耐鎘根際促生菌的篩選及其對一年生黑麥草鎘吸收積累的影響

趙會會， 方志剛,2， 馬 睿， 婁來清， 蔡慶生*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 江蘇 南京210095；2. 喀什大學(xué)， 新疆 喀什 844000；3. 江蘇省泰興市國土資源局， 江蘇 泰興 225400)

過去數(shù)十年以來，由于工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，如礦產(chǎn)開發(fā)、污水灌溉、殺蟲劑濫用及化肥過度施用，導(dǎo)致農(nóng)田土壤及水源受到污染，其中重金屬污染成為全球面臨的環(huán)境問題之一[1]。2014年國家環(huán)境保護部和國土資源部的全國土壤污染調(diào)查報告顯示：全國土壤無機污染物超標(biāo)點位數(shù)占全部超標(biāo)點位的82.8%，其中鎘(Cd)被鑒定為一種主要的無機污染物，其位點超標(biāo)率達7.0%[2]。鎘在土壤中具有較強的移動性，易被作物吸收并在可食部位積累，這不僅影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)，還可通過食物鏈給人類健康帶來潛在威脅[3]。因此，農(nóng)田土壤鎘污染修復(fù)刻不容緩。目前，因治理重金屬污染土壤的物理、化學(xué)方法成本高且容易給環(huán)境帶來二次污染，不易大面積推廣，而成本低廉、環(huán)境友好植物修復(fù)技術(shù)受到廣泛關(guān)注[4-5]。然而，用于修復(fù)重金屬污染土壤的超積累植物因生長緩慢、生物量低，植物體難以回收利用等問題限制了其在實際中的應(yīng)用[5-6]。

植物根際促生細(xì)菌(PGPR)是生活在植物根際的一類能促進植物生長、防治植物病害、提高農(nóng)作物產(chǎn)量的有益細(xì)菌[7]。目前已經(jīng)報道的根際促生菌主要包括芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、假單胞桿菌屬等[8]。植物根際促生菌可通過分泌生長素、1-氨基-1-羧基環(huán)丙烷脫氨酶(ACCD)以及溶磷作用等促進植物的生長[9-10]，增加其生物量；還可以通過分泌有機酸、生物表面活性劑等提高土壤中重金屬的生物有效性來增加植物對重金屬的吸收量，從而提高植物修復(fù)效率[11-12]。近年來，應(yīng)用植物聯(lián)合微生物修復(fù)重金屬污染土壤取得重要理論成果，已經(jīng)證明對油菜(BrassicanapusL.)、玉米(ZeamaysL.)等接種PGPR均可提高其對重金屬脅迫的耐受性[13-15]，但田間應(yīng)用仍相對匱乏。

一年生黑麥草(LoliummultiflorumLam.) 是一種重要的牧草，具有適應(yīng)性廣、生長快和生物量大等特點[16]；有研究表明一年生黑麥草具有較高的生物乙醇轉(zhuǎn)化率，已經(jīng)被應(yīng)用到發(fā)酵等工業(yè)領(lǐng)域[17-18]。另有研究指出一年生黑麥草能富集鎘、銅等重金屬，可作為修復(fù)重金屬污染土壤的候選植物[19-20]。本研究試圖利用PGPR增強一年生黑麥草的耐鎘性和吸收積累鎘的能力，旨在為利用和修復(fù)重金屬污染土壤、避免與糧飼爭地、在重金屬污染土壤上開發(fā)能源植物提供可行的調(diào)控途徑。

1 材料與方法

1.1 供試材料

植物樣品采自云南個舊市雞街鎮(zhèn)(E 103°12′～103°16′、N 23°29′～23°33′)重金屬污染區(qū)。一年生黑麥草品種為'‘牧瑤’(IdyII)，由北京正道生態(tài)科技有限公司提供。

