應用正交試驗法優化‘新農1號’狗牙根再生體系

劉 莉， 李培英

(新疆農業大學草業與環境科學學院 新疆草地資源與生態自治區重點實驗室， 新疆 烏魯木齊 830052)

狗牙根(Cynodondactylon(L.) Pers.)，又名拌根草、鐵線草、爬地草、百慕大草(Bermudagrass)，系禾本科狗牙根屬C4型多年生草本植物[1]。狗牙根亦是我國分布廣泛、栽培應用較多、最重要的暖季型草坪草之一[2-4]。目前，國產狗牙根品種匱乏，國內栽培的狗牙根主要依賴進口，存在品種較單一、抗逆性差、容易退化等問題，極大地限制了狗牙根在草坪中的應用，因此國家提倡開發本土狗牙根資源，選育優質、高抗的狗牙根新品種，滿足市場需求[5]。

狗牙根育種主要手段包括常規育種及生物技術育種兩種方式，生物技術育種的瓶頸在于狗牙根胚性愈傷組織得率較低、且難以分化。狗牙根組培研究開展較早，上世紀80年代Ahn以普通狗牙根未成熟花序為外植體誘導出了胚性愈傷組織，并獲得了再生植株[6]。此后狗牙根組培多以未成熟胚及花序為外植體開展研究，但其取材困難且易受季節限制[7-9]。近些年來，以匍匐莖為外植體的組織培養也獲得了再生植株，其中，盧少云以匍匐莖為外植體建立了再生體系，并在再生植株中發現了狗牙根‘Tifeagle’的矮化變異體新株系TV4。匍匐莖取材簡單，但仍存在消毒困難，易受污染的問題[10]。相對而言，成熟穎果取材方便、消毒簡單，是組織培養建立再生體系較好的材料。國內方面，胡張華在2003年首次以成熟胚為外植體進行組織培養并獲得再生植株[11]，此后何陽鵬、姜茜、陳瓊等都以成熟種子為材料進行了狗牙根組培研究[12-14]。但已有研究大多采用單因素試驗方法，可能得不到最優組合，并且不能確定出各個階段起關鍵作用的因素[15-16]。

正交試驗設計是一種高效、快速、經濟的試驗方法[15,17]，不但可以進一步優化培養基，還可以確定建立再生體系中各階段的主因素。在草坪草上，陳繼琴用正交試驗法對愈傷組織的誘導和分化培養基進行了優化[18]；劉君通過多因子正交試驗篩選出草地早熟禾(PoapratensisL.)的最適誘導培養基，證明了用正交設計篩選愈傷誘導培養基是一種較好、可靠的方法[19]。因此，為了進一步優化‘新農1號’狗牙根再生體系，本試驗在陳瓊[14]的單因素法建立的再生體系的基礎上，采用了正交設計方法，探討生長調節劑、外源添加物等因素對‘新農1號’狗牙根成熟種子愈傷誘導和分化的影響，為狗牙根生物技術育種工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究中，試驗材料為2012采于新疆農業大學三坪農場的‘新農1號’狗牙根(Cynodondactylon‘Xinnong No.1’)成熟種子。

1.2 試驗方法

1.2.1種子表面消毒及愈傷組織誘導 挑選籽粒飽滿的‘新農1號’狗牙根種子，脫殼，在清水中浸泡24 h，70%酒精處理2 min后，置于20%次氯酸鈉中浸泡20 min，無菌水沖洗多次。將滅菌后的狗牙根種子進行橫切，挑選有胚部分，以添加0.8%瓊脂和3%蔗糖的MS培養基為基礎培養基，脯氨酸(Proline， Pro 或P)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)、6-芐氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine， 6-BA)按3因素3水平(L9)的正交設計進行添加(表1)。

表1 ‘新農1號’狗牙根誘導培養基試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of induction medium of Cynodon dactylon ‘Xinnong No.1’

每種培養基30瓶，每瓶接入20個外植體， 25±1.0℃條件下進行黑暗培養，誘導25 d后，觀察愈傷組織狀態，統計誘導愈傷數，計算出愈率。

1.2.2愈傷組織的繼代培養 挑取淡黃色顆粒狀的愈傷組織切割成3 mm左右的愈傷團塊進行繼代培養，以添加0.8%瓊脂和3%蔗糖的MS培養基為基礎培養基，脫落酸(abscisic acid， ABA)、2,4-D、6-BA按3因素3水平(L9)的正交設計進行添加(表2)。

