苜蓿種質材料對亞麻刺盤孢的室內抗性評價

馬甲強， 袁慶華， 王 瑜， 苗麗宏

(1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所， 北京 100193； 2. 廣元市林業和園林局 城市園林綠化管理處， 四川 廣元 628000)

苜蓿(Medicago)是多年生優質豆科牧草，也是我國種植面積最大的人工牧草。其具有產量高、品質優和適口性好等特點，他不僅能改良土壤，還可以提高家畜生長性能[1-2]。近幾年來，隨著苜蓿種植面積的不斷擴大和單一品種的連作，苜蓿炭疽病危害加重。本課題組在2013-2015年對東北和華北苜蓿地病害調查時發現，苜蓿炭疽病平均發病率達42.3%，造成的產量損失率達10.1%～54.4%。因此，該病的防治對苜蓿生產非常重要。防治的關鍵是篩選和培育抗苜蓿炭疽病品種。據國內外文獻報道[3-4]，引起苜蓿炭疽病的主要病原菌有三葉草刺盤孢(Colletotrichum.trifolii)、毀滅刺盤孢(C.destructivum)和平頭刺盤孢(C.truncatum)。2014年Vasic等[5]在塞爾維亞首次發現一種由亞麻刺盤孢(C.linicola)引起的苜蓿炭疽病。同年本課題組在我國吉林、內蒙古苜蓿上也發現此菌，且致病性較強。近年來，國外對其他病菌引起的苜蓿炭疽病的抗性品種篩選進行了大量研究，并篩選出一些優良品種材料[6-7]。在國內，苜蓿炭疽病的抗性評價研究較少，缺乏抗性種質材料比較研究。鄭芳芳等[8]以苜蓿的病葉量作為測定指標鑒定了20個苜蓿品種對炭疽病(C.truncatum)的抗性。而關于此菌引起的苜蓿炭疽病的抗病性評價在國內外尚屬空白。因此，本研究通過對50份苜蓿種質材料進行苗期室內接種評價，通過統計病情指數，測定株高、生物量形態指標，測定相對質膜透性、脯氨酸含量、可溶性糖含量和木質素含量等生理生化指標，并以病情指數進行直接抗性評價；同時通過主成分分析篩選出與抗病性鑒定密切相關的4個主要指標，并采用隸屬函數分析法對50份苜蓿種質進行綜合評價。通過這兩種方法篩選出可靠的具有較強抗性的苜蓿種質材料，為苜蓿炭疽病的防治和抗病育種材料的選育提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試50份苜蓿種質材料均由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所牧草資源室提供，種子名稱及來源如表1所示。

表1 種質材料及來源Table 1 The alfalfa germplasm materials and their sources

注：-表示種質來源地不詳；* 表示無原種名或原種名不詳,下同

Note: - indicate the germplasm sources are unspecified; * indicate the original name of this germplasm source is unknown,The same below

供試菌株為亞麻刺盤孢(Colletotrichumlinicola)，由吉林省白城苜蓿中分離獲得，菌株接種于PDA培養基上，4℃保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1苜蓿幼苗的培育 將沙土和草炭按照1∶1混合在高壓滅菌鍋中滅菌30 min，裝在套有塑料袋的花盆(高15 cm，口徑16.5 cm，底徑11 cm)中，每盆裝混合土2 kg。種子用0.1%的升汞溶液消毒3 min，再用蒸餾水沖洗3次后放在培養皿中，置于25℃的恒溫培養箱中黑暗培養72 h，然后將發芽的種子移栽到花盆中，每盆15株，待生長到2～3片真葉時定植，每盆保留10株。花盆放置在20～25℃溫室中培養，每隔2 d澆一次水。設置接種處理與不接種對照兩組，3個重復。

1.2.2菌種培養及接種 將已保存的菌株在25℃下PDA平板上活化培養10 d。并收集菌落制成孢子懸浮液，用血球計數板計數，稀釋孢子懸浮液濃度為1×106個·mL-1。用噴霧接種法[8]接種在生長60 d的苜蓿上，并用塑料薄膜密封黑暗保濕48 h，之后將苜蓿放置在光照16 h，25℃，黑暗8 h，23℃下培養。