1.2 供試土壤

盆栽試驗土壤取自江蘇省南京市玄武區(qū)某公園土，室內(nèi)風(fēng)干過2 mm篩。土壤理化性質(zhì)為：pH 7.35±0.07，速效磷39.95±0.28 mg·kg-1，速效鉀13.84±18.87 mg·kg-1，總鎘0.76±0.01 mg·kg-1，總銅30.72±0.66 mg·kg-1，總鉻56.10±0.75 mg·kg-1。

1.3 耐鎘植物根際促生細(xì)菌的分離篩選與鑒定

1.3.1菌株分離 用小刷子將植物樣品根際土刷下來，稱取0.1 g土樣加到含有1 mL無菌水的滅菌離心管中。利用10倍稀釋法稀釋土壤菌懸液，分別從稀釋度為10-4，10-5，10-6的稀釋液中取0.1 mL菌懸液涂布在LB(Luria-Bertani)平板上，28℃培養(yǎng)72 h后，記錄細(xì)菌數(shù)量。從平板上隨機挑取不同表型的單菌落按常規(guī)方法純化后用滅菌牙簽依次挑至鎘濃度為0.1，1.0 和2.0 mM的LB平板上。選擇耐鎘能力較強、生長穩(wěn)定的菌株轉(zhuǎn)至斜面4℃條件下保藏。

1.3.2耐鎘菌株促生特性鑒定 菌株發(fā)酵液中吲哚乙酸(IAA)的測定參考Gordon[21]的方法，ACC脫氨酶能力測定參考夏娟娟[22]的方法，溶磷能力的定性測定參考黃靜[23]的方法。

1.3.3復(fù)篩 菌懸液的制備：將具有促生特性的耐鎘根際菌活化后接入液體LB培養(yǎng)基中，30℃、160 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h。3 000 r·min-1離心10 min后收集菌體，用無菌水洗滌后稀釋至OD600=1備用。

平皿促生試驗：用10% H2O2對黑麥草種子進行表面滅菌，浸泡15 min后用水洗凈。平皿中Cd2+濃度為100 uM，每個平皿隨機播入植物種子30顆，接種己制備好的菌懸液5 mL，對照用無菌水處理，每個處理3次重復(fù)。置于25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)8天后測量根長、芽長進行統(tǒng)計分析。

1.3.4菌株分類地位鑒定 菌株總DNA的提取方法參考楊清[24]，利用細(xì)菌16SrDNA通用引物(5′端引物序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；3′端引物序5'-TACCTTGTTACGACTT-3′) 進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物純化后進行TA克隆，將含有目的基因的質(zhì)粒載體導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，然后再涂布于含有氨芐青霉素的選擇性平板上，37℃培養(yǎng)過夜，得到轉(zhuǎn)化菌落。挑選白色菌落(含重組質(zhì)粒)在無選擇抗性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并通過擴增進行重組子鑒定，選取電泳結(jié)果含有目的基因的大腸桿菌菌液，由南京金斯瑞生物科技有限公司測序，測序結(jié)果在GenBank中與相關(guān)序列進行同源性比對。

1.4 盆栽試驗

1.4.1試驗設(shè)計 盆栽試驗在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓實驗基地日光溫室內(nèi)進行，土樣風(fēng)干后過1 cm篩。重金屬鎘以CdCl2·2.5H2O水溶液加入土中混合均勻，土壤鎘濃度參考Guo[25]關(guān)于黑麥草盆栽鎘處理的試驗條件，并結(jié)合本課題組前期的預(yù)試驗結(jié)果，使盆缽中土壤鎘終濃度為20±0.33 mg·kg-1，采用大小為19 cm×20 cm的塑料盆，每盆裝土約4 kg，自然平衡2周。以無菌水浸種為對照，以篩選后的菌株(A02、Oj06和Ps08)菌懸液為處理，浸種約2 h。設(shè)置3次重復(fù)。每盆播種30粒種子，萌發(fā)10天后間苗，每盆留生長一致的苗10株。分別在播種10天、30天后在植物根系周圍接入相應(yīng)的供試菌株的菌懸液(菌懸液制備同上)，每盆15 mL，對照接入等體積的無菌水。