表2 ‘新農1號’狗牙根繼代培養基試驗因素及水平Table 2 Factors and levels of subculture medium Cynodon dactylon ‘Xinnong No.1’

每個處理組合接種30瓶，每瓶6塊愈傷組織，溫度25±1.0℃、光照強度36 mmol·m-2·s- 1， 14 h光照與10 h黑暗培養。30 d后統計胚性愈傷數、胚性愈傷的增殖數(直徑大于5 mm的胚性愈傷組織塊數)、褐化數。計算胚性愈傷誘導率、愈傷增殖率以及褐化率。

1.2.3愈傷組織的分化培養 將胚性愈傷組織均勻地切割成3 mm左右團塊，轉至分化培養基中進行培養(表3)。

表3 ‘新農1號’狗牙根胚性愈傷組織分化培養基Table 3 Embryogenic callus differentiation medium of Cynodon dactylon ‘Xinnong No.1’

每個處理接種30瓶，每瓶6塊胚性愈傷。分化30 d后，統計綠點數、再生小植株數(以出現3個芽為一個再生苗)、再生愈傷組織塊數，計算綠點率、再生愈傷組織頻率、小植株形成強度(小植株形成強度=小植株數/接種的愈傷組織數)。

1.2.4再生苗的生根與移栽 將分化培養的再生苗轉移到添加8 g·L-1瓊脂和15 g·L-1蔗糖的生根培養基上進行生根培養，2周后打開蓋子，洗去培養基，室內煉苗2 d，再移栽到含營養土的花盆中。

1.3 數據分析

試驗以正交設計作為分析方法，記錄3個重復的平均數作為結果，對結果的極差分析及單因素方差分析采用Excel、Spss等軟件進行。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織的誘導

接入外植體培養4 d后，一些白色透明、無固定結構、松軟的愈傷組織逐漸產生；10 d出現出愈高峰，12 d左右開始膨大，15 d愈傷長至3～5 mm，誘導25 d后，愈傷已長至5～11 mm。在愈傷誘導階段形成的愈傷主要有4種類型：A型為半透明水漬狀愈傷(圖1-A)；B型為半透明水漬狀、帶有少數淡黃色顆粒的愈傷(圖1-B)；C型為淡黃色顆粒較多的愈傷(圖1-C)；D型為白色疏松狀的愈傷(圖1-D)。其中C型為胚性愈傷，B型可經繼代改造為胚性愈傷，而A型和D型為不可再生的非胚性愈傷。不同培養基上誘導的愈傷大小和狀態主要受2,4-D濃度的影響。2,4-D濃度為1.0 mg·L-1水平時，愈傷生長速度較快，愈傷直徑可達8～11 mm，但愈傷質量較差，形成的愈傷組織少數為B型、大多為A型和D型；當2,4-D濃度為2.0 mg·L-1時，愈傷生長速度適中，愈傷直徑可達4～8 mm，愈傷質量較好，主要為B型和C型，但也有一定數量的D型愈傷；當2,4-D濃度為4.0 mg·L-1時，愈傷生長較慢，直徑為3～5 mm，愈傷質量也較好，大多為B型和C型，也有一些A型愈傷。

圖1 ‘新農1號’狗牙根愈傷組織類型圖
Fig.1 Callus induction type of Cynodon dactylon ‘Xinnong No.1’
注：圖1-A：半透明水漬狀愈傷組織；圖1-B：少數淡黃色顆粒的愈傷組織；圖1-C：淡黃色顆粒較多的愈傷組織；圖1-D：白色疏松狀愈傷組織
Note：Fig.1-A: translucent water-soaked callus; Fig. 1-B: a few light yellow particles callus;
Fig. 1-C: pale yellow particles more callus. Fig. 1-D: white loose callus

表4‘新農1號’狗牙根愈傷組織誘導正交試驗
Table 4 The orthogonal test result of callus induction ofCynodondactylon‘Xinnong No.1’

處理Treatment因素及水平Factors and levels/mg·L-1出愈率Callus induction rate/%2,4-D6-BA脯氨酸123愈傷狀態Callus type11.00.01061.561.559.5B,D21.00.0520054.053.556.0A,B,D31.00.1040057.559.058.0A,B,D42.00.0120069.570.568.0A,B,C52.00.0540064.562.565.5B,C,D62.00.10056.057.558.5B,C,D74.00.0140051.053.053.0B,C84.00.05053.556.054.0A,B,C94.00.1020053.552.554.0A,B,CX157.83bB60.84aA57.55bAX263.61aA57.72bB59.28aAX353.61cC56.50bB58.22abAR10.004.341.73

