土壤干旱和強光交互作用對青藏高原高山嵩草光合功能的影響

師生波， 李天才， 王 偉, 德科加， 徐先英， 王 祺， 馬劍平， 李愛德， 康才周

(1.中國科學院西北高原生物研究所/高原生物適應與進化重點實驗室/青海省作物分子育種重點 實驗室, 青海 西寧 810001; 2.青海大學/畜牧獸醫科學院, 青海 西寧 810016; 3. 甘肅省治沙研究所/甘肅省沙生植物 工程技術研究中心, 甘肅 蘭州730070)

高山嵩草(KobresiapygmaeaClarke)是生長在青藏高原的典型地帶性植物，屬莎草科(Cyperaceae)嵩草屬(Kobresia)，在海拔3 800～4 500 m的高原地帶形成以其為優勢種的高寒嵩草草甸植物群落[1]。嵩草草甸為我國獨特的植被類型，在青藏高原分布最廣、面積最大[2]。草甸植被中高山嵩草的蓋度可達40%～60%，有時高達80%。高山嵩草營養價值較高，粗蛋白含量超過野生豆科牧草花首蓿(Medicagoruthenica(L.) Trautv.)[3]，為夏秋季家畜的主要牧草[4],盡管產草量較低，但在草地畜牧業生產中仍占有較高的地位。青藏高原為世界最高高原，平均海拔在4 000 m以上。整個高原面上空氣稀薄、大氣塵埃少、水蒸氣和二氧化碳等氣體含量很低，大氣透明度高，近地表太陽光輻射強且日照時間長；同時，受高原大陸性氣候影響，早春和晚秋季節高原地區寒冷且少雨，土壤干旱現象十分明顯[1]，植物常處于非生物脅迫引起的生理性干旱狀態。研究表明，在年平均氣溫-0.1～-1.6℃，≥5℃的積溫僅543.1～886.9℃的高寒地帶，高山嵩草仍能正常生長發育，呈現出極強的耐寒能力[5]和對高原環境的適應。高山嵩草對高原極端環境的適應機理一直是學術界關注的重點，然而迄今為止，絕大多數對高山嵩草的研究工作主要集中在分布格局[6-7]、繁殖特性[8-9]、物候特征[3]等方面，鑒于其植株構型的特殊性和生存環境的惡劣，有關生理生態適應性方面的研究一直鮮有開展。

光合作用是植物體重要的生理過程，其功能的有效運行取決于生長環境的適宜程度和植物對逆境的適應能力。太陽光能為驅動植物光合作用中一系列原初反應過程和合成富含有機物質的各種生化反應最終能量來源，然而強太陽光也可引起植物體光合活性的下調，誘發光合作用的光抑制。在沒有嚴重的環境脅迫時，光抑制的形式主要表現為非輻射能量耗散(non-radiative dissipation, NRD)的增加[14]；存在其他脅迫因素時，高光強則可引起光合機構電子傳遞活性的功能下調和光系統II (PSII)反應中心復合體結構破壞，導致光失活，甚至光傷害[11]。強光引起的高山嵩草葉片光化學量子效率的降低是否會因土壤干旱的脅迫而進一步加劇，土壤干旱是否會加重強光對植物葉片PSII光化學和非光化學猝滅能力，目前尚缺乏對此類問題的深入探討。葉綠素熒光與植物光合機構的光化學反應過程緊密相關, 能夠提供光合生理的諸多信息, 特別適宜于探測脅迫環境中植物光合功能的響應及適應性變化, 是研究光合作用的快速、無損傷探針[10]。近幾十年來, 這一測量手段已在不同植物的多種環境脅迫研究方面得到了廣泛應用[11-13]。葉綠素熒光圖像分析作為高度創新的一類動力學熒光成像測定方法，在研究微小植物體的光合生理方面具有獨特的優越性[14-15]。本文采用英國埃塞克斯大學研發的葉綠素熒光圖像分析系統(CF imager)，從光合機構的光能利用和耗散兩方面研究了高山嵩草對強光和土壤干旱脅迫的生理適應性，并借助一般線性模型單變量方差分析法探索了強光與土壤干旱脅迫的交互作用及相對貢獻。