1.4.2樣品的預(yù)處理及測定 60天后，記錄各處理黑麥草分蘗數(shù)、株高。將黑麥草沿土壤表面剪下分成地下和地上兩部分，用水沖洗干凈，測定各處理地上、根部的鮮重；后將黑麥草置于105℃烘箱內(nèi)殺青30 min，60℃下烘干至恒重，用于測定植物干重。同時收集各盆中根際土壤，風(fēng)干后按李強和劉銘[26-27]的方法測定土壤pH和有效態(tài)鎘含量。植物經(jīng)微波消解后用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀測鎘離子濃度。葉片丙二醛(MDA)含量測定參考李合生[28]的方法。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2007整理數(shù)據(jù)，SPSS 20.0進行方差分析，采用Duncan法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鎘菌株的篩選及促生特性的鑒定

從不同植物根際土中共分離出136株細(xì)菌。在鎘濃度為2.0 mM的初篩培養(yǎng)基上生長良好的菌株共32株，其中具有產(chǎn)IAA能力的菌株共6株，產(chǎn)ACC 脫氨酶能力的菌株共7株，具有溶磷能力的菌株共8株。經(jīng)過平皿促生試驗的復(fù)篩，選取A02，Oj06，Ps08做進一步研究。3種菌株均具有溶磷能力，此外A02和Ps08還具有分泌生長素的能力，Oj06具有產(chǎn)ACC 脫氨酶的能力(表1)。

表1 耐鎘菌株促生特性Table 1 Characteristics of cadmium-tolerant strains

2.2 根際菌A02，Oj06，Ps08的形態(tài)學(xué)特征及16SrDNA序列分析

測序結(jié)果通過BLAST軟件與GenBank中其他菌株的16S rRNA基因序列進行比對，結(jié)合菌株的菌落和菌體特征將菌株鑒定到屬。 A02為熒光假單胞桿菌屬(Pseudomonassp.)，Oj06和Ps08為腸桿菌屬(Enterobactersp.)(表2)。

表2 菌株16S rRNA基因序列分析結(jié)果Table 2 The identification of the tested strains based on 16S rRNA gene analysis

2.3 耐鎘根際促生菌對一年生黑麥草植株生長以及葉片中MDA含量的影響

不接菌(對照)植株的生長受到明顯抑制，接種耐鎘促生菌株處理的植株分蘗數(shù)和株高均顯著(P<0.05)增加。 接菌A02，Oj06，Ps08的植株平均分蘗數(shù)分別比對照高31.67%，28.33%，26.65%，平均株高分別比對照高出18.44%，19.20%，18.62%(圖1)。表明耐鎘促生菌A02，Oj06，Ps08能夠有效促進一年生黑麥草在鎘污染土地中的生長。

圖1 鎘脅迫下不同菌株處理對一年生黑麥草分蘗數(shù)和株高的影響
Fig.1 Effects of strains on tiller number and shoot height of Lolium multiflorum Lam. under Cd stress
注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同
Note: Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level. The same below

與對照相比，不同菌株處理下一年生黑麥草地上部以及根干重均有所提高。接菌A02，Oj06，Ps08處理的黑麥草地上部干重與對照相比，分別增加了45.32%，38.63%，49.42%，差異均達顯著(P<0.05)水平(圖2)。結(jié)果表明：耐鎘促生菌株適度鎘污染條件下對一年生黑麥草有一定的促生作用，能夠在一定程度上緩解鎘脅迫對植物生長的抑制。

圖2 鎘脅迫下不同菌株處理對一年生黑麥草干重的影響
Fig.2 Effects of strains on dry weight of Lolium multiflorum Lam. under Cd stress