1.2.3測定指標及方法

1.2.3.1 病情測定方法 依據苜蓿苗期接種14 d出現發病高峰，14 d后進行病情統計(下同)，病情分級標準如下：

0：無病斑；1：病斑占葉面積6%或以下；2：病斑占葉面積6%～25%；3：病斑占葉面積26%～45%；4：病斑占葉面積46%～65%；5：病斑占葉面積66%～75%；6：病斑占葉面積76%以上。

根據病情指數[9]將50份苜蓿種質材料抗病性劃分為四個等級：病情指數小于11的為高抗；11～25之間的為中抗；25～35之間的為中感；大于35的為高感。

1.2.3.2 株高 用直尺測定每株幼苗的垂直高度，每盆測定5株，共測定3盆，以15株幼苗株高平均值作為株高，為了減小試驗材料本身誤差，用相對株高[10]作為抗病性衡量指標。

1.2.3.3 產量損失率測定[11]用剪刀齊地剪取苜蓿地上部分，放置在105℃的烘箱中殺青(30 min)，85℃下烘干至恒重(48 h)，待冷卻至室溫后稱重(精確到0.000 1 g)，3盆苜蓿植株地上部分生物量干重的平均值作為地上生物量干重。

1.2.3.4 脯氨酸含量測定 采用茚三酮測定法[12]，稱取0.5 g苜蓿新鮮葉片，分別加入10 mL 3%磺基水楊酸溶液，迅速研磨成勻漿，移至50 mL離心管中沸水浴10 min，放置室溫后，3 000 r·min-1離心10 min。取上清液2 mL于15 mL帶塞試管中，再分別加入2 mL 3%磺基水楊酸，2 mL冰醋酸和4 mL 2.5%酸性茚三酮，沸水浴中顯色1 h。冷卻后，再加入4 mL甲苯，漩渦震蕩0.5 min，靜置分層。用移液槍吸取紅色甲苯相2 mL，520 nm處測定其OD值。

1.2.3.5 可溶性糖含量測定 采用蒽酮法[12]測定。稱取0.2 g苜蓿新鮮葉片，剪碎置于具塞試管中，加10 mL蒸餾水，在沸水中提取1 h，將提取液過濾入25 mL容量瓶中，反復沖洗試管及殘渣并定容至刻度。吸取0.5 mL提取液，然后加入1.5 mL蒸餾水，再按順序依次向試管加入蒽酮乙酸乙酯0.5 mL和濃硫酸5 mL，充分振蕩，立即放入沸水浴1 min，取出冷卻至室溫，用分光光度計在630 nm波長下測其吸光度。

1.2.3.6 質膜相對膜透性 采用電導法[12]測定。稱取0.5 g苜蓿新鮮葉片，用自來水沖洗后再用蒸餾水沖洗2次，用濾紙吸干后剪碎混勻，浸泡于裝有20 mL水的50 mL帶塞試管中4 h，用DDS-Ⅱ型電導儀測定其電導率。然后置于沸水浴30 min，冷卻至室溫再測其電導率，記錄數據。以相對電導率表示細胞質膜透性大小。

1.2.3.7 木質素含量測定 采用紫外分光光度法測定[13]方法，略有改進。稱取新鮮葉片0.5 g放入研缽中，加5 mL 95%的乙醇研磨成勻漿，收集在10 mL離心管中，8 000 r·min-1離心10 min并收集沉淀。用95%乙醇洗滌沉淀3次，再用乙醇∶正己烷(1∶2)沖洗3次，收集沉淀干燥5 h。然后用0.5 mL 25%的乙酰溴冰乙酸溶液溶解，并置于70℃水浴中加塞保溫30 min，再用0.9 mL 2 mol·L-1NaOH終止反應，依次加入5 mL的冰醋酸和0.1 mL 7.5 mol·L-1的鹽酸羥胺，振蕩混勻，8 000 r·min-1離心5 min，吸取上清液0.1 mL，加入3.0 mL的冰醋酸稀釋后，測定每克的吸收波長A280 nm，以此表示木質素的含量。

1.3 數據分析

采用Excel(2013)軟件處理數據，用SPSS 19.0，SAS 8.0軟件分別進行方差分析、主成分分析和隸屬函數分析。

隸屬函數的計算公式：R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

反隸屬函數值計算公式：R(Xi)=1 -(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中，Xi為指標的測定值；Xmin、Xmax為所有參試材料某一指標的最小和最大值。