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；X1、X2、X3分別代表3個不同水平的出愈率均值，R代表3個水平間的出愈率極差,下同

Note：Different lowercase letters in the same column indicate significant differences at the 0.05 level, and different capital letters indicate significant differences at the 0.01 level;X1, X2 and X3 represent average callus induction rate of three different levels, and R represents the maximum difference between the 3 levels; The same below

由表4可知，對出愈率而言，不同2,4-D和6-BA濃度間均存在極顯著差異(P<0.01)，而不同脯氨酸濃度之間存在顯著差異(P<0.05)。2.0 mg·L-12,4-D水平下的出愈率為63.61%，極顯著高于1.0 mg·L-1與4.0 mg·L-1水平 ；0.01 mg·L-16-BA水平下的出愈率為60.84%，極顯著高于0.05與0.1 mg·L-1水平；200 mg·L-1脯氨酸水平下的出愈率為59.28%，顯著高于不添加脯氨酸。由極差分析可知，各因素對出愈率的作用效果不同，其中 2,4-D的影響最大，其次為6-BA，脯氨酸。水平優選后即可得出‘新農1號’狗牙根適宜的誘導培養基為：2,4-D(2.0 mg·L-1)+6-BA(0.01 mg·L-1)+脯氨酸(200 mg·L-1)的MS培養基。

2.2 愈傷組織的繼代

轉入繼代培養基中2～5 d后，愈傷變得稀軟，形成E型愈傷(圖2-A)；大多愈傷之后逐漸干燥，一些形成緊實致密的F型可再生愈傷(圖2-B)，少數變成褐化的G型愈傷(圖2-C)，還有一部分出現生根現象的H型愈傷(圖2-D)，另外一些逐漸變得水漬化，需轉入新的繼代培養基。

圖2 ‘新農1號’狗牙根愈傷組織類型圖
Fig.2 Callus subculture type of Cynodon dactylon ‘Xinnong No.1’
注：圖2-A：稀軟，粘稠狀的愈傷組織；圖2-B：呈淡黃色顆粒狀，質地緊密的愈傷組織； 圖2-C：褐化的愈傷組織； 圖2-D：愈傷呈顆粒狀，有生根現象
Note：Fig.2-A: Callus was soft, sticky；2-B: Callus was pale yellow particles, close texture；2-C: Callus browning；2-D: Callus granular, a root phenomenon.

由表5可知，對胚性愈傷得率而言，不同6-BA、ABA濃度之間存在極顯著差異(P<0.01)， 2,4-D濃度間存在顯著差異(P<0.05)。其中2,4-D，6-BA，ABA的最優濃度分別為2.0，0.20和2.0 mg·L-1，其胚性愈傷誘導率分別為52.96%，55.56%和56.85%。由極差分析可知，各因素對胚性愈傷誘導率的作用效果不同，其中2,4-D的影響最大，其次為ABA，6-BA。水平優選后可得在‘新農1號’狗牙根繼代試驗中，胚性愈傷得率較高的培養基為：2,4-D(2.0 mg·L-1)+6-BA(0.20 mg·L-1)+ABA(2.0 mg·L-1)的MS培養基。

對愈傷增殖率而言(表5)，不同6-BA濃度之間存在極顯著差異(P<0.01)，不同2,4-D、ABA濃度之間存在顯著差異(P<0.05)。2.0 mg·L-12,4-D水平下的愈傷增殖率達44.26%，顯著高于0.5 mg·L-1和1.0 mg·L-1水平；0.20 mg·L-16-BA水平下的愈傷增殖率達64.82%，極顯著高于0.05和0.10 mg·L-1；1.0 mg·L-1和2.0 mg·L-1ABA水平下的愈傷增殖率分別為47.03%和45.37%，都顯著高于3.0 mg·L-1水平，但這兩個水平間沒有顯著差異。由極差分析可知，各因素對愈傷增殖的作用效果不同，其中6-BA的影響效果最大，其次為ABA、2,4-D。水平優選后，愈傷增殖率較高的培養基為：2,4-D (2.0 mg·L-1) +6-BA (0.20 mg·L-1) + ABA (1.0～2.0 mg·L-1)的MS培養基。