1 材料與方法

1.1 試驗樣地及植物材料

試驗樣地鄰近青海大學-清華大學三江源高寒草地生態系統野外觀測站，草地類型為高山嵩草雜類草草甸。試驗站位于青海省玉樹州稱多縣珍秦鎮，地理坐標為33°24' N，97°18' E，海拔4 270 m。站區年平均氣溫為-5.6～3.8℃，年均降水量為562.2 mm，降水主要分布在植物生長季的6—9月份，約占全年降水總量的75%；屬典型高原大陸性氣候。

高山嵩草為該草甸的主要優勢種，次優勢種有矮嵩草(Kobresia.humilisClarke)、異針茅(StipaalienaKeng.)、珠芽蓼(PolygonumviviparumL.)、雪白萎陵菜(Potentilla.nivea L.)等。伴生植物包括羊茅(FestucaovinaL.)、垂穗披堿草(ElymusnutansKeng)、滇藏紫菀(Astertsarungensis(Griers.)Ling)、美麗風毛菊(SaussureasuperbaAnth)等。站區草場暖季試驗期間無家畜放牧利用。

土壤類型為高山草甸土，土層薄，一般僅40～50 cm厚；腐殖質含量豐富，土壤pH值為6.92。受高寒低溫氣候的影響，腐殖層分解緩慢，土壤有效肥力不高，有機質含量僅為2.36%。土壤中速效氮14.0 mg·L-1，其中氨態氮和硝態氮分別為5.1和8.9 mg·L-1，土壤速效磷l7.0 mg·L-1，速效鉀76.5 mg·L-1。

1.2 試驗設計

草皮層切割移位處理：在高山嵩草雜類草草甸選擇地勢平坦的樣地3塊，每個樣地挖取15 cm×15 cm的毗鄰草皮2塊，厚度約20 cm。仔細剪除上面的其他種類植物，且注意維持高山嵩草處于自然生長狀態；用塑料膠帶纏住草氈層的4個邊后，其中一塊放回原位，設為對照組；另一塊集中安置在相鄰的草地樣方扣籠上，距離地面約40 cm，設為干旱組。原位對照組草皮塊每日噴灑少量水，維持草氈表層處于濕潤狀態；干旱組草皮塊每晚移入遮雨棚內，以隔絕夜間降雨。

試驗開始于2014年8月28日。干旱處理持續7 d，期間多為晴天間有夜雨。9月1日起每天10:00左右依次取干旱組和對照組草皮塊在室內進行葉綠素熒光圖像測定；9月4日試驗結束后，剝取草皮塊中部土壤測定水分含量，干旱組和對照組的相對含水量分別為(5.20±1.44)%和(25.75±1.25)%，呈極顯著差異(P<0.001)。

1.3 葉綠素熒光參數測定

在暗室內，開啟CF-imager葉綠素熒光圖像分析儀(Chlorophyll fluorescence Imager, Technologica Ltd, UK )，運行預先編制的程序，獲取暗適應及穩態作用光強下的各葉綠素熒光圖像。測定期間室內溫度維持在20 ± 1.5℃，相對濕度恒定。

1.3.1測定程序 準確暗適應15 min后測定PSII反應中心關閉狀態時的最小葉綠素熒光產率(Fo)，和開放狀態的最大葉綠素熒光產量(Fm)。設200，800，1 500 μmol·m-2·s-1低、中、高3個穩態作用光強，并依次開啟；每個光強輻照15 min，每5 min測定一次最大熒光產率(Fm′)和穩態熒光產率(Fs)。測定Fm和Fm′的飽和脈沖光為6 840 μmol·m-2·s-1，脈沖頻率設為60 ms。

1.3.2葉片定位及圖像解析 程序圖形編輯框中，定位并分割無重疊的高山嵩草葉片圖像，解析為葉綠素熒光參數的數據值。共解析24枚葉片，視做多株個體的重復測定。具體處理過程見CF imager操作手冊。

