm

圖 2 氧化魚油不同替代比例對黃顙魚表皮黑色素含量的影響Fig. 2 Effects of different replacement ratios of dietary oxidized fish oil on skin melanin content相同字母表示組間差異不顯著, 不同字母表示組間存在顯著性差異, 圖 3同The presence of same superscripts indicate no significant difference between the groups, while different superscripts indicate significant differences, the same as Fig. 3

2.3 酪氨酸酶活力

隨著氧化魚油替代普通魚油的比例提高, 表皮酪氨酸酶活力有上升趨勢, 但各組差異不顯著(P＞0.05) (圖 3)。

2.4 黑色素合成相關的內分泌激素含量

各組血清皮質酮(CORT)含量無顯著差異(P＞0.05), Y50組促腎上腺皮質激素(ACTH)含量顯著高于C組及Y100組(P＜0.05), Y50及Y100組促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)含量均顯著低于C組(P＜0.05), α-黑素細胞刺激素(α-MSH)方面, Y100組顯著高于C組和Y50組(P＜0.05)(表 2)。

腦組織中各組α-MSH、CORT、CRH含量均無顯著性差異(P＞0.05), Y50及Y100組ACTH含量均顯著高于C組(P＜0.05), 而且Y100組也顯著高于Y50組(P＜0.05) (表 3)。

圖 3 氧化魚油不同替代比例對黃顙魚表皮酪氨酸酶活力的影響Fig. 3 Effects of different replacement ratios of dietary oxidized fish oil on skin tyrosinase activity of P. fulvidraco

3 討論

3.1 氧化魚油對表皮黑色素細胞內黑色素分布的影響

黑色素細胞并不僅存在于表皮, 在毛囊中、眼睛也有大量分布, 而其他部位, 如腦膜、肛門處也有少量黑色素細胞存在。在黑色素細胞中, 黑色素顆粒如果以擴散的方式存在, 則魚體色顯黑[12]。黑色素鏡檢結果顯示, 隨著飼料中魚油氧化程度的提高, 5級黑色素細胞, 即黑色素擴散至細胞面積76%以上的細胞, 其比例呈上升趨勢, 體色發黑, 這與瓦氏黃顙魚的研究結果相近[4]。而排列較為均勻說明氧化魚油沒有造成黑色素細胞數目減少。

3.2 氧化魚油對表皮黑色素及合成酶的影響

黑色素在哺乳動物和鳥類有2種形式: 真黑色素, 顯黑色或暗褐色和棕黑素, 顯紅色或黃色。大多數黑色素細胞不保留黑色素, 而是將黑色素顆粒沿著微管運輸到樹突, 然后轉移到其他角質細胞。魚的情況有所不同: 黑素細胞只能產生真黑素, 而且黑素顆粒能保存在黑色素細胞內[13]。酪氨酸酶(tyrosinase, TYR)是已知的作用于黑色素生物合成的關鍵酶, 它可有效地防止紫外線(UV)對皮膚的損傷。TYR催化黑色素細胞從血液中攝取酪氨酸, 在高爾基體內合成多巴及其氧化產物多巴醌, 從而合成真黑色素[1]。本實驗結果顯示, 酪氨酸酶活力隨飼料的過氧化值的提高而有所提高, 但是組間差異不顯著(P＞0.05)。而表皮黑色素的合成量也有所提高, Y100組顯著高于對照組, 說明氧化魚油對黑色素的合成有促進作用。

表 2 氧化魚油不同替代比例對黃顙魚血清中內分泌激素的影響Tab. 2 Effects of different replacement ratios of dietary oxidized fish oil on plasma hormone concentrations of P. fulvidraco

表 3 氧化魚油不同替代比例對黃顙魚腦組織中內分泌激素的影響Tab. 3 Effects of different replacement ratios of dietary oxidized fish oil on brain hormone concentrations of P. fulvidraco

3.3 氧化魚油對血清及腦組織中黑色素合成激素的影響

黑色素的合成受到多種激素的調節, 促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)主要作用是促進腺垂體合成與釋放促腎上腺皮質激素(ACTH), ACTH肽鏈的前13個氨基酸與促黑色素(MSH)的完全相同, 主要作用是促進糖皮質激素分泌, 可作為α-促黑激素(α-MSH)的前體, α-促黑色素(α-MSH)與黑色素細胞內的黑色素皮質素受體1(MC1R)結合后, 使與受體偶聯的G蛋白由無活性的二磷酸鳥苷(GDP)型轉變為有活性的三磷酸鳥苷(GTP)型, 激活膜上的腺苷酸環化酶系統, 三磷酸腺苷(ATP)轉變為環腺苷酸(cAMP), cAMP進一步激活TYR, TYR促進真黑色素合成[1]。另外, 有資料表明α-MSH與ACTH對黑色素細胞有促其樹突化的作用[14]。黑色素細胞樹突化或樹突的生長, 是黑色素轉移到角質形成細胞的必需過程。然而, 由于血腦屏障的存在, 腦中α-MSH并不能很好促進黑色素合成[15]。皮質酮(CORT)屬于腎上腺皮質激素, 受到ACTH調節, 血中CORT分泌過多時, 也能抑制ACTH的分泌[16]。而注射高劑量α-MSH也可以降低血漿CORT水平[17]。

