模擬增溫下短花針茅實時熒光定量內參基因的篩選及驗證

高金玉， 郭慧琴， 曹 路， 韓 冰,2*

(1.內蒙古農業大學生命科學學院， 內蒙古 呼和浩特 010018； 2.中國農業科學院草原研究所， 內蒙古 呼和浩特 010018)

實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qRT-PCR)是一種基于普通PCR定性技術發展而來的新型的核酸定量技術，具有定量準確、重現性高、靈敏度高和高通量等特點，已被廣泛應用于微生物檢測、單個核酸多態性分析和基因表達研究。在基因表達分析過程中，結果時常會受到不同變量的影響，如起始RNA的質量和數量、反轉錄合成[1]。在qRT-PCR試驗中，為了使結果可信，需要篩選表達穩定的內參基因作為標準[2-3]。在基因定量表達的研究中，通常選用看家基因(House-keeping gene)作為內參基因，因為看家基因是全部細胞中均要表達的一類基因，其產物對于維持細胞各種基本生命活動是必需的，比如常用的糖酵解酶系基因、微管蛋白基因和核糖體蛋白基因等。一般認為看家基因的表達只受機體RNA聚合酶或啟動子相互作用的影響，并不受其他機制調節，看家基因的表達受環境因素的影響較小。但隨著研究的深入，發現看家基因在不同組織部位或者不同處理下的表達量并不穩定，導致試驗結果的準確性降低，甚至發生錯誤[4]。關波[5]曾經發現18srRNA在不同組織細胞中的表達量是不同的，在細胞有絲分裂期間，其表達量近乎為零。這些結果使得人們在直接選擇18srRNA、TUB等常規的看家基因作為內參基因時產生了懷疑[6]，因此對最適內參基因的篩選成為了對基因表達進行定量研究前所必需的工作。

短花針茅(Stipabreviflora)屬于禾本科，針茅屬。是荒漠草原的建群種，又是優良的牧草，具有十分重要的生態和飼用價值，對荒漠地區惡劣生境具有極強的適應性，是探究荒漠草原區重要野生牧草對全球變暖響應機制的良好材料。然而關于短花針茅的研究，目前還主要集中在生理生態等方面，在分子遺傳等方面的研究進展緩慢。為了揭示短花針茅在增溫處理下基因的表達機制，本研究分析9個常見候選基因的表達穩定性，篩選出穩定表達的內參基因，為后續研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料短花針茅葉片，采集于內蒙古四子王旗烏蘭花鎮的“內蒙古農牧科學院四子王旗實驗基地”，在短花針茅果后營養期采集增溫區和對照區的短花針茅葉片組織，液氮冷凍，-80℃冰箱保存。

1.2 試驗方法

1.2.1總RNA提取及cDNA的合成 用Trizol Reagen試劑盒提取樣品總RNA，用核酸定量儀和1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的濃度、純度以及完整性。利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒進行反轉錄，合成cDNA，于-20℃儲藏備用。

1.2.2候選內參基因的選擇與引物設計 具體參考Karunesh Kumar在谷子中篩選內參基因的引物序列[7]，合成本試驗所用引物，引物序列如表1所示。

表1 候選內參基因的引物序列Table 1 The primers of candidate reference genes

1.2.3普通PCR 普通PCR為20 μL的反應體系:5×PrimerSTARTMBuffer(Mg2+plus)5 μL，dNTP Mixture(2.5 mM each)1 μL，上游引物(20 μM) 0.5 μL，下游引物(20 μM)0.5 μL，短花針茅cDNA 1 μL，PrimerSTARTMHS DNA Ploymerase 1 μL，RNase Free dH2O 11 μL。反應程序為：94℃預加熱3 min，94℃模板變性30 sec，60℃退火30 sec，72℃模板延伸30 sec，72℃保持5 min使產物延伸完整，35個循環。

1.2.4實時熒光定量PCR 20 μL的熒光定量PCR反應體系包括：SYBRPremixExTaqTM(2×)10 μL，上游引物和下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，RNase Free dH2O 6 μL。qRT-PCR的反應程序為：95℃預變性5 min；95℃變性5 sec，60℃退火30 sec，45個循環。擴增完畢后，進行熔解曲線分析以確定擴增產物的特異性，溫度從60℃緩慢遞增到95℃，連續測定樣品的熒光強度以獲取熔解曲線。

1.2.5數據處理及分析 使用Delta-Ct法和geNorm, Normfinder, BestKeeper 3個軟件分析候選基因的表達穩定性。其中geNorm是將每個平行反應樣品的平均Ct值轉換為相應的數據，計算出內參基因表達穩定性的M值，M值越大穩定性越差，M值越小穩定性越好。一般情況下M值大于1.5為不可接受，表明該內參基因不可用。這個軟件可計算引入1個新的內參基因后標準化因子的配對變異V值，可根據Vn/Vn+1比值來判定所需新的內參基因的數目。一般默認的V值為0.15，如果Vn/Vn+1大于0.15，則有必要引入第n+1個內參基因，如果小于0.15，則不必引入新的內參基因。Normfinder軟件的原理是基于方差分析對內參基因的表達穩定性進行直接評價，產生基因表達穩定值，然后根據穩定值的大小排序，最終將表達穩定值最小的基因作為最穩定的基因。

