三種化學物質誘導白三葉草葉斑病抗性的研究

梁巧蘭， 魏列新， 張 娜， 徐秉良

(甘肅農業大學植物保護學院 甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室， 甘肅 蘭州 730070)

白三葉草(Trifoliumrepens) 是一種多年生草本植物，是世界上最重要的牧草之一[1]。近年來三葉草在綠肥作物以及園林設計中的應用較多，種植面積不斷擴大。但是葉斑病發生日趨嚴重，已成為限制三葉草栽培的主要病害之一。發病時葉片上產生褐色邊緣的白色小圓斑或不規則型病斑，葉片正、反面可見黑色分生孢子，以背面居多，發病嚴重時葉片干枯死亡，嚴重影響白三葉草的產量和品質，同時失去觀賞價值。目前國內關于白三葉草葉斑病的研究較少，僅李晶[2]、羅祿怡[3]、商鴻生[4,5]、周曉燕[6]、李征[7]等人進行了相關報道。長期以來生產上主要采用化學藥劑進行防治，而化學藥劑防治存在農藥殘留、污染等問題，使其觀賞價值降低，同時影響人類健康。而誘導抗病性是指植物在各種誘導因子的作用下，使植物體內與抗病有關的基因得到表達，從而產生抗病性，即系統獲得抗性(systemic acquired resistance, SAR)[8-10]。目前，植物誘導抗病性為植物病害的防治開辟了一條新途徑。利用化學誘抗劑水楊酸、納米硅、草酸鉀、草酸銨誘導植物抗病性已有報道[11-14]。但是，有關蘭州市白三葉草葉斑病病原鑒定及利用誘導抗病性防治白三葉草葉斑病的研究國內外尚未見報道。為此，本試驗對引起蘭州市白三葉草葉斑病的病原菌進行了鑒定，并選用水楊酸、硅酸鉀、硅酸鈉3種化學物質對白三葉草葉斑病誘導抗性進行了研究，旨在確定這3種化學物質對白三葉草葉斑病抗病性的誘導效果，為白三葉草生長期病害的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

白三葉草葉斑病病樣采自甘肅農業大學校園、北濱河路、植物園、五泉山等地三葉草綠化帶；供試白三葉草種植于實驗室內(品種為普通白三葉)。

供試化學物質 水楊酸(SA)、硅酸鈉(Na2SiO3)、硅酸鉀(K2SiO3)購自天津市光復科技發展有限公司，均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1病原菌分離純化及鑒定

1.2.1.1 病原菌的分離純化 將采集的病樣清洗干凈后，于超凈工作臺上切取葉片病健交界組織，經0.1%升汞表面消毒10 S，用滅菌水沖洗3～5次后，接種于PDA平板上，置于28℃溫箱中培養觀察，當邊緣長出菌絲時，挑去少量菌絲重新接在新制PDA平板上，直至每一皿的菌落形態一致并產孢后，采用單孢分離法[15]對分離菌進行純化。

1.2.1.2 分離菌致病性測定 按照柯赫氏法則進行。將分離物配制成孢子懸浮液接種到白三葉草葉片上，在28℃恒溫箱中保濕培養，3 d后觀察發病情況。待發病后再次分離，并將分離物與1.2.1.1.中分離純化得到的進行比較，然后保存備用。

1.2.1.3 病原菌的鑒定 顯微鏡下觀察病原菌菌絲及孢子形態，并結合真菌鑒定手冊進行鑒定。

1.2.23種化學物質對白三葉草葉斑病病原菌抑菌作用及其誘導抗病效果 采用“生長速率法”，將水楊酸、硅酸鈉、硅酸鉀用滅菌水分別配制成100 μg·mL-1×50倍、50 μg·mL-1×50倍、25 μg·mL-1×50倍，在無菌條件下取1 mL不同濃度的溶液加入49 mL PDA培養基中搖勻后倒入4個滅菌的培養皿中，以加無菌水為對照，做好標記。在無菌操作條件下將經過PDA活化培養3 d的白三葉草葉斑病菌用滅過菌的打孔器沿菌落邊緣制成菌餅，并將菌餅接種于冷卻后的含藥PDA上，在28℃恒溫箱內培養72 h后，用十字交叉法測定菌落的直徑，并按下式計算不同化學物質的抑菌率。

將健康的三葉草葉片經75%酒精消毒、滅菌水沖洗干凈，用篩選出的無抑菌活性的化學物質(上述不同濃度)處理葉片后，葉面朝上放置于已滅菌并有濕濾紙的培養皿中，2 d后噴霧接種葉斑病病原菌的孢子懸浮液(1.0×l04個·mL-1)，用清水作對照，然后室溫保濕培養，接種7 d后按下列分級標準調查發病情況，統計發病數，并按下式計算病情指數和誘導抗病效果。