對褐化率而言(表5)， 2,4-D、6-BA濃度間存在極顯著(P<0.01)差異，但ABA濃度間不存在顯著差異。2.0 mg·L-12,4-D的褐化率僅為9.82%，顯著低于0.5和1.0 mg·L-1水平；0.20 mg·L-16-BA水平下的褐化率為12.04%，極顯著低于0.10 mg·L-1；由極差分析可知，對褐化率而言，2,4-D的影響最大，其次為6-BA和ABA。水平優選后即可得褐化率較低的培養基為：2,4-D(2.0 mg·L-1)+ 6-BA(0.20 mg·L-1)+ ABA(1.0～3.0 mg·L-1)的MS培養基。

綜合分析繼代培養中胚性愈傷率、愈傷增殖率和褐化率3個指標，可確定‘新農1號’狗牙根繼代培養的優化培養基為：2,4-D(2.0 mg·L-1)+6-BA(0.20 mg·L-1)+ABA(2.0 mg·L-1)。此條件下的胚性愈傷率達71.67%，愈傷增殖率為61.67%，褐化率5.56%。

2.3 愈傷組織的分化

繼代改造后的胚性愈傷組織可轉移到不同的分化培養基上進行愈傷的再生培養。愈傷分化過程中，4種處理的綠點率、再生愈傷組織頻率、小植株再生強度統計數據及方差分析結果如表6所示。

表6 4種培養基對‘新農1號’狗牙根愈傷分化的影響Table 6 Analysis of four medium’s effect on callus differentiation of Cynodon dactylon ‘Xinnong No.1’

由表6可知，在‘新農1號’狗牙根分化階段，MS+1.0 mg·L-16-BA分化培養基上的綠點率最高為86.67%，顯著高于1/2MS+1.0 mg·L-16-BA分化培養基(P<0.05)，而極顯著高于MS分化培養基和1/2MS分化培養基(P<0.01)，且未添加6-BA的MS培養基和1/2MS培養在后期的分化過程中出現大量的毛狀根，愈傷逐漸褐化，直至死亡，因此最終小植株形成強度和再生愈傷組織頻率較低；接種在MS+1.0 mg·L-16-BA分化培養基上的胚型愈傷的小植株形成強度和再生愈傷頻率都極顯著高于1/2MS+1.0 mg·L-16-BA分化培養基(P<0.01)，其中再生愈傷頻率最高為24.45%，小植株形成強度最高為49.44%。綜合分析認為，‘新農1號’狗牙根的優化分化培養基為添加1.0 mg·L-16-BA的MS培養基。

2.4 再生苗的生根與移栽

轉入分化培養基大約10～15 d，部分分化培養基上逐漸出現綠點(圖3-a)，20～25 d再生出叢生狀的再生綠色植株(圖3-b)，還有一些分化培養基上的愈傷長出毛狀根并逐漸褐化直至死亡(圖3-c)。將分化的再生綠色植株轉移至無植物生長調節劑的1/2MS培養基上進行生根培養，15 d后移栽到含有砂質土壤的花盆中(圖3-d)，移栽成活率可達到100%。

圖3 ‘新農1號’狗牙根的分化與再生
Fig.3 Regeneration and transplantation of Cynodon dactylon ‘Xinnong No.1’

3 討論

植物生長調節劑、各種外源添加物以及培養基種類都會對愈傷組織的誘導、分化及小植株的再生產生影響，植物生長調節劑是其中一個最關鍵的因素，調節激素種類和水平，可以很大程度上優化組培再生體系。但是在具體試驗中，激素種類以及濃度組合錯綜復雜，單因素試驗往往會錯過最佳組合。實踐證明，采用正交設計對‘新農1號’狗牙根進行愈傷組織誘導配方的優化，是一個切實可行的方法，能夠發揮正交設計的優勢：即用最少的處理得到最佳的組合；另一方面可以確定組織培養各個階段的關鍵因素[20]。國內已有將正交設計法應用于草坪草組織培養，揭示愈傷誘導階段各因素的作用效果的相對大小，并篩選出合理培養條件的研究報道[18-19]。本研究首次將正交法應用于草坪草愈傷組織的繼代培養中，具有重要的實踐意義。