1.3.3PSII光化學效率和過剩激發能的非光化學猝滅分析 分別計算200，800，1 500 μmol·m-2·s-1低、中、高3個穩態光強下，和第5、10、15 min時的各葉綠素熒光參數。Fo′以Oxborough和Baker[16]經驗公式估算:Fo′ =Fo/(Fv/Fm-Fo/Fm′)，式中Fo和Fm為準確暗適應15 min后的葉綠素熒光產率。

PSII最大效率(Fv'/Fm')和PSII運行效率(Fq'/Fm')分別由下式[17]計算:Fv'/Fm' = (Fm′ -Fo′)/Fm′;Fq'/Fm' = (Fm′ -Fs)/Fm′。PSII效率因子(Fq'/Fv')和非光化學猝滅系數(NPQ)依照Bilger 和 Bj?rkman[18]的公式計算:Fq'/Fv' = (Fm′ -Fs)/(Fm′ -Fo′)；NPQ=Fm/Fm′ - 1。PSII反應中心的開放比率qL用Baker[14]提出的方法估算,qL= [(Fm′ -Fs)/(Fm′ -Fo′)]×(Fo′/Fs)。PSII反應中心光化學效率的相對限制(L(PFD))依照下式[19]估計：L(PFD)= 1 - [(Fm′ -Fs)/Fm′]/0.83，0.83為穩態作用光下的平均最適量子效率。

1.4 葉綠素含量測定

葉綠素熒光測定試驗結束后，分別剪取對照和干旱組的高山嵩草葉片，精確稱取0.100 g鮮葉，浸入內含10 mL丙酮和乙醇的混合提取液(丙酮∶乙醇∶水=4.5∶4.5∶1)的玻璃瓶,蓋緊樣品瓶蓋，置低溫處避光浸提約10 d至葉片無色[20]。每處理組設3次重復，葉綠素含量的測定與計算見朱廣廉等[21]。

1.5 數據分析

本文選用9月3日，即干旱處理第6天的成組測定數據進行分析。此時干旱組草氈表層已較為干燥，但高山嵩草仍未顯受損跡象，僅個別植株葉片略有泛黃跡象。

數據經Microsoft Excel 2010整理后，用SPSS 16.0軟件進行統計分析。獨立樣本t檢驗法比較土壤干旱和對照組葉片間的差異顯著性；不同處理光強和不同照光時間之間的差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，最小顯著差異法(LSD) 進行多重比較, 顯著性水平設定為0.05；光強和土壤干旱脅迫間交互效應分析采用一般線性模型單變量方差分析法(GLM univariation)。圖中數據為平均數, 垂直條表示標準差(SD)，樣本數為24。

2 結果與分析

2.1 土壤干旱脅迫對高山嵩草葉綠素含量的影響

表1表明，與對照相比，土壤干旱處理后高山嵩草葉片的葉綠素a(Chla)含量和葉綠素a、b比值(Chla/b)均有所降低，且Chla呈極顯著降低(P< 0.01)；但葉綠素b(Chlb)和總葉綠素含量幾無差異。

表1 土壤干旱脅迫對高山嵩草葉片葉綠素含量的影響Table 1 Effects of soil drought stress on chlorophyll contents in leaves of K. pygmaea

2.2 穩態作用光強對高山嵩草PSII光化學效率的影響及土壤干旱脅迫的加劇

圖1表明, 隨穩態作用光強的升高，PSII最大效率(Fv'/Fm')、運行效率(Fq'/Fm')和效率因子(Fq'/Fv')均呈顯著降低趨勢；與對照組植物相比，干旱脅迫引起了Fv'/Fm'和Fq'/Fm'的極顯著降低(P<0.01)，而Fq'/Fv'在中等光強時有升高趨勢。說明，Fv'/Fm'和Fq'/Fm'的變化易受強光脅迫的影響，且被土壤干旱所加強。

圖2為800 μmol·m-2·s-1中等光強的測定結果，200 μmol·m-2·s-1低光強和1 500 μmol·m-2·s-1高光強時各熒光參數也呈現類似變化趨勢。15 min的穩態作用光輻照期間,Fv'/Fm'和Fq'/Fm'較為穩定，但土壤干旱引起了其極顯著降低(圖2a和圖2c)(P<0.01)；Fq'/Fv'呈增高趨勢，且略為干旱脅迫所促進(圖2b)。顯然，高山嵩草PSII光化學效率對光強有較快的響應和適應能力。

