大亞灣水域并基擬菱形藻的種類鑒定和產毒特征分析

黃春秀 徐國雙 李 揚

(華南師范大學生命科學學院, 廣州市亞熱帶生物多樣性與環境生物監測重點實驗室, 廣州 510631)

大亞灣水域并基擬菱形藻的種類鑒定和產毒特征分析

黃春秀 徐國雙 李 揚

(華南師范大學生命科學學院, 廣州市亞熱帶生物多樣性與環境生物監測重點實驗室, 廣州 510631)

為了豐富我國海域擬菱形藻(Pseudo-nitzschia Peragallo)的物種多樣性, 并澄清其產毒特征, 研究從廣東大亞灣海域分離并建立了一株擬菱形藻的單克隆培養株系MC298, 通過光學顯微鏡下的群體特征和透射電鏡下的超微形態特征觀察, 結合基于核糖體轉錄間隔區(Internal Transcribed Spacer, ITS)的分子系統學數據, 以及基于ITS2轉錄RNA的二級結構分析, 鑒定到我國擬菱形藻屬的1個新記錄種: 并基擬菱形藻P. decipiens Lundholm & Moestrup。研究對其形態學特征進行了較為詳細地描述, 并與相似種進行了比較, 還對其ITS2-RNA的特有標志結構進行了闡述。同時, 利用高效液相色譜-質譜聯用法(Liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)對該藻株的產毒特征進行了檢測, 結果未檢測到DA的存在。研究不僅豐富了我國擬菱形藻屬的物種多樣性, 也可為擬菱形藻的產毒特征研究提供基礎數據。

并基擬菱形藻; 分類學; 形態; 核糖體轉錄間隔區; ITS2-RNA二級結構; 多莫酸

擬菱形藻(Pseudo nitzschia Peragallo)是一類常見的海洋浮游硅藻, 廣泛分布于全球近岸水體[1,2]。人們對于擬菱形藻的高度關注始于1987年的一次中毒事件。當年11月, 在加拿大愛德華王子島發生了一起由于食用紫貽貝(Mutilus edulis Linnaeus)而引起的中毒事件, 造成100多人中毒, 其中3人死亡[3]。后經充分研究, 確認引發中毒的物質是多莫酸(Domoic acid, DA), 而產生DA的肇事生物是一種擬菱形藻: 多列擬菱形藻P. multiseries (Hasle) Hasle。此后, 能夠產生DA的擬菱形藻種類又陸續在歐洲、大洋洲被報道[1,2], 人們開始意識到硅藻種類也可以產生毒素, 擬菱形藻也由此受到人們的廣泛關注,并成為研究熱點[4—9]。

隨著研究的深入, 以及物種多樣性的快速增加,擬菱形藻種類的準確鑒定越來越困難, 對鑒定技術和人員素養均提出了較高的要求。不同種類之間的形態學差異非常細微, 需要應用透射電鏡進行觀察, 但是以超微形態學特征對擬菱形藻進行鑒定仍存在著許多困難和爭議[10]。近十幾年來, 分子標記技術在擬菱形藻屬的分類學中得到廣泛應用, 并取得了顯著成果, 證實了該屬中隱形種(Cryptic species)和擬隱形種(Pseudo cryptic species)的普遍存在[4,11,12], 這也極大增加了擬菱形藻種類鑒定的難度。目前已有多種分子標記應用于擬菱形藻屬的分類學研究中, 其中轉錄間隔區序列(Internal Transcribed Spacer, ITS)被認為是針對擬菱形藻屬的最適標記[4,11]。另外, 近年來依據ITS2轉錄RNA二級結構的分析工作, 也對擬菱形藻的分類學研究起到了促進作用[6—8,13]。截止目前, 國際上報道的擬菱形藻種類已有48個[6—8,13], 而我國的相關研究還相對滯后, 只報道了17種[9,10,14,15], 而且多數工作都是僅基于透射電鏡下的形態特征進行物種鑒定。相對于我國綿長的海岸線和遼闊水域而言, 目前報道的擬菱形藻物種多樣性明顯偏低, 或許還有未被認知的種類存在。