白三葉草葉斑病癥狀分級標準[15]：0級 無癥狀；1級：病斑占葉面積1/16；2級：病斑病斑占葉面積1/8～1/4； 3級：病斑占葉面積5/16～1/2；4級：病斑占葉面積9/16～3/4。

1.2.33種化學物質對白三葉草酶活性的影響

1.2.3.1 試驗方法 用篩選出的具有誘導抗病效果的一定濃度的水楊酸、硅酸鉀和硅酸鈉以葉面噴霧的方式處理白三葉草植株，處理2 d后采用噴霧法接種葉斑病病原菌孢子懸浮液(1.0×104個·mL-1)，分別設置清水處理(CK)、接菌(Al)、水楊酸(SA)、硅酸鈉(Na2SiO3)、硅酸鉀(K2SiO3)、水楊酸+接菌(SA+Al)、硅酸鈉+接菌(Na2SiO3+Al)、硅酸鉀+接菌(K2SiO3+Al)幾個不同處理，并于處理后1，3，5，7 d及接種前1 d，采集處理的白三葉草葉片，利用生物化學方法測定多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)，所有測定重復3次。

1.2.3.2 酶液的提取、活性的測定及計算 分別參考El Ghaouth[16]和中國科學院上海植物生理研究所[17]的方法對苯丙氨酸解氨酶(PAL)進行提取及酶活性測定；POD、PPO的提取采用袁慶華等[20]方法。POD的測定采用愈創木酚作底物，用分光度法測定生成物的含量，在470 nm波長下測定吸光值。以1 mL去離子水代替H2O2為對照[17]。

在上述反應條件下，以每分鐘每克鮮樣A值變化1.00所需的酶量為1個酶活單位(U)。各樣品均測定2次，3個重復。以上數據均采用SPSS 19.0進行LSD法統計分析，P<0.05。

1.2.43種化學物質對白三葉草田間誘導防病效果測定 將3種化學物質配成濃度為25 μg·mL-1的溶液，噴霧處理田間三葉草植株，以不同化學物質作為處理，每個處理樣方0.25 m2(約300株)，重復3次，以清水噴霧為對照。分別于處理前和處理后7、14 d按1.2.2中分級標準采用5點取樣法，每樣點隨機調查30株，共90個葉片，并按下式計算田間發病率、病情指數(同1.2.2)及誘導防治效果(參考農藥田間藥效試驗準則，略有修改)[18]。

2 結果與分析

2.1 白三葉草葉斑病田間癥狀

白三葉草葉斑病產生兩種類型的病斑，一種為邊緣呈褐色或淡綠色的白色小圓斑或不規則型病斑，另一種為白色病斑，無褐色邊緣；在秋天病葉正、反面可見黑色分生孢子，以背面居多，莖上產生褐色病斑，嚴重時莖和葉片干枯死亡(圖1)。

圖1 白三葉草葉斑病癥狀(A，B：邊緣為褐色的白色病斑；C：白三葉草葉片背面的的病斑；D：白色病斑；E：莖上的褐色病斑及黑色分生孢子；F：對照)
Fig.1 Symptoms of white clover leaf spot disease(A,B,C：white disease spot with brown leaf edge on both the obverse and inverse sides; D: white disease spot on leaf；E: brown disease spot and black conidia on the stems；F: control

2.2 白三葉草葉斑病病原菌鑒定

通過致病性測定和培養形態觀察，發現分離純化的菌株接種白三葉草葉片 5 d后出現褐色病斑，其癥狀與采集的樣品癥狀一致，并且從病斑上分離得到的分離物與起初分離到的一致，表明該分離物為白三葉草葉斑病的病原菌；在PDA培養基上培養，初期菌落為乳白色、圓形、其上有同心輪紋，后期菌落逐漸轉為灰褐色至黑色，同心輪紋漸漸消失。分生孢子梗褐色，分枝或不分枝，有隔。分生孢子暗褐色，卵形至倒棍棒形，具0～6個縱隔膜，1～9個橫隔膜，基部圓滑。菌絲無色透明，有分隔。根據病原菌形態特征結合真菌鑒定手冊將其鑒定為鏈孢霉目(Moniliales)、黑霉科(Dematiaceae)豆鏈格孢菌(Alternariaazukiae)(圖2)。