提高愈傷誘導率是優化‘新農1號’狗牙根再生體系的第一步，沒有高頻的誘導率，就無法得到大量的、高品質的愈傷組織，其隨后分化得到的再生植株也就少。從目前狗牙根組織培養相關研究文獻來看，比較一致的觀點是2,4-D是愈傷誘導階段最重要的激素；本試驗證實，愈傷誘導率隨2,4-D濃度升高呈先增后降的趨勢，因此添加2.0 mg·L-12,4-D是愈傷誘導的最適濃度，這與陳瓊以成熟穎果為外植體研究結果一致[14]；但據Chaudhury和Qu[21]的研究來看，以未成熟花序為外植體時低濃度2,4-D更利于愈傷組織的誘導，一般適宜濃度為1.0 mg·L-1,這些都可以證實，不同外植體對2,4-D的敏感程度有所不同。而6-BA對愈傷誘導的作用比2,4-D弱，一般與其他生長素配合使用，可以提高愈傷組織的質量和誘導率[22]。低濃度的6-BA(0.01 mg·L-1)有利于形成淡黃的、緊湊的、有顆粒狀突起的胚性愈傷，但濃度過高反而會抑制愈傷誘導、影響愈傷質量[23]。本研究表明，脯氨酸對愈傷組織的誘導有促進作用，錢海豐等研究發現脯氨酸對高羊茅(FestucaelataKeng)愈傷誘導沒有效果,而Shetty曾報道脯氨酸能促進紅頂草(AgrostisalbaL.)愈傷的誘導[24]；Shaoyun Lu的研究發現脯氨酸對狗牙根的愈傷誘導具有促進作用[25]，與本試驗結論一致。說明脯氨酸在不同草坪草的愈傷誘導中效果可能不一致，這可能由不同草坪草中內源脯氨酸含量的不同引起的。

繼代培養基中降低生長素與細胞分裂素的比例，對胚性愈傷組織的誘導和植株再生起重要作用[26]，與本試驗的結論一致。本研究結果表明，適當提高6-BA的濃度可顯著提高胚性愈傷的誘導和增殖率，減少褐化。原因可能是6-BA作為外源激素，可改善細胞內源生長素和細胞分裂素的比例，調節細胞生理生化狀態，有利于胚性愈傷組織的發生，從而增加分化頻率[27]。本研究表明，高濃度的ABA可促進胚性愈傷組織的生長，這可能是因為早期胚胎發育要求高滲條件，而增加ABA含量有利于提高培養基的滲透勢[28]。

狗牙根成熟穎果誘導的愈傷組織存在根先于莖葉發生的現象，而長出毛狀根后就很難發育成再生植株了，愈傷很快褐化、變黑。一些作物器官發生中也常存在這種現象[29-30]。胚性愈傷組織只有轉入到生長素含量很低或完全沒有生長素的培養基上，才能發育為成熟的體細胞胚并形成植株，而6-BA可減少根的發生，促進愈傷向再生植株的方向發展[30-31]。因此本試驗中分化培養基未添加2,4-D，而添加了一定量的6-BA。試驗表明，轉入繼代后的胚性愈傷組織轉入到不含激素的培養基以及含有6-BA的培養基中都可分化出再生植株，但是添加6-BA的培養基分化的小植株數量顯著高于未添加6-BA的培養基。這可能是在愈傷誘導和繼代過程中都添加了相對較高濃度的2,4-D，2,4-D的積累使得內源生長素的濃度升高，而生長素與細胞分裂素比例可能控制著根的發育或者莖的發育。

4 結論

本研究對‘新農1號’狗牙根進行再生體系的優化試驗，得出‘新農1號’狗牙根優化的誘導培養基為添加2,4-D(2.0 mg·L-1)+6-BA(0.01 mg·L-1)+脯氨酸(200 mg·L-1)的MS培養基，此時愈傷誘導率達69.5%；愈傷繼代的優化培養基為2,4-D(2.0 mg·L-1)+6-BA(0.20 mg·L-1)+ABA(2.0 mg·L-1)的MS培養基，其胚性愈傷率和愈傷增殖率分別可達71.67%和61.67%，且褐化率較低；優化的分化培養基為MS+1.0 mg·L-16-BA，小植株形成強度可達49.44%。

本研究優化了‘新農1號’狗牙根的再生體系。誘導培養基下的愈傷誘導率差別不大；優化的繼代培養基下的胚性愈傷率提高了21.5%，愈傷增殖率提高了20.4%，且褐化率下降了10%；優化的分化培養基下小植株強度提高了32.7%。