不同石漠化程度對(duì)灌叢草地土壤細(xì)菌遺傳多樣性的影響

陳 瑩, 王 茜, 王子苑, 王小利

(貴州省草業(yè)研究所， 貴州 貴陽(yáng) 550006)

貴州處于我國(guó)的西南部，是喀斯特地貌的核心部位，沉積了巨厚的碳酸鹽為主要的地層，出露面積占全省總面積的61.9%，素以“喀斯特博物館”著稱[1]。喀斯特石漠化生態(tài)系統(tǒng)的典型特征是生境的嚴(yán)酷性和脆弱性，嚴(yán)酷性集中表現(xiàn)為巖石裸露程度高、土層淺薄、保水能力差；生境的脆弱性表現(xiàn)在土地承載力低、穩(wěn)定性差、抗干擾能力弱且自然恢復(fù)慢[2]。隨著石漠化的加劇，植被種類(lèi)、土壤肥力、土壤微生物等都發(fā)生了相應(yīng)的變化[3-5]，其中土壤微生物積極參與土壤物質(zhì)的轉(zhuǎn)化過(guò)程，是土壤中物質(zhì)轉(zhuǎn)化的動(dòng)力，如固氮作用、硝化作用、腐殖質(zhì)分解作用等，在土壤的形成、肥力演變、有毒物質(zhì)凈化方面起著重要作用[6]。土壤中的微生物是敏感群體，周?chē)h(huán)境發(fā)生變化就會(huì)對(duì)其產(chǎn)生相應(yīng)的影響[7]，細(xì)菌是微生物的主要類(lèi)群，他個(gè)體小、數(shù)量多、繁殖快，在土壤的物質(zhì)循環(huán)中起著關(guān)鍵作用。因此土壤細(xì)菌的多樣性可以作為評(píng)價(jià)土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的敏感指標(biāo)和表征土壤質(zhì)量的生物學(xué)指標(biāo)，對(duì)土壤的可持續(xù)利用具有重要意義[8-10]。

近年來(lái)，變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)是研究土壤微生物群落的有效工具，它直接分離土壤微生物的DNA片段，突破了傳統(tǒng)的微生物分離純化培養(yǎng)方法與顯微技術(shù)的局限性，已成為研究土壤微生物的重要手段之一[11-13]。Muyzer等最先采用PCR-DGGE研究微生物種群圖譜，發(fā)現(xiàn)這種方法能夠用于考察未知微生物群落的遺傳多樣性[14]。宋鐵英[15]認(rèn)為通過(guò)DGGE法檢測(cè)稻田藍(lán)細(xì)菌的遺傳多樣性，可以避免因純化、培養(yǎng)以及人為經(jīng)驗(yàn)判斷等因素造成的誤差，更能準(zhǔn)確的判斷藍(lán)細(xì)菌的多樣性。因此，本研究應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)，對(duì)貴州不同程度石漠化灌叢草地土壤細(xì)菌的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，并探討了不同石漠化程度對(duì)土壤細(xì)菌遺傳多樣性的影響，有助于提高對(duì)灌叢草地生態(tài)系統(tǒng)功能演變的調(diào)控和預(yù)警能力，為灌叢草地資源的合理利用與保護(hù)管理以及退化草地生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)重建提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

貴州省普定縣陳家寨村位于貴州中部偏西，E 105°49′7″，N 26°20′44″，石灰?guī)r山地面積大，石漠化程度多樣，占全縣總面積的35%左右，取樣地海拔1 300～1 400 m，植被以灌叢草地為主，草本植物耐旱的種類(lèi)較多，包括鬼針草(Bidenspilosa)、酢漿草(Oxaliscorniculata)、千里光(SenecioscandensBuch)、白茅(Imperatacylindrica)等。灌木主要為刺梨(RosaroxburghiiTratt)、小果薔薇(RosacymosaTratt)、野拔子(ElsholtziarugulosaHemsl)、馬桑(CoriarianepalensisWall)、火棘(Pyracanthafortuneana)等，樣地土壤均為黑色石灰土。

圖1 潛在(A)、輕度(B)、中度(C)、重度(D)石漠化樣地Fig.1 Soil samples of potential rocky desertification(A), slight rocky desertification(B), medium rocky desertification(C) and severe rocky desertification(D)

1.2 土壤樣品采集

于2014年8月在普定縣陳家寨村進(jìn)行取樣，根據(jù)巖石裸露程度，選擇潛在(A)、輕度 (B)、中度(C)和重度(D)4種石漠化典型樣地，以巖石縫玉米耕作地作為對(duì)照(E)，利用多點(diǎn)混合采樣法在深度為0～20 cm的土層進(jìn)行取樣，取樣后放置于無(wú)菌保鮮袋中冷藏送回。