另一方面, 全球記錄的48種擬菱形藻中, 有24種可產生DA的報道[1,2,8], 其中有些種類在我國也有分布[9,10,14,15], 但截至目前, 我國尚未有擬菱形藻產生DA的直接報道。在以往的研究中, 我國學者曾嘗試檢測中國海域擬菱形藻株系的DA毒素,均未檢測到DA的存在[9,14]。然而近年來, 我國一些海產品中已有DA檢出的報道[16—18], 證實了DA在我國沿海的分布, 但其真正的生物來源尚不明確, 這也影響到了DA中毒事件的預警預報。

基于上述原因, 本文嘗試建立中國的擬菱形藻單克隆培養株系, 結合形態學和分子分類學技術,開展物種多樣性的工作。本文報道了我國的1個新記錄種: 并基擬菱形藻P. decipiens Lundholm & Moestrup。同時利用高效液相色譜-質譜聯用法(LC-MS/MS)開展DA的檢測工作。以期能夠豐富我國擬菱形藻屬的物種多樣性, 并為其毒理研究提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 單克隆藻株的建立

利用浮游植物網(孔徑10 μm)進行水平拖網, 以采集活體浮游植物樣品, 并盡快帶回實驗室。利用毛細管法在倒置顯微鏡下挑取目標藻細胞, 轉移至盛有f/2培養液的載玻片上, 經過多洗水洗和轉移,以確保目標藻的純化, 然后再轉移至滴有f/2培養液的96孔細胞培養板中[9], 放置在室溫20℃、光周期12h:12h的條件下培養。待其存活并繁殖達到約100個藻細胞之后, 轉移到盛有f/2培養液的100 mL錐形瓶中擴大培養, 以MC (Marine collection)序列進行編號, 本文從廣東大亞灣海域分離并建立了一株并基擬菱形藻MC298。

1.2 形態學觀察

光鏡觀察: 取處于對數生長期的藻液0.1 mL,滴在0.1 mL浮游植物計數框中, 加上蓋玻片后在Olympus BX53光學顯微鏡下進行微分干涉(Differential interference contract, DIC)觀察, 并利用Olympus DP27數碼相機拍照。

透射電鏡觀察: 取對數生長期的藻液10 mL, 靜置沉淀濃縮至2—5 mL, 加入等量濃硫酸(＞95%)以去除有機質, 然后用蒸餾水多次水洗至中性[9]。用微量進樣器吸取5—10 μL酸化后的水樣, 滴加在噴鍍碳膜的銅網上, 自然晾干后, 即可在JEM-1010 TEM下觀察和拍照。

1.3 分子系統學分析

用0.22 μm醋酸纖維濾膜過濾對數生長期藻液10 mL, 收集濾膜上的藻細胞, 進行總DNA的提取[19]。利用引物1380F和ITS4進行核糖體轉錄間隔區(ITS)的擴增和測序[19]。從NCBI下載擬菱形藻屬各個種類的ITS序列, 使用BioEdit軟件進行序列的比對和矩陣[5], 基于MrModeltest 2.3計算的最適模型[19], 然后分別用RAxML-HPC2[20]和MrBayes 3.2[21]構建最大似然樹(Maximum likelihood, ML)和貝葉斯推理樹(Bayesian inference, BI)。其中ML分析的自檢值(Bootstrap test)設定為1000。

1.4 ITS2二級結構的預測及CBCs分析

從GenBank下載P. sabit的ITSrDNA序列, 參考序列標注, 將其ITS2片段截下。使用Mfold[13]在線預測P. sabit ITS2的二級結構, 所得二級結構含4個環和一個擬菱形藻屬環。以P. sabit二級結構同源模板, 使用ITS2 Database[13]在線預測目標藻株的RNA二級結構。使用VARNA[13]觀察并下載二級結構。同時使用4SALE v.1.7[8]軟件中自帶的補償堿基變化(CBCs)Table觀察CBC情況, 分析生殖隔離情況。