圖2 白三葉草葉斑病病原菌(A、B:分別為單孢分離菌前、后期培養形態；C:菌絲及分生孢子)
Fig.2 Pathogen of white clover leaf spot disease(A,B：Colony morphology of single spore isolates at early and final culture; C: Hyphae and spores

2.3 3種化學物質對豆鏈格孢菌抑菌率活性測定及其誘導抗病效果

通過對不同濃度3種化學物質抑菌活性測定，結果表明水楊酸、硅酸鈉和硅酸鉀對白三葉草葉斑病菌的抑制作用較低，濃度為100 μg·mL-1時3種化學物質的抑菌率最高，分別為7.55%，4.44%和8.29%，隨著濃度的降低，抑菌率逐漸降低，當濃度為25 μg·mL-1時，硅酸鈉的抑菌率僅為0.59%(表1)。

誘導抗病性試驗結果表明：不同處理的白三葉草葉斑病發生情況不同。經方差分析表明，同一化學物質不同濃度處理的病情指數與對照的病情指數之間均存在顯著差異，而且3個濃度處理的病情指數之間也存在顯著差異，其中濃度為25 μg·mL-1時3種化學物質處理的病情指數均低于其他兩個濃度處理的。同一濃度不同化學物質處理的病情指數與對照的病情指數之間均存在顯著差異，濃度為100 μg·mL-1時，水楊酸與硅酸鈉處理的病情指數之間存在顯著差異，而硅酸鉀處理的病情指數介于二者之間；濃度為50 μg·mL-1時，水楊酸與硅酸鈉、硅酸鉀處理的病情指數之間存在顯著差異，而硅酸鈉、硅酸鉀處理的病情指數之間差異不顯著；濃度為25 μg·mL-1時，水楊酸、硅酸鉀處理的病情指數與硅酸鈉處理的病情指數之間存在顯著差異，而水楊酸、硅酸鉀2種化學物質處理的病情指數之間差異不顯著。統計分析結果表明：所選用的3種化學物質對白三葉草葉片抗豆鏈格孢菌均有一定誘導作用，在3種濃度下的誘導抗病效果均在45%以上，且低濃度時誘導抗病效果均略高于高濃度處理，當濃度為25 μg·mL-1時，3種化學物質誘導抗病效果均最好，分別為53.18%，53.73%和45.69%(表1)。

表1 3種化學物質對白三葉草葉斑病菌的誘導抗病效果Table 1 Induced resistant effect of three kinds of chemical to Alternaria azukiae

注：不同大寫字母表示同一物質不同濃度處理之間差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示同一濃度不同物質處理之間差異顯著(P<0.05)

Note: Different capital letter indicate significant differences among the same substance at different concentration treatments and control at the 0.05 level；different lowercase letters indicate significant differences among the same concentrations of different substance treatments at the 0.05 level

2.4 3種化學物質誘導處理對白三葉草酶活性的影響

2.4.13種化學物質誘導處理對白三葉草葉片多酚氧化酶(PPO)活性的影響 3種化學物質誘導處理對白三葉草葉片中多酚氧化酶(PPO)活性均有影響，PPO活性呈現先升高后降低的趨勢，其中硅酸鉀(K2SiO3+Al)和硅酸鈉(Na2SiO3+Al)誘導處理的葉片中PPO活性在第3 d均達到峰值，水楊酸誘導處理在第5 d達到峰值，分別為0.24，0.05，0.11 U·mg-1·min-1，且25 μg·mL-1硅酸鉀誘導(K2SiO3+Al)處理后，在第1，3，5，7 d時PPO活性均高于對照(CK)及其他處理，且與其他處理的酶活性之間存在極顯著差異，尤其在第3，5 d時硅酸鉀誘導處理(K2SiO3+Al)的PPO活性分別比對照(CK)的提高了92.98%和92.53%，比接菌(Al)處理提高了76.03%和73.63%，比硅酸鈉、水楊酸誘導處理的分別提高了79.34%和82.09%、75.61%和46.26%，(圖3)；水楊酸誘導處理(SA+Al)在第5，7 d時PPO活性高于對照(CK)、接菌(Al)、硅酸鈉+接菌(Na2SiO3+Al)處理，分別比對照(CK)提高了86.11%和82.41%、比接菌(Al)提高了50.93%和41.67%、比硅酸鈉+接菌(Na2SiO3+Al)處理提高了66.67%和66.67%，但略低于水楊酸(SA)處理；且酶活性之間存在極顯著差異；硅酸鈉誘導處理(Na2SiO3+Al)的酶活性均低于硅酸鉀誘導處理(K2SiO3+Al)和水楊酸誘導處理(SA+Al)(圖3)。