BestKeeper軟件主要通過比較a值的標準偏差和變異系數從而選擇表達穩定的基因，標準偏差和變異系數越小穩定性越好，反之，穩定性越差。其中標準偏差(SD)是最關鍵的因素，SD值小于1看作是可以接受的范圍之內的變異。

RefFinder在線綜合分析軟件是對上述3種軟件及評價方法的整合，它通過對4種方法給出的穩定性排名進行加權幾何平均數的計算，最終得出綜合排名系數。

1.2.6內參基因的驗證 從模擬增溫處理的短花針茅果后營養期轉錄組數據庫中隨機挑選2個上調基因，2個下調基因和1個表達量不變的基因，利用Premier5.0軟件，在轉錄組測序獲得的基因序列基礎上設計5個基因的特異性引物(表2)，通過qRT-PCR試驗驗證內參基因的準確性。

普通PCR擴增反應體系、反應程序及實時熒光定量PCR擴增反應體系及反應程序與上述相同。

表2 5個驗證基因的引物序列及注釋結果Table 2 The primers and annotation results of 5 validation genes

注：轉錄組測序及相對表達量變化倍率均為增溫組比對照組

Note: The change rate of the transcription group sequencing and relative expression rate are increased in the temperature group than in the control group

2 結果與分析

2.1 RNA樣品質量檢測

瓊脂糖凝膠電泳結果(圖1)顯示，短花針茅各樣品的RNA電泳圖譜帶型清晰，28S RNA的亮度約為18S RNA亮度的2倍，且5S RNA條帶亮度較弱，所有RNA樣品符合qRT-PCR的試驗要求，其中SD1樣品的RNA有gDNA污染，用DNA酶消化純化可以進行后續試驗。核酸定量檢測顯示，各樣品OD260/280值均在1.8～2.1之間，表明RNA純度較好，可以滿足后續試驗研究的需要。

2.2 候選內參基因的普通PCR分析

運用設計的特異引物對短花針茅cDNA進行普通PCR擴增，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖2所示，結果顯示9個候選基因中有6個呈現的條帶單一明亮，說明引物特異性好，可以進行實

時熒光定量PCR。TUBβ，RNAPOLII及GAPDH未獲得良好擴增，在后續試驗中予以剔除。

圖1 轉錄組測序短花針茅總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結果Fig.1 The agarose gel electrophoresis result of rna-seq Stipa breviflora total RNA注：M為total RNA標準品，SS為增溫處理，SD為試驗對照Note: M: Total RNA standard; SS: Warming treatment; SD: Experiment control

圖2 9個候選內參基因的瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.2 The agarose gel electrophoresis resultsof 9 candidate reference genes

2.3 內參基因實時熒光定量PCR分析

實時熒光定量PCR擴增結果如表3所示，6個候選內參基因的cq值范圍都在25以下，表明短花針茅cDNA樣品中6個候選內參基因都有較好的表達豐度。其中18srRNA的cq值最小為12.4917，APRT的cq值最大為23.6783，TLF，EF-1α，Actin2，TUBα的cq值分別為15.9183，18.5283，20.7217和20.7333。各候選內參基因存在表達差異，表明不同內參基因的表達量在模擬增溫處理條件下存在較大差異。

表3 6個候選內參基因的qRT-PCR結果Table 3 The qRT-PCR results of six candidate reference genes

6個候選內參基因的熔解曲線如圖3所示，都呈單峰型，不同曲線間的重復性高，表明引物特異性良好，所得數據可用于進一步的分析。

圖3 6個候選內參基因的熔解曲線Fig.3 The melting curve of 6 candidate reference genes

2.4 內參基因的表達穩定性分析

4種內參基因篩選方法所給出的分析結果不完全相同(圖4)。其中在normFinder軟件的分析結果中，數值越低表明候選內參基因的穩定性越高。由圖4-A可知，18srRNA的穩定性最高，穩定性為0.179；其次為TLF，穩定性為0.23；APRT為0.401；EF-1α為0.543；TUBα為0.642；Actin2最不穩定為0.659。

運用geNorm軟件對短花針茅6個候選內參基因進行穩定性(M值)分析，當M值<1.0時，認為候選內參基因可以作為內參基因使用，M值越低越好。結果顯示，6個候選內參基因都可以作為內參基因來使用，其中TLF和APRT同為表達最穩定的候選內參基因，M值為0.207；TUBα其次，M值為0.304；18srRNA的M值為0.4；EF-1α的M值為0.54；Actin2表現最不穩定，M值為0.596(圖4-B)。

用Delta-CT法計算短花針茅6個候選內參基因的穩定性，結果顯示18sRrRNA的穩定性最高為0.473，其次TLF為0.501，APRT為0.557，EF-1α為0.639，TUBα為0.699，Actin2最不穩定,其穩定性為0.710(圖4-C)。