圖1 不同穩態作用光下PSII最大效率(Fv'/Fm')、PSII效率因子(Fq'/Fv')和PSII運行效率(Fq'/Fm')的變化及對土壤干旱脅迫的響應Fig.1 Responses of PSII maximum efficiency(Fv'/Fm'), PSII efficiency factor(Fq'/Fv') and PSII operating efficiency(Fq'/Fm') to actinic light intensity and soil drought stress in leaves of K. pygmaea

圖2 穩定作用光照期間PSII最大效率(Fv'/Fm')、PSII效率因子(Fq'/Fv')及PSII運行效率(Fq'/Fm')的變化及對土壤干旱脅迫的響應(800 μmol·m-2·s-1)Fig.2 PSII maximum efficiency (Fv'/Fm'),PSII efficiency factor (Fq'/Fv') and PSII operating efficiency (Fq'/Fm') during the illumination by actinic light of 800 μmol·m-2·s-1 and their responses to soil drought stress in leaves of K. pygmaea

2.3 PSII非光化學猝滅和開放比率對作用光強和干旱脅迫的響應

圖3a表明，隨穩態作用光強的增加，PSII非光化學猝滅系數(NPQ)顯著增大；且土壤干旱脅迫下高山嵩草葉片的NPQ均顯著和極顯著高于對照(P< 0.05和P< 0.01)。15 min 800 μmol·m-2·s-1穩態作用光輻照期間，對照和土壤干旱組的NPQ均相對恒定(P< 0.01) (圖3b)。說明，高山嵩草的PSII非光化學猝滅過程對光強波動和土壤干旱脅迫的敏感性都較高。

圖3 穩態作用光強和土壤干旱脅迫對高山嵩草葉片PSII非光化學猝滅系數(NPQ)的影響Fig.3 Effects of actinic light and soil drought on PSII non-photochemical quenching coefficient (NPQ) in leaves of K. pygmaea

PSII反應中心的開放比率(qL)隨穩態作用光強的增高而顯著降低(圖4a)；除200 μmol·m-2·s-1低光強外，土壤干旱引起了qL的極顯著和顯著增高(P<0.01和P<0.05)。盡管差異并不都顯著，隨光照時間的延長，qL呈增加趨勢，土壤干旱組的qL在5 min和15 min間具顯著性差異(P< 0.05)，而10 和15 min時對照組qL也顯著高于5 min的(P<0.05) (圖4b)。盡管qL在高光強趨于降低，但土壤干旱脅迫和持續光照后qL都有升高趨勢，反映了高山嵩草對逆境脅迫的馴化適應過程。

2.4 PSII反應中心光化學效率的相對限制和交互效應分析

不同光強和輻照期間的分析表明，隨穩態作用光強的增高，PSII反應中心光化學效率的相對限制(L(PFD))呈顯著升高的趨勢，且土壤干旱脅迫下的L(PFD)極顯著高于對照組植物的(P< 0.01)(圖5a)；800 μmol·m-2·s-1光強下隨輻照時間的延長，對照組L(PFD)在第10和15 min時顯著低于5 min，而干旱組L(PFD)的降低無顯著差異(圖5b)。顯然土壤干旱可加劇光合作用的光抑制程度，但L(PFD)隨輻照時間的延長略有減輕趨勢，可能緣于光合機構的馴化適應。

圖4 穩態作用光強和土壤干旱脅迫對高山嵩草葉片PSII反應中心的開放比率(qL)的影響Fig.4 Effects of actinic light and soil drought on fraction of PSII centers that are “opened” (qL) in leaves of K. pygmaea

采用一般線性模型單變量方差分析法(general linear model univariate)，開展了土壤干旱與強光間的交互作用的研究。結果表明：穩態作用光強下各熒光參數的η2值都較高，說明光強對總變異的貢獻較大。強光和土壤干旱共存時，qL、NPQ和Fv'/Fm'的Sig.均較小(P< 0.01)，表明兩脅迫因子間存在著較強的交互作用(表2)；而Fq'/Fm'和L(PFD)的Sig.較大(P> 0.05)，意味著兩因子間的交互作用不顯著，且η2值都很低，對總變異的影響很小。除Fq'/Fv'外，各因素對總變異的貢獻依次為：光強>土壤干旱>光強×土壤干旱。

