青貯微生物及其對青貯飼料發酵品質影響的研究進展

許冬梅， 張 萍， 柯文燦， 郭旭生

(蘭州大學生命科學學院 草地農業生態系統國家重點實驗室， 甘肅 蘭州 730000)

青貯飼料是用新鮮的青綠飼草在厭氧條件下由乳酸菌經較長時間發酵制成的一種顏色黃綠、氣味酸香、柔軟多汁、適口性好、消化率較高的飼料，其能為反芻動物在冬春季提供優質的粗飼料[1]。微生物在青貯發酵過程中起到至關重要的作用，參與青貯過程的微生物種類很多，青貯原料上附著的微生物包括有利于青貯飼料發酵的微生物以及引起青貯腐敗變質的微生物等，主要有醋酸菌、梭菌、腐敗菌、霉菌、酵母菌和乳酸菌等。乳酸菌是青貯發酵過程中起主要作用的微生物[2]，他不僅可以利用原料的可溶性糖發酵產生有機酸尤其是乳酸，降低pH值，還可以通過競爭營養物質及產生細菌素等代謝物質抑制青貯有害菌[3]。但乳酸菌在牧草表面附著的數量遠小于好氧細菌[4]。牧草附著的乳酸菌在自然青貯中起重要作用，其數量和組成是決定是否需要接種外源乳酸菌來促進青貯發酵的關鍵因素[5]。就飼料青貯而言，一個良好的微生物發酵過程是將飼草調制成高品質青貯飼料的關鍵。而青貯飼料發酵過程的微生態調控是一個難度大但又具有重要學術價值和實踐價值的研究課題，長期以來一直都是國內外青貯飼料研究領域關注的熱點。因此，了解牧草附著微生物及青貯過程微生物群落組成與演替信息可為有效調控青貯飼料的發酵過程和調制優質的青貯飼料提供科學依據。

1 青貯微生物群落及其在青貯過程中的演替

自然新鮮的牧草表面附著的微生物不管是從組成上還是數量上都與青貯過程中及青貯結束的樣品有很大差異，而且附著乳酸菌在萎蔫和切碎的過程中會有所增加[6-7]。Bao等[8]利用三代測序技術研究顯示，青貯前后苜蓿樣品中檢測到的微生物共有超過960種，且青貯前巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)占絕對優勢，而青貯后乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)占優勢。有利于青貯發酵且在青貯過程中起主導作用的主要是厚壁菌門的乳酸菌，包括乳桿菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、片球菌(Pediococcus)腸球菌(Enterococcus)及鏈球菌(Streptococcus)6個屬[9-10]，不利于青貯及引起青貯腐敗的有好氧性菌、酵母、霉菌和大腸菌類。隨著青貯過程的推進，青貯微生物群落結構處在不斷變化中。

1.1 牧草表面附著的微生物

植物表面環境對微生物生長具有很大影響，濕度、太陽輻射、植物表面結構、植株營養分布等都是這個環境中影響附著微生物的關鍵因素[11]。植物表面附著的細菌主要是好氧性菌，真菌主要是酵母和霉菌，還會附著一些放線菌，而有利于青貯發酵的乳酸菌相對來說較少[4, 12]。由于植物表面環境的特殊性，使得不同植物以及同種植物生長在不同環境，其表面附著的微生物在種類和數量上都存在很大差異[13]。

就微生物數量來說，牧草表面附著的乳酸菌為101～106cfu·g-1FM，酵母101～107cfu·g-1FM，霉菌101～106cfu·g-1FM，因不同牧草種類、生長環境和生育期等表現出差異[14-20]。Cai等[21]對同一地點采集的玉米(Zeamays)、高粱(Sorghumbicolor)、苜蓿(Medicagosativa)及意大利黑麥草(Loliummulti·orum)表面附著微生物進行研究，發現這4種牧草表面附著的好氧細菌大概106cfu·g-1FM，腸球菌、明串珠菌、霉菌及酵母為104～105cfu·g-1FM，乳桿菌和片球菌為103cfu·g-1FM；其中高粱和黑麥草表面附著的片球菌只有100.2cfu·g-1FM，苜蓿表面附著的乳桿菌也只有100.2cfu·g-1FM；玉米表面附著的乳酸菌總數是高粱和苜蓿的2倍，是黑麥草的20倍，其結果如表1所示。

表1 不同牧草表面附著微生物種類及數量/ log10 cfu·g-1 FMTable 1 Epiphytic microorganism species and numbers on forages/log10 cfu·g-1 FM

同種牧草表面附著的微生物種類也存在差異，從Cai[18,21]對苜蓿、高粱、黑麥草等表面附著微生物在屬水平的研究看出，苜蓿表面附著的乳酸桿菌極少(<101cfu·g-1FM)，而相對來說明串珠菌較多(105cfu·g-1FM)；高粱表面附著的片球菌極少，而乳酸桿菌和腸球菌較多(104～105cfu·g-1FM)。不同牧草表面附著的微生物種類也存在很大差異。有研究表明，闊葉植物上分離到的細菌多樣性遠高于狹葉植物[13]。Huili Pang等[22]從青貯前的玉米、水稻、高粱及苜蓿樣品中分離鑒定了乳酸菌110株，結果表明：玉米表面主要附著的是食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)和融合魏斯氏菌(Weissellaconfusa)；高粱和水稻表面主要附著植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)；而苜蓿表面主要附著植物乳桿菌、類植物乳桿菌(lactobacillusparaplantarum)及假腸膜明串珠菌(Leuconostocpseudomesenteroides)。