1.3 土壤微生物DNA提取

去除土樣里面的石子與植物殘?bào)w，過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)胞菌液中加入溶菌酶溶液，水浴后加入20 μL Proteinase K溶液，使細(xì)胞裂解，接著加入200 μL Buffer BD，200 μL 乙醇混勻，轉(zhuǎn)移至吸附柱中，靜置離心，棄廢液，加入500 μL PW Solution，離心棄廢液，加入500 μL Wash Solution，離心，倒掉濾液，最后取出吸附柱，放入一個(gè)新的1.5 mL離心管中，加入50 μL CE Buffer靜置3 min，12 000 rpm室溫離心2 min，收集 DNA溶液。

1.4 細(xì)菌16S rDNA片段的PCR擴(kuò)增

以樣品基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物GC-338F和518R擴(kuò)增樣品16S rDNA高變區(qū)序列。

表1 引物信息Table 1 Primer information

PCR擴(kuò)增體系(50 μL)為：10×PCR buffer 5 μL；dNTP(2.5 mM)3.2 μL；rTaq(5 U·μL-1)0.4 μL；GC-338F(20 mM)1 μL；518R(20 mM)1 μL；模板DNA 50 ng；補(bǔ)ddH2O至50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，55℃復(fù)性45 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最終72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit純化回收。

1.5 PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析

取10 μL PCR的產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析。采用變形梯度為35%～55%、濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠(化學(xué)變性劑為100%尿素7 mol·L-1和40%(v/v)的丙烯酰胺)在1×TAE緩沖液中150 V 60℃下電泳5 h。變性梯度凝膠電泳(DGGE)完畢后,采用銀染法染色。

1.6 DGGE圖譜中優(yōu)勢(shì)條帶的回收與測(cè)序

采用OMEGA 公司Poly-Gel DNA Extraction Kit回收目的條帶，以2 μL回收產(chǎn)物為模板，338F/518R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增的DNA片段切膠回收、純化后，連接到Pmd18-T載體上，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆，菌液由華大基因?qū)Σ迦氲募?xì)菌16S rDNA片段進(jìn)行序列測(cè)定。

1.7 數(shù)據(jù)分析

細(xì)菌多樣性指數(shù)是研究群落物種數(shù)和個(gè)體數(shù)以及均勻度的綜合指標(biāo)。根據(jù)電泳圖譜中樣品條帶數(shù)目及每個(gè)條帶的強(qiáng)度(灰度)，對(duì)各樣品中細(xì)菌多樣性指數(shù)(H)、均勻度(E)和豐富度(S)等指標(biāo)進(jìn)行分析，計(jì)算方法如下：

其中，pi為樣品中單一條帶的強(qiáng)度在該樣品所有條帶總強(qiáng)度中所占的比率，N為DGGE圖譜單一泳道上所有條帶的豐度，Ni為第i條帶的豐度；S是某樣品中所有條帶數(shù)目總和。在GenBank中使用Blast程序進(jìn)行同源性比較，獲得最相似典型菌株的16S rDNA序列。采用MEGA5軟件，Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自展數(shù)(bootstrap)為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增

提取5份混合土樣的土壤總DNA，經(jīng)測(cè)定DNA片段在20 kb左右，OD260/OD280比值在1.82～1.95之間，說(shuō)明所提DNA的純度較好，并以GC-338F和518R為引物擴(kuò)增16S rDNA序列，得到約200 bp的DNA片段(圖2)用于DGGE分析。

圖2 細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增Fig.2 Amplification of the 16S rDNA in bacteria

2.2 PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳

如圖3所示， 5個(gè)土樣的圖譜在條帶上的數(shù)目與位置并不一致，與對(duì)照玉米耕作地(E)相比，隨著石漠化程度的加強(qiáng)，條帶數(shù)目減少，而潛在石漠化土樣(A)的條帶最多，說(shuō)明土壤細(xì)菌群落對(duì)環(huán)境有一定的選擇性。

圖3 DGGE指紋圖譜及Quantityone 軟件做的模式圖Fig.3 The DGGE fingerprinting and the mode chart made by Quantityone software