圖5 高山嵩草葉片PSII反應中心光化學效率的相對限制(L(PFD))分析Fig.5 Relative limitation of PSII photochemical efficiency (L(PFD)) in leaves of K. pygmaea

表2 土壤干旱和光強處理對葉綠素熒光參數的交互效應分析Table 2 Analysis of inter-effectiveness of light and soil drought on chlorophyll fluorescence parameters

3 討論與結論

光合作用是綠色植物和光合細菌在光的參與下積蓄能量和形成有機物的過程，植物光合機構就是推動光合作用過程的“生命發動機”[19]，其反應中心的光化學效率易受諸多因素的影響，對外界環境因子的變化極為敏感[22-23]。葉綠素熒光圖像分析有助于探測葉片光合功能的空間異質性(photosynthetic heterogeneity)問題[24]，也適用于矮小植株和細小葉片的光合生理研究。本研究發現，高山嵩草在強光和土壤干旱脅迫下，PSII最大效率Fv'/Fm' 和PSII運行效率Fq'/Fm'都呈降低趨勢；與此同時，PSII非光化學猝滅系數NPQ和光化學效率的相對限制L(PFD)則呈增加趨勢。顯然強光和土壤干旱的交互作用在導致PSII反應中心光化學效率限制加劇同時，引起了PSII反應中心非光化學能量耗散的加強，可降低激發能過剩對光合機構的潛在傷害，顯示了高山嵩草光合機構的一種積極調解方式。

PSII反應中心的激發能利用取決于電子傳遞原初醌受體QA的氧化還原狀態。基于Stern-Volmer途徑的Lake模型引入了一個新熒光參數qL，定義為PSII反應中心的開放比率(fraction of PSII centers that are opened)， 可反映QA的氧化還原狀態，與PSII反應中心的開放呈線性關系[25]。隨穩態作用光強的增高，qL呈顯著降低趨勢，但土壤干旱組的qL似呈現較小的降低程度，很可能干旱過程誘導了PSII反應中心構型的馴化適應，有利于QA氧化狀態的維持[26]。強光和土壤干旱交互作用下NPQ呈升高趨勢，此時植物體內基質類囊體膜上PSII反應中心多呈失活狀態, 失活的反應中心與光捕獲天線色素一起共同參與過剩激發能的耗散過程, 可保護功能反應中心免遭多余光能的進一步傷害[26-27]。

PSII光化學和非光化學能量耗散的調節能力取決于植物種的特性和環境的變化幅度[24]。15 min穩態作用光照期間Fv'/Fm' 和Fq'/Fm'，以及NPQ都幾乎無波動，說明高山嵩草的光合機構對外界環境變遷的適應能力較強且迅速。Demmig-Adams等[23]認為，PSII光化學效率的可逆性變化范圍較廣，從桉樹冠層下藤本植物的數秒，到亞高山松樹似乎貫穿整個冬季的持久可逆都有表現。PSII光化學效率的明顯差異有賴于葉黃素循環的存在，也包含其他特性，如跨膜pH質子梯度、內囊體蛋白組成和磷酸化等[24]。本文研究發現，800 μmol·m-2·s-1穩態作用光輻照期間，PSII反應中心的開放比率qL略有增高趨勢，L(PFD)也呈現非常弱的降低趨勢，是強光塑造下光合機構光脅迫馴化(light-stress acclimation) 的反映。PSII反應中心的非輻射能量耗散是過剩激發能耗散的主要途徑[18, 28]，強光和干旱的交互作用下L(PFD)增大，NPQ也隨之而升高，可祛除激發能的過量堆積，維持光合機構光化學反應的正常運行[14]，是植物對逆境脅迫的一種積極響應途徑。