由此可以看出，不同牧草表面附著的微生物種類和數量都有很大的差異，同種牧草生長在不同環境其表面附著的微生物也存在差異。而且牧草不同部位附著的微生物種類和數量也存在差異。例如，Moran等[23]對黑麥草不同部位附著乳酸菌數量研究，結果如圖1所示，靠近地面部分及花序附著乳酸菌數量相對較多。

圖1 黑麥草不同部位附著乳酸菌數量
Fig.1 Epiphytic lactic acid bacteria on plant parts within ryegrass
注：單位，log10cfu·g-1(±SD)
Note: unit, log10cfu·g-1(±SD)

1.2 青貯過程中微生物的演替

青貯發酵過程中微生物存在動態變化的過程。在這個變化過程中微生物會產生一些代謝產物，其含量會隨著青貯過程變化[24]。前人研究顯示，開始發酵后的幾個小時內牧草本身附著的好氧細菌還處于活躍期，當發酵體系中氧氣被消耗完，青貯關鍵菌中的乳球菌開始大量繁殖并產生乳酸降低體系pH，酵母、霉菌及好氧細菌受到抑制，隨著發酵進行，體系pH繼續降低，更耐酸的乳酸桿菌代替乳酸球菌主導發酵過程[25-26]。韓吉雨[27]用傳統純培養技術對玉米和苜蓿附著的乳酸菌進行研究，結果顯示青貯前期以乳酸球菌較多，隨著發酵進行，乳酸桿菌成為優勢菌主導青貯發酵過程。Eikmeyer等人[28]用宏基因組學方法研究的結果與前人相似，即隨著青貯過程的延長，由乳酸球菌演替為乳酸桿菌，其中一些異型發酵乳酸菌會產生一些揮發性脂肪酸，有利于青貯有氧穩定性及長期保存[29]。

青貯過程中各種微生物的數量也存在變化，整個動態變化過程受原料特性、發酵條件、添加劑等因素影響[30-32]。不同種微生物動態變化過程也存在很大差異。張慧杰[33]的研究顯示發酵過程中，乳酸菌數量的最大值為 109.50～1010.38cfu·g-1FM，出現在發酵15天或20天。而一般青貯結束后乳酸菌數量都能達到106～108cfu·g-1FM。

1.3 接種乳酸菌對青貯微生物的影響

由于附著于牧草表面的乳酸菌主要是異型發酵乳酸菌，但數量少[34]，一般達不到優質青貯飼料所需乳酸菌的要求(105cfu·g-1FM)，因此很多學者研究乳酸菌添加劑以提高青貯品質及提高青貯有氧穩定性。然而，接種外源乳酸菌會對牧草附著微生物產生一定影響，且不同牧草中接種不同種乳酸菌對青貯過程中微生物群落結構有不同的影響。Parvin和Nishino的研究表明[35]，添加植物乳桿菌抑制了羊草(Leymuschinensis)本身附著的細菌如一些腸道菌(Enterobacteria)，添加布氏乳桿菌(lactobacillusbuchneri)也會抑制附著于羊草表面的細菌，而在青貯30 d和90 d后細菌多樣性有所增加；而對意大利黑麥草、羊草、全株玉米及無芒虎尾草(Chlorisgayana)的研究表明[36]，青貯前的意大利黑麥草表面附著有腸道菌、假單胞菌(Pseudomonaspp)、伯克氏菌(Burkholderiaspp.)、沙雷氏菌(Serratiaspp.)、植物乳桿菌及糊精片球菌(Pediococcusdextrinicus)，接種了植物乳桿菌后對附著菌有一定的抑制作用但只是使DGGE條帶模糊，接種了短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)后DGGE結果表明新出現了短乳桿菌而其他雜菌條帶變模糊；青貯前全株玉米附著有植物乳桿菌、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)等，接種了植物乳桿菌及短乳桿菌后，基本未改變原有細菌的種類。李雁冰[37]研究了鼠李糖乳桿菌(lactobacillusrhamnosus)和布氏乳桿菌對黑麥草和玉米青貯微生物群落的影響，結果顯示添加鼠李糖乳桿菌對黑麥草青貯過程的細菌和真菌群落影響大于添加布氏乳桿菌組，而添加這兩種乳酸菌對玉米青貯過程的細菌和真菌的影響都不大。也就是說，接種外源乳酸菌后會抑制牧草本身附著的微生物，尤其是不利于青貯發酵的真菌及好氧細菌，但抑制效果因牧草本身附著菌的特性及青貯條件有關。而且在青貯發酵開始后接種的乳酸菌會與牧草附著的有害菌進行營養競爭并產生乳酸，乙酸及細菌素等代謝物質抑制有害菌的活動與繁殖，促使青貯過程快速有效進行，減少營養物質損失[38-39]。