在各組腦組織和血清中CORT均無顯著性差異(P＞0.05), 血清ACTH, Y50組高于C組及Y100組(P＜0.05), 腦組織中Y50及Y100組均高于C組(P＜0.05)。血清中α-黑素細胞刺激素(α-MSH)含量, Y100組高于其他組(P＜0.05), 而腦組織中各組差異不顯著。ACTH與α-MSH在血清與腦組織中的總量與皮膚黑色素含量相對應, 都是隨氧化魚油替代量增加而增加, 當中ACTH可能部分轉換為α-MSH[18]。在腦組織中, ACTH的分泌量隨飼料中氧化魚油替代量增加而增加, 說明氧化魚油造成的損傷也影響到黃顙魚腦ACTH的分泌, 與ACTH防御或者修復氧化損傷的作用相關[19]。CRH、Y50及Y100組均低于C組(P＜0.05)。各組腦組織中CRH均無顯著性差異, 與腦中ACTH分泌量增加對CRH的分泌起到負反饋調節相關[20]。

上述結果表明, 隨著氧化魚油替代普通魚油比例提高, 黃顙魚血液和腦組織中ACTH與α-MSH總分泌量、表皮酪氨酸酶活力及黑色素含量, 三者均有所提高, 且變化趨勢一致。氧化魚油對黃顙魚黑色素合成的有促進作用, 且可能是通過α-MSH-酪氨酸酶這一途徑來實現。目前, 對黃顙魚黑體色的調節方法仍有所欠缺, 主要是由于黑體色的實現涉及黑色素細胞成熟、遷移以及黑色素的合成和轉運等多個方面, 且受到內分泌系統、神經系統的影響, 影響因素多且復雜。本研究針對飼料中氧化魚油比例提高對魚黑體色的影響, 從內分泌的角度闡述了其可能的機制, 對其黑體色的恢復起到一定的理論指導作用, 但是氧化魚油對魚體的影響是多方面多層次的, 不僅僅局限于內分泌系統。因此, 氧化魚油對黃顙魚黑體色的影響還需要進一步深入研究。

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EFFECTS OF DIETARY INCLUSION OF OXIDIZED FISH OIL ON MELANIN, MELANIN SYNTHETIC ENZYMES AND HORMONES OF PELTEOBAGRUS FULVIDRACO

CHENG Wei-Xuan1,2,3,4,5, XU Guo-Huan1,5, ZHANG Li1,5, HAN Mu-Lan1,5, CHEN Jin-Tao5and WEI Yi-Feng5(1. Guangdong Institute of Microbiology, Guangzhou 510070, China; 2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangzhou 510070, China; 3. Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology, Guangzhou 510070, China; 4. State Key Laboratory of Applied Microbiology, South China, Guangzhou 510070, China; 5. Bide biotechnology Co., Ltd. of Guangdong, Guangzhou 510663, China)

We investigated the effects of fish feed containing oxidized fish oil on epidermal melanin expression, tyrosinase activity, and hormone levels related to melanin synthesis in the serum and brain of Pelteobagrus fulvidraco. Fish oil was oxidized under natural conditions and substituted for normal fish oil in fish feed at concentrations of 100% (group Y100), 50% (group Y50), and 0 (group C). Level 5 melanin cells, in which melanin accounts for ＞80% of the cell area, increased in a dose-dependent manner with the amount of oxidized fish oil in the feed. There was a tendency for tyrosinase activity to increase with the amount of oxidized fish oil in the fish feed, but the increase was not statistically significant. Brain tissue adreno-cortico-tropic hormone (ACTH) increased with the amount of oxidized oil in feed, while it only increased significantly in the serum of the Y50 group. Serum corticotropin releasing hormone decreased significantly in both the Y50 and 100 treatment groups but showed no significant changes in brain tissues. Similarly, serum α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH) in group Y100 was significantly elevated, but no significant differences were detected in brain tissues. In contrast, serum and brain tissue corticosterone levels showed no significant differences among the three groups. These results suggest that oxidized fish oil in fish feed was positively related to the proportion of level 5 melanin cells and epidermal tyrosinase activity. Such changes were related to the increase in ACTH and α-MSH in P. fulvidraco.

Pelteobagrus fulvidraco; Oxidized fish oil; Melanoma; Tyrosinase; Hormone

Q786

A

1000-3207(2017)05-1020-07

10.7541/2017.127

2016-09-23;

2017-01-16

廣東省海洋漁業科技與產業發展專項科技攻關與研發項目 (A201401B05); 2015年廣州市科技計劃項目(一般項目) (201510010239); 廣東省科學院引進高層次領軍人才專項資金(2016GDASRC-0202)資助 [Supported by the Science and Technology Special Development Program for Guangdong Province Marine Fishy Science, Technology and Industrial Development (A201401B05); the Science and Technology Planning Project of Guangdong Province in 2015 (201510010239); the High-level Leading Talent Introduction Program of GDAS (2016GDASRC-0202)]

程煒軒(1981—), 男, 廣東中山人; 博士; 主要從事水生動物營養學研究。E-mail: chan714@126.com

許國煥(1963—), 男, 湖北洪湖人; 碩士, 研究員; 主要從事水生動物營養學研究。E-mail: xghfish@163.com