2 結果分析

2.1 供試苜蓿種質材料抗亞麻刺盤孢的直接評價

各苜蓿種質對炭疽病的抗性存在極顯著的差異(P<0.01)，各材料之間表現出不同的抗病性(表2)。病情指數為3.17～37.45，其中病情指數小于11的種質材料有9份，分別是蘭熱來恩德(M 5)、干地(M 22)、呼倫貝爾(M 13)、吐魯番(M 18)、霍納伊(M 33)、阿爾貢奎因(M 14)、龍牧801(M 19)、杜普梯(M 28)和西奎爾(M 16)，為高抗材料，占供試材料的18%；病情指數在11～25之間中抗材料有21份，占供試總材料的42%；病情指數在25～35之間的中感材料有14份，占供試總材料的28%；而病情指數大于35的高感材料有6份，分別是新疆大葉(M 39)、法國(M 47)、榆次(M 43)、南特(M 6)、滄州(M 50)和普羅莫(M 10)，占供試總材料的12%。可見大部分材料對苜蓿炭疽病屬于中等抗性材料。

2.2 供試苜蓿種質材料抗亞麻刺盤孢的間接評價

2.2.1各苜蓿種質接種亞麻刺盤孢后的相對株高 接種亞麻刺盤孢后，不同程度的抑制了各種質材料的株高(表2)。各種質材料的相對株高存在極顯著差異(P<0.01)，相對株高的變化范圍為94.81%～51.17%，其中相對株高在90%以上的種質材料有4份，分別是龍牧801(M 19)、吐魯番(M 18)、阿佩克斯(M 21)和阿爾貢奎因(M 14)，占供試材料的8%；相對株高在70%以下的種質材料有5份，分別是薩蘭斯(M 17)、法國(M 47)、P-23(M 36)、C/W3(M 38)和新疆大葉(M 39)，占供試材料的10%；而大部分種質材料的相對株高集中在70%～90%之間，共有41份，占供試材料的82%。

2.2.2各苜蓿種質接種亞麻刺盤孢后的產量損失 由表2可知，接種后各種質材料產量均有降低，且各種質材料的產量損失率差異顯著(P<0.05)，產量損失率變幅范圍為6.70%～59.11%，產量損失率達40%以上的材料有8份，分別是新疆大葉(M 39)、隴東(M 1)、納拉甘塞(M 40)、普羅莫(M 10)、法國(M 34)、南特(M 6)、滄州(M 50)和榆次(M 43)，占供試材料的16%，其中新疆大葉產量損失率最高，達59.11%；產量損失率在15%以下的有7份，分別是蘭熱來恩德(M 5)、吐魯番(M 18)、愛若(M 25)、敖漢(M 32)、龍牧801(M 19)、阿爾貢奎因(M 4)和克利來(M 24)，占供試材料的14%，其中蘭熱來恩德產量損失率最小，僅6.70%；而其他種質材料產量損失率在15%～40%之間，共計35份，占供試材料的70%。由此可見，亞麻刺盤孢對種質材料的產量損失影響較大。

2.2.3各苜蓿種質接種亞麻刺盤孢后的相對質膜透性 接種后各材料電解質滲出率存在極顯著差異(P<0.01)(表2)，相對電解質滲出率變化范圍為0.49～1.01。其中隴中(M 26)相對電解質滲出率增幅最大，為1.01，說明隴中(M 26)對苜蓿炭疽病的抗性最差；相對電解質滲出率最小的為蘭熱來恩德(M 5)，僅為0.49，說明蘭熱來恩德(M 5)抗炭疽病最強；相對電解質滲出率在0.80～0.98之間的材料有41 份，占供試材料的82%；相對電解質在0.8以下僅有8份，占供試材料的16%。

2.2.4各苜蓿種質接種亞麻刺盤孢后的脯氨酸含量 接種后，各種質材料脯氨酸含量既有升高的又有下降的。各種質材料間相對脯氨酸的含量差異顯著(P<0.01)，相對脯氨酸含量在6.63～0.11之間，相對脯氨酸含量大于1的種質材料有27份，其中最高的是霍納伊(M 33)，為6.63；而其余23份相對脯氨酸含量均小于1，其中克利來(M 24)相對脯氨酸含量最少，僅為0.11。