逆境脅迫通常會引起葉綠素分子的降解[19, 29]。土壤干旱脅迫下高山嵩草Chla降低可能緣于活性氧分子積累對光合色素的破壞。由Chla/b比值的降低可知，Chla較集中的PSII反應中心蛋白復合體是土壤干旱脅迫的敏感部位，也可能是引起Fv'/Fm' 和Fq'/Fm'降低的原因；而失活反應中心的形成促進了非光化學能量耗散的升高[19]。

土壤干旱能加劇強光對PSII光化學量子效率和非光化學能量耗散的影響。有學者[30-31]曾綜合分析了田間增強紫外線-B輻射(UV-B; 280～315 nm)的多年試驗結果，發現在水分條件較充足的年份，人為增補UV-B輻射可引起作物產量的顯著降低，但在水分虧卻年份其影響就很不明顯；認為干旱脅迫誘導的植物體紫外線吸收物質和比葉重(specific leaf weight)的增加有助于增強對UV-B輻射的抗性，是兩脅迫因子UV-B輻射與水分虧卻間發生交互效應(interaction effect)的結果。兩種環境因子間存在交互作用的研究已有較多報道，如光照與溫度[32]、光照與氮元素[33]、磷元素與土壤酸化[34]等。但很多研究僅限于對表觀現象的分析，缺乏顯著性的判斷，也缺少因子相對貢獻的數學界定。本文采用一般線性模型單變量方差分析法(general liner model univariation)，探討了土壤干旱與強光間的交互作用。結果表明，高山嵩草的Fq'/Fm'和L(PFD)在兩因素間不存在交互效應，即強光引起的PSII實際光能捕獲效率的降低和光化學效率的相對限制增加并沒有因為干旱脅迫的存在而加劇；但NPQ和Fv'/Fm'則存在著兩脅迫因子的交互效應。研究認為，Fv'/Fm'的波動受葉黃素循環中玉米黃質形成的影響[24]，被用來評價非光化學猝滅波動對PSII運行效率變化的貢獻[14]，其參數1 -Fv'/Fm'也曾被用作表征非光化學能量耗散的強弱[14-15]；可以確定，高山嵩草葉片的PSII非光化學能量耗散過程存在著兩脅迫因子交互效應。顯然，僅憑表象推斷Fv'/Fm'和L(PFD)的變化被土壤干旱所加劇并不能確定兩因子間交互效應的存在，必需經一般線性模型單變量方差分析的顯著性檢驗和相對貢獻分析才能界定。因子相對貢獻的分析可知，光強是影響高山嵩草PSII反應中心光能利用和能量耗散的主要因素，且兩因子的交互效應常小于單獨土壤干旱脅迫的貢獻。qL和Fq'/Fv'的η2值顯示，盡管存在交互作用，但其值和與干旱脅迫對總變異的貢獻很接近且η2值很小，變異主要緣于光強度的貢獻。

高山嵩草為典型寒冷中生植物[1]，植株低矮，株高僅1～3 cm；葉片呈線形，葉長約3 cm，寬約1 mm。高山嵩草的根系非常發達，主要分布在10 cm土層內，與土壤形成致密的草根盤結層[35-36]，其物候特征和生理過程主要受制于對淺層土壤水分的可利用性[37]。盡管采用草皮層切割移位測定的方法解決了高山嵩草植株低矮、葉片纖細的光合生理研究瓶頸，無疑是測定方法的一個突破；但如何做到野外自然條件下的精細控制測量，依然有很多問題需要解決。

綜上可知，土壤干旱脅迫可引起高山嵩草葉片PSII反應中心光化學效率相對限制L(PFD)的顯著增加，進而導致PSII光化學效率的降低和非光化學能量耗散的加強。高山嵩草的光合機構存在著光脅迫馴化適應現象，土壤干旱脅迫下葉內活性氧分子的積累可加重光合色素的破壞，引起Chla含量和Chla/b比值的降低，形成諸多失活反應中心，并導致非光化學能量耗散的升高。PSII反應中心的非光化學猝滅存在著兩脅迫因子的交互作用，可以緩解土壤干旱脅迫時PSII光化學效率降低后強光對光合機構的進一步傷害，是高山嵩草抵御多因素脅迫的一種適應策略。