BestKeeper軟件主要通過計算標準差(SD值)來衡量候選內參基因的穩定性。數值越小越穩定。由圖4-D可知，TLF在6種候選內參基因中最穩定，SD值為0.108；APRT(0.136)次之，TUBα，18srRNA，EF-1α，Actin2的SD值依次為0.294，0.422，0.772，0.822。雖然4種分析方法得出的穩定性排名不同，但是這6個候選內參基因都可以作為內參基因來使用。尤其是TLF，18srRNA和TUBα,這3個候選內參基因在不同評價方法中排名均靠前。

圖4 4種方法篩選候選內參基因的結果Fig.4 The results of 4 candidate reference gene analysis methods

RefFinder在線綜合分析得出的綜合排名如圖5所示，其中TLF的穩定性最高，綜合排名系數為1.414；其次為18srRNA，綜合排名系數為2.000；APRT為2.060，TUBα為3.873，EF-1α為4.472，Actin2最不穩定，其綜合排名系數為6.000。所以選擇TLF作為短花針茅模擬增溫下的內參基因進行后續試驗。

圖5 RefFinder分析結果Fig.5 The result of RefFinder analysis

2.5 內參基因的穩定性驗證

2.5.1驗證基因的普通PCR擴增 運用設計好的特異性引物對5個驗證基因進行普通PCR擴增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，結果如圖6所示，條帶均單一明亮，所選引物可以用于后續試驗。

圖6 5個驗證基因的瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.6 The agarose gel electrophoresis results of 5 verification gene

2.5.2驗證基因的qRT-PCR 以篩選出的TLF作為內參基因，進行qRT-PCR試驗。圖7為5個驗證基因的熔解曲線。可以看出，5個基因的引物特異性良好峰型呈現單峰狀，且不同曲線間重復性高。

圖7 5個驗證基因的熔解曲線Fig.7 The melting curve of 5 verification genes

將5個驗證基因在qRT-PCR中獲得的增溫和對照之間的相對表達量與轉錄組測序中獲得的變化倍率進行比較，結果顯示5個基因在qRT-PCR試驗與轉錄組測序中的變化趨勢一致。DHZM-L776和DHZM-L2454 2個基因在RNA-seq中增溫與對照相比都是下調基因，分別下調0.06倍和0.12倍；在qRT-PCR試驗中分別下調0.05倍和0.17倍。DHZM-L1899在RNA-seq中表達量不變，其比率為1.02；在qRT-PCR試驗中，其比率為0.92。DHZM-L12725和DHZM-L15404兩個基因在RNA-seq中為上調基因，分別上調44.63倍 和168.4倍；在qRT-PCR試驗中分別上調49.60倍和71.93倍(表2，圖8)。

3 討論

在以往的研究中，研究者經常使用GAPDH[8]、Actin[9]、TUBα[10]等看家基因對目的基因進行定量分析，但是許多看家基因在不同的試驗處理下表達量具有很大差異。盲目的選擇內參基因，往往會造成試驗結果不理想，甚至出現錯誤。Long[11]等在對小麥(Triticumaestivum)的研究中曾經發現，Actin是最不穩定的候選內參基因，與本研究結果一致。Kim[12]在對不同發育時期及紫外照射下水稻黃化苗的內參基因篩選中發現18srRNA是最穩定的。黃文華[13]在對干旱處理下蒙古冰草(Agropyronmongolicum)的內參基因篩選中分析了Actin2，18srRNA，APRT，EF-1α，RNApollⅡ，TUBα，TUBβ，GAPDH，TLF9個看家基因，發現18srRNA表達最穩定。Jian[14]等發現大豆(Glycinemax)中表達最穩定的內參基因是ELF1b和CYP2。EF-1α也常被當作內參基因來使用，但是在不同的物種、生長時期和處理中得到的結果卻完全不同，例如當擬南芥受到生物與非生物脅迫時內參基因EF-1α的表達很不穩定[15]，在本研究中卻相對穩定，可以考慮作為內參基因來使用。

圖8 5個驗證基因的相對表達量Fig.8 The relative expression of 5 verification genes

本研究發現6個基因都可以作為內參基因來使用，這與模擬增溫處理屬于較溫和的處理有關，但這6個內參基因的表達穩定性依然存在巨大差異，其中最適合本研究的內參基因是TLF。

4 結論

本研究基于Delta-CT法，geNorm，normFinder和BestKeeper軟件以及RefFinder工具分析比較了9個內參基因18srRNA，Actin2，APRT，EF-1α，TLF，TUBα，TUBβ，GAPDH和RNApollⅡ在短花針茅葉片組織的表達穩定性。Delta-CT和normFinder分析結果顯示，表達最穩定的內參基因為18srRNA；geNorm和BestKeeper分析結果顯示，TLF為表達最穩定的內參基因。運用RefFinder軟件綜合分析，TLF基因表達最穩定，依次為 18srRNA,APRT,TUBα,EF-1α,Actin2。以TLF為內參基因進行驗證，結果表明TLF為短花針茅模擬增溫處理下的最佳內參基因。