鎘脅迫下及接種耐鎘根際促生菌后，一年生黑麥草葉片中丙二醛含量變化如圖3所示。接種A02，Oj06，Ps08后，一年生黑麥草葉片中MDA含量分別比對照降低44.43%，41.28%，38.61%，差異達到顯著水平 (P<0.05)。由此可見，3株菌均能降低鎘脅迫下黑麥草葉片中的膜脂過氧化產(chǎn)物，從而可能緩解鎘對一年生黑麥草產(chǎn)生的毒害。

2.4 耐鎘根際促生菌對一年生黑麥草鎘吸收積累的影響

如表3所示，接種A02，Oj06和Ps08后，一年生黑麥草地上部和根系內(nèi)鎘濃度與對照相比無顯著變化。然而，接種不同耐鎘根際促生菌后，一年生黑麥草鎘吸收總量變化較為明顯。接種A02，Oj06，Ps08后，黑麥草地上部鎘吸收總量分別比對照增加了48.78%，33.98%和50.01%，差異達顯著水平 (P<0.05)；與對照相比，接種不同根際菌，黑麥草根系鎘積累總量亦有所增加，其中接種Oj06的處理增加了57.64%，差異顯著(P<0.05)。接種3株菌后，根際土壤中有效態(tài)鎘含量分別增加了19.14%，13.39%，7.48%，其中接種A02的處理達到顯著差異(P<0.05)。與對照相比，接種A02，Oj06，Ps08后，根際土壤pH分別下降3.52%，2.80%，1.76%，其中接種A02，Oj06的處理達到顯著差異(P<0.05)。

圖3 鎘脅迫下不同菌株處理對一年生黑麥草葉片MDA含量影響
Fig.3 Effects of strains on MDA content of Lolium multiflorum Lam. under Cd stress

表3一年生黑麥草鎘的吸收積累情況以及根際土壤有效態(tài)鎘含量與pH
Table 3 Influence of strains on Cd concentration and total Cd accumulation ofLoliummultiflorumLam. ,pH and extractable Cd concentration in the rhizosphere

不同處理Treatments鎘含量Cd concentration/μg·g-1單株鎘吸收總量Cd accumulation/μg·株-1地部 Shoot根系 Root地上部 Shoot根系 Root土壤有效態(tài)鎘含量Extractable Cd concentration/mg·kg-1土壤pHSoil pHCK17.58±1.04a176.34±20.56a4.27±0.29b21.26±3.67b12.58±0.56b7.39±0.06aA0218.63±3.26a193.37±5.27a6.36±0.47a31.96±3.54ab14.98±0.89a7.13±0.02bOj0617.04±0.95a192.28±5.59a5.73±0.13a33.51±2.40a14.26±0.32ab7.18±0.06bPs0817.80±1.25a171.03±3.86a6.41±0.31a29.16±2.96ab13.51±0.31ab7.26±0.02ab

注：同列不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)

Note:Different lowercase letters indicate significant difference between treatments at the 0.05 level

3 討論

近年來，有關(guān)土壤重金屬污染修復(fù)的研究不斷深入，利用微生物-植物聯(lián)合修復(fù)鎘污染土壤成為一種新的技術(shù)途徑。大量研究表明，PGPR可顯著促進植物生長，提高植物對重金屬的抗性，從重金屬污染土壤中分離到的PGPR常表現(xiàn)出較強的重金屬耐性[29-30]。

本研究鑒定了耐鎘根際促生菌，發(fā)現(xiàn)A02和Ps08具有較強的IAA分泌能力；Oj06能在以ACC為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長，說明其具有ACC脫氨酶活性；3株菌均具有溶磷能力，這表明他們均具備潛在的促生能力。