1.5 LC-MS/MS法檢測藻毒素

取處于生長穩定期中后期的藻液5 mL, 經0.22 μm醋酸纖維濾膜過濾, 收集濾液于離心管中, 用于分析胞外DA量; 另外用5 mL滅菌海水將濾膜上的藻細胞重懸, 轉移到另一個離心管中。將藻液用超聲波破碎儀冰浴破碎3—5min, 經0.22 μm濾膜過濾,濾液于–20℃下保存備用或直接進樣分析。

采用Prominence UFLC超快速液相色譜(Shimadzu公司)和5500 QTRAP四極桿-線性離子阱復合質譜檢測系統(SCIEX公司)對預處理的樣品進行DA檢測, 參見Wu等[22]方法進行分析。DA標準品購自德國Sigma公司。

2 結果

2.1 擬菱形藻的分類學研究

基于形態學和分子系統學的數據, 以及ITS2-RNA二級結構的分析結論, 本文鑒定到我國擬菱形藻屬的一個新記錄種: 并基擬菱形藻P. decipiens。

形態學描述 并基擬菱形藻 Pseudo nitzschia decipiens Lundholm & Moestrup(圖 1A—G)

細胞具有兩個黃褐色的色素體, 對稱分布在中節兩側, 可單個細胞生活, 也可形成2—4個細胞的鏈狀群體(圖 1A), 重疊部為殼面全長的1/5—1/6。細胞殼面縱軸呈現披針形(圖 1B), 殼端鈍圓(圖1C), 兩殼端形狀相似。殼面長45—47 μm, 寬1.4—1.6 μm。管殼縫強烈偏心(圖 1D, E)。有中央較大船骨點(圖 1E)。肋突分布在殼緣, 排列不規則(圖 1D), 密度為20—27個/10 μm。點條紋由兩排孔紋組成, 密度為46—50條/10 μm。孔紋為不規則的六邊形, 密度1 μm內9—13個。觀察到3條環帶(圖1F), 殼環帶寬2個孔紋, 高2—3個孔紋, 點條紋密度50—53個/10 μm, 孔紋內部由六角形的篩孔構成(圖 1G); 第二條環帶一側有孔紋, 另一側為無紋區;第三條環帶未見孔紋。

圖 1 并基擬菱形藻

本研究建立了1個培養株系MC298, 主要形態學特征與以往報道基本相符。

毒性: 本種尚未有產生多莫酸的報道[4], 本文亦未檢測到。

生態: 海水浮游生活。

分布: 標本采自大亞灣海域(4月)。本種曾報道于黑海、加那利群島、墨西哥灣、意大利第勒尼安海[4, 23]。

基于ITS序列分析的分子系統學分析 利用RAxML對ITS1-5.8S-ITS2序列的733個堿基進行了比對分析, 建立了分子系統樹(圖 2)。MC298與已報道的三株并基擬菱形藻聚在同一個分支上, 且具有較高的置信值(BPP＞95, ML＞90), 這表明分子分類的結果也支持形態鑒定的結論。同時, MC298與其他海域的并基擬菱形藻也存在少許遺傳差異, 與墨西哥圖斯潘海域株系(Mex13)具有完全相同的ITS序列, 與馬來西亞株系(PnKk38)有3個堿基的差異, 與西班牙加那利群島株系(GranCan4-1)的遺傳差異最大, 有9個堿基的差異。

圖 2 基于核糖體轉錄間隔區ITS1-5.8S-ITS2的分子系統樹(以N. bizertensis為外類群)Fig. 2 The phylogenetic tree based on ITS1-5.8S-ITS2 rDNA with N. bizertensis as outgroup