2 青貯微生物對青貯飼料品質的影響

微生物在青貯過程中的活動及代謝產物會影響青貯發酵品質。無論是牧草本身附著的微生物還是外源接種的微生物都是影響青貯飼料品質的關鍵因素之一。

2.1 青貯微生物對青貯飼料發酵品質的影響

在青貯發酵初期，牧草附著的好氧細菌、酵母及霉菌等利用體系殘留的氧氣消耗牧草營養物質進行繁殖，降低飼料的青貯品質。而隨著乳酸菌大量繁殖，代謝產生的乳酸能夠快速降低飼料pH從而抑制雜菌，有利于改善青貯品質。然而，一般牧草附著的乳酸菌達不到促進發酵進程的要求，所以學者們想通過接種乳酸菌促進青貯發酵。有很多學者的研究表明添加乳酸菌能通過迅速降低pH、減少干物質損失、抑制雜菌、抑制蛋白降解、提高青貯飼料有氧穩定性等提高青貯品質[40-42]。但也有研究報道，接種乳酸菌對青貯品質沒有顯著影響甚至會降低青貯品質[43-45]，因為更能適應環境的附著微生物可能更具競爭力而主導青貯過程[46]。Parvin等[36]指出接種乳酸菌對發酵產物的響應不同，所以接種乳酸菌的效果不但要看青貯產物還應看其對附著微生物群落影響進行評價。韓吉雨[27]在苜蓿和玉米青貯研究中得出的結論是原料表面附著的細菌貫穿整個發酵過程，影響著青貯品質，這些菌群也存在演替的過程，說明牧草本身附著的微生物對青貯品質影響很大。然而對青貯微生物群落及演替機理的研究還不清楚，需要了解更多信息來揭示這個復雜的發酵過程。

2.2 青貯微生物對青貯飼料有氧穩定性的影響

當青貯飼料拆封接觸空氣后，那些在青貯過程中被抑制而未死亡的好氧細菌、酵母及霉菌就會開始活躍進行生長繁殖，飼料的pH值和溫度開始升高，同時腐敗菌會利用乳酸及飼料營養物質，使得青貯飼料品質下降，進而影響家畜采食量及生產性能。因此，青貯飼料有氧穩定性也是青貯品質評價的重要指標之一，目前研究認為異型乳酸菌可產生一些揮發性脂肪酸，有利于提高青貯有氧穩定性，盡管會消耗更多的營養物質[47]。這些有利于提高飼料有氧穩定性的有機物主要是布氏乳桿菌的代謝產物，包括乙酸和1，2-丙二醇[48-49]。但也有研究表明，乳酸菌提高青貯飼料有氧穩定性的主要原因是其代謝產生的其他物質(表2)。由此可見，青貯飼料發酵過程中乳酸菌代謝產生的能夠提高青貯飼料有氧穩定性的物質多樣且與乳酸菌的種類有關。Krystynad等[17]研究顯示接種植物乳桿菌后有氧穩定性是對照的兩倍，接種布氏乳桿菌的有氧穩定性更高。但很多牧草附著微生物中異型乳酸菌在數量上也不足發揮主導作用，更多需要接種外源異型乳酸菌。郭旭生報道[50]指出異型發酵乳酸菌的添加量大于1.0×106cfu·g-1FM時，才能有效提高青貯飼料的有氧穩定性。然而馬迪等[51]的研究顯示，全株青貯玉米在青貯的14和56天時對照組和添加鼠李糖乳桿菌組的有氧穩定性無差異，青貯90天的玉米中添加鼠李糖乳桿菌和布氏乳桿菌組未能顯著提高有氧穩定性；Kleinschmit[52]研究了添加布氏乳桿菌和戊糖片球菌對玉米青貯有氧穩定性的影響，結果表明添加這兩種乳酸菌并不能顯著提高青貯有氧穩定性。所以牧草本身附著的微生物在青貯有氧穩定性方面有不可忽視的作用，不能為了提高品質及有氧穩定性盲目添加乳酸菌劑，還需要了解原料本身微生物附著情況及特點進行有針對性地接種菌劑。

表2 提高有氧穩定性的微生物種類及其代謝產物Table 2 Microorganism species and their metabolites for improving the aerobic stability of silage

3 小結

牧草附著微生物受很多因素影響，不同牧草種類以及同種牧草生長在不同生長環境，其表面附著的微生物種類和數量都存在很大差異，且在青貯過程中處于不斷演替變化中，不同程度影響著青貯品質。為更有效地提高青貯品質及有氧穩定性，學者更多的研究了接種外源乳酸菌對青貯的影響，接種菌在青貯體系中與本身附著的微生物互相競爭，共同完成青貯發酵過程，但牧草本身附著微生物的作用也不可忽視。了解牧草表面附著微生物特性是決定是否需要接種乳酸菌添加劑的重要依據。未來需要研究更多關于青貯微生物組學、代謝組學及青貯過程微生物活性等信息以掌握復雜的青貯過程，為調控優質的青貯飼料提供科學依據。