Asghar等[31]將產(chǎn)IAA的促生菌接種到油菜(BrassicanapusL.)后，植株分枝數(shù)量和株高能夠顯著增加，這與本研究中一年生黑麥草分蘗數(shù)、株高顯著增加(圖1)的結(jié)果相似，其原因可能是PGPR能夠產(chǎn)生IAA，促進植物根系的生長發(fā)育，可能增加土壤中的水分和養(yǎng)分的吸收，從而促進植物的生長以提高植物的抗逆性[32]。從圖2可以看出，3株促生菌能顯著提高黑麥草地上部干重，這一結(jié)論與Jiang等[33]研究根瘤菌對番茄(SolanumlycopersicumL.)和玉米的結(jié)果較為相似。在逆境條件下，作為乙烯合成的前體會產(chǎn)生大量ACC，植物根際促生菌能通過合成ACCD將ACC分解成氨和α-丁酮酸，抑制植物體內(nèi)乙烯的大量生成，同時為植物提供氮源從而增加植物的生物量[9]。一年生黑麥草生物量的增加還可能與3株促生菌分泌IAA，ACC脫氨酶以及溶磷能力有關(guān)[32,34]。此外，一些植物促生菌能分泌有機酸，降低植物根圍土壤的pH值，將不溶性的磷轉(zhuǎn)變成可溶性的磷，使磷有效地溶解與吸收從而促進植物生物量的增加[35]。

植物在逆境條件下，細(xì)胞質(zhì)膜中不飽和脂肪酸會發(fā)生過氧化反應(yīng)而產(chǎn)生丙二醛，是反映細(xì)胞膜脂過氧化強弱的重要指標(biāo)[36]。本研究中，促生菌處理下一年生黑麥草葉片中MDA含量顯著下降，表明接菌后降低了鎘對葉片細(xì)胞膜的損傷程度，從而減輕了黑麥草葉片中膜脂過氧化反應(yīng)，這一結(jié)論與田野等[37]研究鎘污染土壤接種叢枝菌根真菌對黑麥草葉片中MDA含量影響的結(jié)果一致。

分析一年生黑麥草植株內(nèi)鎘含量，無論是地上部分還是根系，接菌后鎘含量有所提升但差異不顯著，這與劉莉華[38]等的報道相同，可能是由于接種促生菌后能促進植物的生長，提高植株的生物量，體內(nèi)吸收的鎘由此表現(xiàn)出一定的“稀釋”作用。本研究中，接種促生菌對一年生黑麥草鎘吸收的影響更多的體現(xiàn)在鎘積累方面。各接菌處理相比于對照鎘積累總量均顯著增加，這是由于植物根際促生菌增加了一年生黑麥草的生物量，從而也使其鎘積累總量增加。這一結(jié)論與Guo等[25]的結(jié)果一致。接菌處理后土壤中有效態(tài)鎘含量有所增加，而土壤pH則顯著下降，可能是3株菌均具有溶磷作用，能夠通過分泌有機酸溶解土壤中的磷酸鹽使之成為植物可吸收利用的形態(tài)，這為土壤中重金屬的活化提供了有利條件，從而促進植物對重金屬的吸收[11]。

4 結(jié)論

從不同植物根際土壤中篩選出3株具有較強耐鎘性的根際促生菌，接菌后一年生黑麥草的分蘗數(shù)、株高、生物量均顯著高于對照，葉片中丙二醛含量顯著降低。就植株體內(nèi)鎘含量而言，接種菌株后地上部和根系的鎘含量與對照相比無顯著差異， 但其總的吸收量卻顯著增加，這預(yù)示在鎘污染土地上種植一年生黑麥草若接種A02，Oj06，Ps08，通過多次收獲黑麥草地上部分，可有效減少土壤中鎘含量，說明PGPR具有比較理想的應(yīng)用前景。此外, 本試驗采用的是溫室盆栽，田間根際微生物受環(huán)境因素(如溫度、肥料、水分、土壤理化性質(zhì)等)的影響較大，耐鎘根際促生菌在田間鎘污染環(huán)境下對一年生黑麥草的促生及積累效果還有待進一步研究。