ITS2二級結構分析 并基擬菱形藻ITS2二級結構模型顯示了ITS2結構的普遍特征, 有4個單環和1個擬環IIa(圖 3), 與其他擬菱形藻種類的ITS2二級結構基本一致[6,23]。MC298與以往報道的并基擬菱形藻株系(Mex13、PnKk38)具有完全一致的ITS2二級結構, 但GranCan4-1在helixⅢ有兩個HCBCs (半補償性堿基變化)(G:U ? G:C; C:G ?U:G; 1 SNP)的差異, 而且分子系統樹上GranCan4-1與其他兩個株系處在不同的分支上(圖 2), 基于P. mannii和P. calliantha只有一個HCBCs的差異[23], 因此GranCan4-1是否為并基擬菱形藻有待后續的研究。將MC298與系統發育樹上親緣關系最近的P. sabit相比較, 發現有2—3個HCBCs的差異, 還有3—4 SNPs(單核苷酸多態性)差異。并基擬菱形藻ITS2-RNA的特有分子特征主要在helix III, 31 bp信號區域: 5′-UUGUUACUAGCUGUUUGAACGA CUACUAAAA-3′。基于MC298具有與以往報道的其它并基擬菱形藻株系(Mex13和PnKk38)的完全一致的ITS2二級結構, 亦支持了形態學與ITS分子鑒定的結果。

圖 3 并基擬菱形藻ITS2二級結構圖Fig. 3 The secondary structure of ITS2-RNA in Pseudo-nitzschia decipiens strain MC298

2.2 多莫酸產毒特征的LC-MS檢測

以DA標準品濃度(μg/mL)為橫坐標, 峰面積為縱坐標, 建立多莫酸LC-MS檢測的標準曲線, 多莫酸濃度為0.1—16 μg/mL時, 其峰面積與質量濃度有良好的線性關系(R2=0.9999), 回歸方程為: y= 87.1875x。本方法的檢測下限為10 ng/mL。多莫酸的出峰保留時間為13.613min。對常規培養的并基擬菱形藻進行LC-MS檢測, 結果在預定的保留時間內都未出現樣品峰。表明本藻株未檢出DA。

3 討論

3.1 并基擬菱形藻與相似種的比較

2006年Lundholm等[4]對分離自不同海域的多個“柔弱擬菱形藻P. delicatissima Cleve”株系進行了形態學和分子數據的研究, 發現它們在形態學特征上相似, 但在ITS序列構建的系統樹中存在較大遺傳學差異, 推測柔弱擬菱形藻中存在(擬)隱形種,并根據形態學、ITS系統發育的數據, 報道了2個新種: 并基擬菱形藻和疑難擬菱形藻P. dolorosa Lundholm & Moestrup, 繼而提出了柔弱擬菱形藻復合群P. delicatissima complex的概念, 并基擬菱形藻正是該復合群的種類之一。2009年Quijano-Scheggia等[24]利用形態學與ITS系統發育分析, 研究了地中海西北部的柔弱擬菱形藻株系, 并測試了一些株系的有性繁殖和生殖隔離, 發現這些株系呈現兩個截然不同的遺傳分支, 而且出現了生殖隔離, 以此為依據報道了1個新種: 阿雷擬菱形藻P. arenysensis Quijiao-Scheggia, Garcés & Lundholm。該研究也認為以往報道的柔弱擬菱形藻應該是一個復合群, 包含有多個(擬)隱形種, 這也驗證了Lundholm等[7]的觀點。截止目前, 柔弱擬菱形藻復合群包含有6個種: 柔弱擬菱形藻、并基擬菱形藻、疑難擬菱形藻、亞太平洋擬菱形藻P. subpacifia (Hasle) Hasle、腫脹擬菱形藻P. turgidula (Hustedt) Hasle和阿雷擬菱形藻。