2.2.5各苜蓿種質接種亞麻刺盤孢后的可溶性糖含量 由表2知，相對可溶性糖含量變化范圍為6.72～0.28。各種質材料之間可溶糖含量差異顯著(P<0.01)。相對可溶性糖含量大于1的有24份，其中相對可溶性糖含量較高的是榆次苜蓿(M 43)、武功(M 30)和普羅莫(M 10)，分別為6.72，3.71和3.42；可溶性糖含量小于1的有26份，其中敖漢(M 32)相對可溶性糖含量最少，僅為0.28。

2.2.6各苜蓿種質接種亞麻刺盤孢后的木質素含量 各種質材料接種后，木質素含量都有不同程度的升高(表2)。各材料相對木質素含量差異顯著(P<0.01)。相對木質素含量變化范圍為7.97～1.06，其中相對木質素含量在2以上的有8份，分別是龍牧801(M 19)、奎屯(M 35)、阿爾貢奎因(M 4)、干地(M 22)、中山一號(M 20)、呼倫貝爾(M 13)、霍納伊(M 33)和蘭熱來恩德(M 5)，占供試材料的16%，其中龍牧801的相對木質素含量最高，為7.97；木質素相對含量在1.10以下的有美國2號(M 2)、隴東(M 1)和大西洋(M 46)，分別為1.10，1.09和1.06；其余的種質材料相對木質素含量均在1.10～2.00之間。

表2 各苜蓿種質材料的形態指標和生理生化指標Table 2 Morphological, physiological and biochemical indexes of alfalfa materials

注：HR:高抗；R：中抗；S：中感；HS：高感

Note：HR: high resistance; R: moderate resistance; S: moderate susceptibility; HS: high susceptibility

2.2.7主成分分析 將供試50份種質材料的6個相對指標進行主成分分析，計算出各項指標的貢獻率，確定綜合評價指標，篩選出綜合性狀好的種質材料。由表3可知，第一、第二、第三和第四主成分方差貢獻率分別為41.69%，16.12%，14.98%和11.66%，前四個主成分累計方差貢獻率已經達到84.45 %，足以代表整個數據的大部分信息[14]。由表4可知，第一主成分中，產量損失率信息負荷量(特征向量和特征值)最大，可以作為產量損失的評價指標；第二主成分中，相對脯氨酸含量的信息負荷量最大，可作為脯氨酸含量的綜合指標。其中，負值說明在主成分中作用效果與其他指標不一致；第三主成分中相對可溶性糖含量的信息負荷量最大，可作為可溶性糖含量的評價指標；第四主成分中相對質膜透性的信息負荷量最大，可作為質膜透性的評價指標。

表3 主成分分析結果Table 3 Results of principal components analysis

表4 各因子載荷矩陣Table 4 Component matrix

2.2.8隸屬函數分析 根據主成分分析，篩選出貢獻率較大的特征向量：產量損失率、相對脯氨酸含量、相對可溶性糖含量和相對質膜透性4個指標進行隸屬函數分析，根據隸函數平均值大小將50份種質材料進行分類。

表5 4個指標的隸屬函數值Table 5 The values of subordinate function of four indicates

注：R(1)、R(2)、R(3)、R(4)分別表示產量損失率、相對脯氨酸含量、相對可溶性糖含量和相對質膜透性的隸屬函數值；S(1)表示隸屬函數平均值

Note：R(1), R(2), R(3), R(4) indicate the subordinate function values of yield loss rate, relative proline content, relative soluble sugar and relative electrical conductivity; S(1) indicate the average values of subordinate function values

根據隸屬函數平均值可知：蘭熱來恩德(M 5)、霍納伊(M 33)、阿爾貢奎因(M 4)、龍牧801(M 19)、敖漢(M 32)、吐魯番(M 18)和西奎爾(M 16)隸屬函數平均值較大，對苜蓿炭疽病表現為高抗；保加利亞苜蓿(M 44)、法國苜蓿(M 47)、潤布勒(M 42)、武功(M 30)、草原三號(M 27)、隴東(M 1)、新疆大葉(M 39)、隴中(M 26)、普羅莫(M 10)、滄州(M 50)和榆次(M 43)隸屬函數平均值相對較小，對苜蓿炭疽病表現為高感。