圖3 3種化學物質誘導處理對三葉草葉片中PPO活性影響
Fig.3 Effect of induction treatment of three chemical substances on PPO activities of white clover leaves
注：不同小寫字母表示同一天不同物質處理的酶活性之間差異顯著性(P<0.05)，下同
Note: Different lowercase letters showed significant differences at the same day of different substance treatments at the 0.05 level，the same as below

2.4.23種化學物質對過氧化物酶(POD)活性的影響 3種化學物質誘導處理對白三葉草葉片中過氧化物酶(POD)的活性均有影響，POD活性呈先升高后降低的趨勢，在第5 d時POD活性均達到峰值，分別為9.70，7.92，8.51 U·mg-1·min-1；第1 d時除水楊酸誘導處理的POD活性高于SA、CK和接菌處理外，硅酸鉀(K2SiO3+Al)、硅酸鈉(Na2SiO3+Al)誘導處理的POD活性低于硅酸鉀(K2SiO3)、硅酸鈉(Na2SiO3)的處理，高于對照(CK)和接菌(Al)處理；硅酸鉀(K2SiO3+Al)誘導處理的分別比對照(CK)、接菌(Al)、硅酸鉀(K2SiO3)處理的POD活性高6.65，6.40，0.95 U·mg-1·min-1，水楊酸(SA+Al)誘導處理的POD活性分別比對照(CK)、接菌(Al)、水楊酸(SA)處理的高5.75，5.50，1.76 U·mg-1·min-1，硅酸鈉(Na2SiO3+Al)誘導處理的POD活性分別比對照(CK)、接菌(Al)和硅酸鈉(Na2SiO3)處理高3.85，3.60和0.26 U·mg-1·min-1，且硅酸鉀誘導處理(K2SiO3+Al)的POD活性和水楊酸(SA+Al)、硅酸鈉(Na2SiO3+Al)誘導處理的酶活性之間均存在極顯著差異(圖4)。

圖4 3種化學物質誘導處理對三葉草葉片中POD活性影響
Fig.4 Effect of induction treatment of three chemical substances on POD activities of white clover leaves

2.4.33種化學物質對苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影響 硅酸鉀(K2SiO3+Al)、硅酸鈉(Na2SiO3+Al)和水楊酸(SA+Al)誘導處理對白三葉草葉片中苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶活性均有影響，呈現先升高后降低的趨勢，在第5 d時PAL活性均達到峰值，分別為9.63，7.78，8.12 U·mg-1·min-1；其中硅酸鉀(K2SiO3+Al)誘導處理后PAL活性分別比水楊酸(SA+Al)和硅酸鈉(Na2SiO3+Al)誘導處理高了0.36%，14.69%，15.68%，10.64%和28.74%，19.93%，19.22%，22.38%，比對照(CK)提高了28.41%，25.00%，36.04%， 35.33%，與其他處理的PAL酶活性之間存在極顯著差異(圖5)。

圖5 3種化學物質誘導處理對三葉草葉片中PAL活性影響
Fig.5 Effect of induction treatment of three chemical substances on PAL activities of white clover leaves

2.5 3種化學物質對白三葉草田間誘導防病效果測定

田間誘導防病效果測定結果表明3種化學物質對白三葉草抗葉斑病均有一定的誘導防治作用，處理后7 d的誘導防病效果均達到72%以上，其中硅酸鉀的誘導防治效果最好為81.22%，水楊酸次之，硅酸鈉最低；誘導處理14 d后硅酸鉀、硅酸鈉和水楊酸的誘導防病效果分別比處理后7 d的降低了64.06%，67.96%和61.35%(表2)。

表2 3種化學物質對白三葉草抗葉斑病田間誘導防治效果Table 2 Inducted resistant effect of three kinds of chemical substances on white clover against leaf spot in the field