柔弱擬菱形藻復合群的種類具有較為相似的形態學特征: (1)殼面披針形; (2)點條紋由兩排孔紋組成; (3)具有中央較大船骨點。同時, 它們之間也存在細微的區別, 主要體現在肋突、點條紋和孔紋的密度上。并基擬菱形藻的肋突密度(20—26 μm)、點條紋密度(41—46 μm)、孔紋密度(9—13 μm)明顯高于疑難擬菱形藻(18—22 μm, 30—36 μm, 5—8 μm)[4]和腫脹擬菱形藻(13—18 μm, 23—28 μm, 7—9 μm)[25], 而且環帶上的孔紋密度(48—55 μm)也明顯高于疑難擬菱形藻(40—44 μm)[4]。腫脹擬菱形藻和亞太平洋擬菱形藻的殼面橫軸明顯較寬(1.4—2.4 vs. 2.5—3.5 μm; 1.4—2.4 vs. 3—5 μm)[4,25]。并基擬菱形藻與柔弱擬菱形藻的區別在于, 前者點條紋密度(41—46 μm)、孔紋密度(9—13 μm)和環帶上孔紋密度(48—55 μm)都略高于后者(35—40 μm, 8—12 /μm, 43—48 μm)[4]。并基擬菱形藻與阿雷擬菱形藻最為相似, 只在點條紋密度(41—46 vs. 34—43 μm)和環帶上孔紋密度(48—55 vs. 40—50 μm)較高于后者[4,24]。

分子系統學的研究已經證實, 擬菱形藻屬內的多個復合群, 如柔弱擬菱形藻復合群、偽柔弱擬菱形藻復合群等, 都是基于相似形態學特征而建立的種類集群, 并不能反映各個種類之間的系統學關系[4,7,8,24]。在分子系統樹中, 柔弱擬菱形藻復合群的各個種類分別位于不同的分支上, 只有疑難擬菱形藻與并基擬菱形藻的親緣關系比較接近(圖 2)。并基擬菱形藻的遺傳相似種類主要有3個: 鐮刀擬菱形藻P. sabit Teng, Lim, Lim & Leaw、銀河擬菱形藻P. galaxiae Lundholm & Moestrup和疑難擬菱形藻。除了疑難擬菱形藻之外, 并基擬菱形藻與其他遺傳相似種在形態學上都有明顯區別。并基擬菱形藻與鐮刀擬菱形藻的親緣關系最為接近, 但兩者形態上存在明顯差異, 最大的區別在于后者的殼面呈獨特的鐮刀狀[7]。并基擬菱形藻與銀河擬菱形藻在形態學上最明顯的區別是: 前者的點條紋由明顯的兩排孔紋構成, 而后者點條紋中未見明顯的孔紋[4]。并基擬菱形藻與疑難擬菱形藻的形態學特征較為相似, 除了前面已經比較過的肋突、點條紋、孔紋密度區別之外, 后者殼面點條紋會出現單排孔紋的情況, 而前者則未見單排孔紋[7]。

在以往關于擬菱形藻的分類學或生態學研究中, 柔弱擬菱形藻是我國沿海的常見種類, 在多個海域均有報道[26—28]。但是基于最新的國際研究動態, 并基擬菱形藻與柔弱擬菱形藻具有極為相似的形態特征, 單純依據形態特征的觀察, 缺少分子數據支持, 難以進行準確的物種鑒定。因此, 在我國海域廣泛分布的, 究竟是柔弱擬菱形藻, 還是并基擬菱形藻, 亦或是其他相似種類, 還需后續研究加以澄清。

3.2 擬菱形藻屬DA產毒特征分析

并基擬菱形藻首先報道于墨西哥灣[4], 之后在意大利第勒尼安海也有記錄[23], 均未檢測到多莫酸的存在。本研究從中國海域分離并建立了并基擬菱形藻的室內培養株系, 利用LC-MS技術檢測DA,結果也沒有檢測到DA的存在。

截至目前, 全球已報道能夠產生DA的擬菱形藻種類達到24種[1,8], 其中7種在我國也有分布[9]。但是我國并未有擬菱形藻產毒的直接報道。擬菱形藻的產毒是一個復雜的生理學現象, 有著地域、環境和種源的差異。如采自馬來西亞波德申(Port Dickson)的5株柯氏擬菱形藻P. kodamae Teng, Lim, Leaw & Lim可產生DA, 但采自東馬來西亞美里(Miri coast)海岸的3株柯氏擬菱形藻卻沒有檢測到DA[8]。同樣的情況也出現在尖刺擬菱形藻P. pungens Hasle、多紋擬菱形藻P. multistriata Takano等[9]種類。隨著研究的深入, 發現擬菱形藻不同株系間產毒性能存在很大的差異, 這可能與不同地理環境有關, 如物理因素, 生物因素及營養參數[1]。