3 討論

植物的抗病性是一個復雜的生物學過程。接種亞麻刺盤孢后，苜蓿會通過結構抗性和生化抗性抵抗或阻止亞麻刺盤孢菌的接觸或侵染[15]。本研究對50份苜蓿種質材料以病情指數進行直接評價和其他指標間接綜合評價，來篩選出對亞麻刺盤孢菌抗性較強的品種。通過兩種方法的評價，評價結果基本一致，說明兩種方法都可用于苜蓿炭疽病的抗性評價。但個別種質材料評價結果不同，導致這種差異的因素可能是抗性鑒定方法不同或種質材料出現隱癥現象。然而從苜蓿種質材料的各種指標變幅來看，采用多項指標進行綜合評價，其結果更加真實有效。

植物抗病性的評價指標較多[12,16-17]，其中株高和生物量可作為植物抗病性評價的形態指標[10,16]。本試驗結果表明，苜蓿幼苗接種亞麻刺盤孢后，50份材料株高均被抑制。抗病性強的種質材料株高比抗病性弱的高，說明苜蓿株高與抗炭疽病成正相關。接種亞麻刺盤孢后，苜蓿產量損失嚴重，抗病性強的種質產量損失較小，抗病性弱的種質產量損失較大，說明產量損失與種質抗炭疽病呈負相關。從主成分分析來看，產量損失的貢獻率最大，可見種質產量損失可作為苜蓿抗炭疽病評價的主要形態指標。

此外，植物被病菌侵染后從細胞壁到細胞內部發生一系列結構抗性反應[20]。眾多學者研究發現[19-21]，植株受到病菌侵染后，細胞膜遭到破壞，膜透性增大，從而使細胞內的電解質外滲，導致電導率增加。李廣旭等[22]研究發現輪紋病菌(tryosphaeriaberengrianaf. sp.piricola)侵染蘋果(Malusdomestica)后，不同品種的電解質滲出率有不同程度的增大，且感病品種的電解質滲出率大于抗病品種。劉正坪等[23]也認為品種抗病性與細胞膜透性變化呈負相關。本研究發現，苜蓿種質材料接種亞麻刺盤孢后，細胞膜透性均增大，且感病品種的質膜透性大于抗病品種，這與前人研究結果一致。說明細胞膜可作為抗病性評價的指標。木質素含量也呈上升趨勢，且抗性品種的含量高于感病品種。說明木質素含量的升高能夠有效阻止或延緩病原菌了的侵入。

被病原菌侵染的植物其生理生化機制會發生變化[18]。研究表明，脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗病性[12]。病原菌侵染后脯氨酸含量顯著增加，且抗病性強的種質材料游離脯氨酸含量明顯高于感病材料[10,24]。本研究發現，接種亞麻刺盤孢后，抗病強的品種脯氨酸含量較低，而感病品種脯氨酸含量較高，這與李銀萍等[12]研究不一致，而與王曉宇[25]研究一致。從主成分貢獻率來看，脯氨酸含量與品種抗性呈正相關。這可能是因為抗病性強的品種中脯氨酸迅速轉化為羥脯氨酸，間接的提高了苜蓿種質的抗病性。植株體內可溶性糖含量與其抗病性的關系研究結果并不一致。有些學者發現可溶性糖含量與植株抗性呈顯著正相關[17,26]。也有學者發現可溶性糖含量與植株抗病性呈負相關[27-28]。陳夕軍等[27]研究發現，黃瓜抗白粉病品種中可溶性糖含量明顯低于感病品種，但接種病原菌后，其含量有下降趨勢，而感病品種卻有短時上升現象。本試驗研究表明，苜蓿種質材料感病后，多數抗病性強的種質可溶性糖含量下降，而感病品種可溶性糖含量上升。由此可見，在一定的程度上，可溶性糖含量與苜蓿種質材料抗炭疽病呈負相關。

4 結論

病害對植物的影響不僅表現在形態指標，還表現在具體的生理生化指標。因此，本研究以統計病情指數4個等級為指標進行直接評價并測定形態指標(株高、生物量)與生理生化指標(相對質膜透性、脯氨酸、可溶性糖和木質素含量)，用主成分及隸屬函數分析法進行間接評價，得到了抗炭疽病較強的種質有：蘭熱來恩德、霍納伊、阿爾貢奎因、龍牧801、吐魯番和西奎爾；抗炭疽病較弱的種質材料有：榆次、滄州、普羅莫、新疆大葉和法國(M 47)苜蓿。另外，通過主成分分析篩選出4個與苜蓿苗期抗病性相關的主要指標，分別是：產量損失、脯氨酸、可溶性糖和質膜透性含量。