3 討論與結論

3.1 討論

誘導抗病性是利用物理、化學及生物的方法預先處理植株，改變植物對病害的反應，使原來感病反應產生局部或系統的抗性。水楊酸(salicylic acid， SA)是一種簡單的酚類化合物，最先在柳樹皮的提取物中被發現，作為一種重要的植物防衛激素，在植物防御反應尤其是SAR中起著重要的作用[19]，外源SA 處理可以誘導水稻 (OryzasativaL.)、芒果(MangiferaindicaL.)、花生(ArachishypogaeaLinn.)、香蕉(Musaparadisiaca)、桉樹(Eucalyptus)、棉花(AnemonevitifoliaBuch)、玉米(ZeamaysL.)、辣椒(CapsicumannuumL.,)、草坪型高羊茅(Festucaarundinacea)、觀賞百合(LiliumL.)等多種植物病害產生局部和系統抗性[13-14,20-21]；另外適宜濃度的外源SA可以提高苜蓿的抗旱性及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)的活性[22]以及初花期扁蓿豆光合作用，提高其干物質產量和飼草品質[23]；硅酸鈉作為誘抗劑在水稻抗稻瘟病、蘋果梨、厚皮甜瓜、杏等采后病害方面有報道；而硅酸鉀作為誘抗劑的研究尚未見報道。植物誘導抗性的產生通常是通過酶催化調節而實現，植物受到病原菌侵染或被誘導處理后，與抗病反應密切相關的防御酶活性升高是誘導抗性產生的重要機制之一[8]；本試驗研究結果表明：SA 、硅酸鉀、硅酸鈉誘導后能引起白三葉草葉片內POD，PPO 和PAL 活性的升高，這與高峰[24]、李云華[25]、葛永紅[25]等報道的在辣椒、花生、棉花、水稻、煙草、玉米等植物上施用SA，蘋果梨、杏采后硅酸鈉處理對防御酶影響的結果相似。POD是植物體內普遍存在的氧化還原酶，他不僅參與了木質素、酚類物質及植保素的合成，還作為整個代謝途徑的調節因子，通過影響植物體內多種代謝途徑而在抗病性中起作用，是與植物抗病有關的一種重要酶[27-28]。多酚氧化酶(PPO)是酚類物質氧化的關鍵酶，參與植物體內酚類物質氧化產生醌類并參與木質素的合成，催化酚類物質氧化形成的預苯酸是合成木質素的前提，可以修復傷口，殺死和抑制病原菌的繁殖而起到抗病作用[29]。PAL活性與植物抗病性密切相關，其活性可作為衡量植物抗病性的生化指標之一。植物感染病原菌后PAL活性明顯升高，并表現出規律性的變化，如張淑珍[30]等在對疫霉根腐病菌毒素脅迫下不同大豆抗感品種PAL活性的研究中發現，抗病大豆品種的根、莖和葉中PAL活性在病程的大部分階段都高于對照，PAL的植物抗病機制主要表現為參與植保素、木質素和酚類物質的合成[31]。由此可見這3種酶活性的提高是植物抗病性增強的具體表現。本試驗結果也表明經水楊酸、硅酸鉀、硅酸鈉誘導處理后，白三葉草葉片組織內病程相關蛋白酶PPO、POD和PAL活性均在短時間內提高，表現出規律性變化，且明顯高于對照，表明這三種化學物質能夠激活白三葉草葉片的防御體系，使白三葉草葉片產生了對葉斑病的抗性；3種化學物質處理后PPO變化規律不同，硅酸鉀、硅酸鈉處理可使白三葉草葉片中的PPO在短時間內活性迅速升高，在第3 d達到峰值，水楊酸處理后PPO活性在第5 d達到峰值，而POD、PAL變化一致，可在第5天達到峰值，這表明3種化學物質對白三葉草抗葉斑病的誘導機制可能存在差異，本試驗尚未涉及；另外，田間試驗結果表明3種化學物質對白三葉草抗葉斑病有一定的誘導防治效果，但隨著時間推移誘導防病效果明顯降低，對于這3種化學物質的最佳誘導時間、誘導抗病性持效期以及能否誘導白三葉草葉片產生對其他葉部病害的抗性等問題還有待于進一步研究。

3.2 結論

經鑒定發現豆鏈格孢菌(Alternariaazukiae)為引起蘭州地區白三葉草葉斑病的病原菌；濃度為25 μg·mL-1的硅酸鉀、硅酸鈉、水楊酸對豆鏈格孢菌抑菌率較低且室內誘導抗病效果最好，分別為53.18%，53.73%和 48.69%；經3種化學物質誘導處理后，白三葉組織內與病程相關的抗氧化酶POD和PPO活性均在短時間內提高，且明顯高于對照。3種化學物質田間處理對白三葉草抗葉斑病均有一定的誘導效果，處理后7 d的誘導防病效果均達到72%以上，其中硅酸鉀的誘導抗病效果最好，為81.22%；誘導處理14 d后硅酸鉀、硅酸鈉和水楊酸的誘導防病效果分別比處理后7 d的降低了64.06%，67.96%和61.35%，表明3種化學物質對白三葉草抗葉斑病均有較好的誘導防病作用。