另一方面, 除了擬菱形藻以外, 咖啡雙眉藻(Amphora coffaeiformis)可產生低濃度的DA[29]。近年來有報道稱在越南蝦池內采集到一種底棲菱形藻(Nitzschia navis-varingica)可產生大量的DA[30]。隨后日本、泰國、越南和菲律賓等地都有發現產生DA的Nitzschia navis-varingica[31,32]。2014年Smida等[33]在突尼斯分離出的Nitzschia bizertensis也檢測到低濃度的DA。上述研究表明DA的生物來源應該是多樣性的。

雖然中國沿海至今未有擬菱形藻產生DA的直接報道, 但是水產品中已有DA的檢出報道。陳西平等[34]在采自我國渤海等海域部分海產品中檢測出DA, 檢出率為50%, 其中象牙蚌、珍珠貝等含量最高, 為8.14 μg/g。李大志等[35]在采自大連海域黑石礁的扇貝中也檢測到DA。宋俐俐等[16]在浙江沿海的水產品中檢測到DA。吉薇等[17]在湛江、北海等地多種貝類中均檢測出DA, 其中, 鈍齒短漿蟹和扇貝的含量最高, 可達18.2 μg/g。王恒[18]在舟山海域出產的貝類中也檢測到DA的存在, 檢出率大于64%。那么存在于這些貝類中的DA從何而來?來自于擬菱形藻, 還是有其他生物來源?因此, 對中國沿海DA來源的排查應該引起重視, 除了加大對中國沿海擬菱形藻的產毒檢測力度之外, 還需關注其他已報道的產毒硅藻種類。

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THE IDENTIFICATION OF PSEUDO-NITZSCHIA DECIPIENS FROM DAYA BAY AND ANALYSIS OF ITS DOMOIC ACID PRODUCTION

HUANG Chun-Xiu, XU Guo-Shuang and LI Yang
(Guangzhou Key Laboratory of Subtropical Biodiversity and Biomonitoring, College of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

The marine diatom genus Pseudo-nitzschia Peragallo, the main biological source of Amnesic Shellfish Poisoning (ASP) - domoic acid (DA), has attracted great attention worldwide, and has became the hotspot in the research field of phycology and environmental toxins. Lots of progress has been made in the past two decades with 48 newly described taxa and 24 species that can produce DA. In China, a total of 17 taxa has been reported without any detectable DA from Chinese Pseudo-nitzschia strains. To investigate the species diversity of Pseudo-nitzschia in Chinese coast and the ability of DA production for Chinese Pseudo-nitzschia, monoclonal strains were isolated and established from Daya Bay, the South China Sea. These strains were identified based on the morphological characteristics by light microscopy and transmission electron microscopy and molecular analysis using the internal transcribed spacer region of ribosomal rRNA encoding gene, and the secondary structure of ITS2 RNA transcripts. We reported one newly recorded species for China, P. decipiens Lundholm & Moestrup. Its morphology was described and compared with both morphology-similar and molecule-close taxa, and the unique molecular feature of the secondary structure of ITS2-RNA was analyzed. No detectable DA was observed from this species using a single liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) injection. This study enriches the diversity of the genus Pseudo-nitzschia in China, and may provide detail information for the further studies about DA production of Chinese Pseudo-nitzschia strains.

Pseudo-nitzschia decipiens; Taxonomy; Morphology; Internal transcribed spacer; ITS2-RNA secondary structure; Domoic acid

10.7541/2017.140

2016-08-05;

2016-11-20

國家自然科學基金(31570205, 31370235); 廣東省科技計劃項目(2015A030401084)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31570205, 31370235); Science and Technology Program Guangdong Province (2015A030401084)]

黃春秀(1989—), 女, 廣東茂名人; 碩士研究生; 主要從事藻類學研究。E-mail: 3127166788@qq.com

李揚, E-mail: liyang@scnu.edu.cn

Q949.27

A

1000-3207(2017)05-1118-08