2.3 各樣品之間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性

通過(guò)UPGMA算法對(duì)圖譜作出的系統(tǒng)樹(shù)狀圖如圖4所示，我們可以看出5種類(lèi)型的樣地分為2大族群，玉米耕作地(E)單獨(dú)為1個(gè)族，而剩下的4個(gè)樣地為1個(gè)大族。其中潛在(A)與輕度(B)石漠化土壤細(xì)菌PCR-DGGE圖譜相似度較高，而中度(C)與重度(D)石漠化相似度較高，說(shuō)明隨著石漠化程度的加強(qiáng)，土壤的細(xì)菌群落有一個(gè)逐漸演替的過(guò)程。

圖4 依據(jù)樣品間的相似系數(shù)構(gòu)建的聚類(lèi)圖Fig.4 The cluster dendrogram of the samples

2.4 不同石漠化土樣中細(xì)菌多樣性的分析

5個(gè)不同石漠化樣地的細(xì)菌多樣性分析如表2所示，可見(jiàn)5個(gè)樣地的細(xì)菌香農(nóng)指數(shù)與豐富度指數(shù)存在一定差異，隨著石漠化程度增強(qiáng)，均呈現(xiàn)一定的下降趨勢(shì)，均勻度指數(shù)的差別不大。說(shuō)明隨著石漠化程度的增強(qiáng)與土壤細(xì)菌群落的多樣性和豐富度成負(fù)相關(guān)。而玉米耕作地的土壤細(xì)菌香濃指數(shù)、均勻度指數(shù)與豐富度指數(shù)最低，這表明土壤耕作后土壤中細(xì)菌的復(fù)雜度與豐富度顯著下降。

表2 各樣品之間的細(xì)菌多樣性分析Table 2 Analysis of bacteria diversity of sample

2.5 主要電泳條帶的序列測(cè)定

選取5個(gè)樣品在DGGE凝膠中特異的10個(gè)條帶，回收后，以338F/518R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得約200 bp的DNA片段。PCR產(chǎn)物純化后連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆，每個(gè)回收條帶選取3個(gè)克隆進(jìn)行序列測(cè)定，共獲得了30個(gè)片段的核苷酸序列，所有序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中序列的同源性為84%～100%，且大部分與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列同源性低于97%，屬于分類(lèi)在“種”地位上新發(fā)現(xiàn)細(xì)菌。測(cè)試結(jié)果顯示30個(gè)克隆分屬于Anaerolineae(厭氧繩菌綱)、Acidobacteria(酸桿菌門(mén))、Proteobacteria(變形菌門(mén))、Bacteroidetes(擬桿菌門(mén))4大類(lèi)群，其中第1個(gè)條帶存在2種不同的細(xì)菌菌株信息，這說(shuō)明同一個(gè)條帶可能含有不同的菌種，用MEGA4.0分析了序列有差異的13個(gè)片段，通過(guò)GenBank中Blast程序所獲近似序列進(jìn)行菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果如圖4所示，13個(gè)序列片段聚成了10個(gè)分支，分別屬于Geobacter(地桿菌屬)，Blastocatella，Chitinophaga，F(xiàn)erruginibacter，Thioalbus，Lysobacter(溶桿菌)，Terrimonas，Bizionia，Anaerolinea(厭氧繩菌屬)，Sphingomonas(鞘氨醇單胞菌屬)，說(shuō)明這5種土樣中的細(xì)菌具有高度的遺傳多態(tài)性與復(fù)雜的群落結(jié)構(gòu)。

圖4 16s rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree constructed by 16S rDNA sequences

3 討論與結(jié)論

3.1 不同石漠化程度對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響

土壤微生物在土壤的形成與發(fā)育、物質(zhì)的轉(zhuǎn)化與能量的傳遞等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，并與土壤肥力及土壤的健康有著密切的關(guān)系，是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[16-18]。何尋陽(yáng)[19]研究發(fā)現(xiàn)影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的因素很多，但是最重要的因素是有機(jī)質(zhì)的復(fù)雜性與數(shù)量，它提供了大量的碳、氮資源，而植被的變化必然會(huì)導(dǎo)致土壤有機(jī)質(zhì)的改變，從而引起土壤微生物組成、活性與代謝功能發(fā)生改變。張平究[20]在研究植被恢復(fù)對(duì)喀斯特土壤生化特性的影響中發(fā)現(xiàn)，植被恢復(fù)顯著地提高了土壤養(yǎng)分、微生物活性、細(xì)菌種群豐富度及基因多樣性，植被恢復(fù)演替下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)之間的多樣性遵循如下趨勢(shì):裸露地<(稀)草地<灌叢。這說(shuō)明隨著喀斯特環(huán)境植被恢復(fù)的變化，土壤微生物種類(lèi)及其多樣性也會(huì)隨之改變。本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照玉米耕作地(E)相比，隨著石漠化程度的加強(qiáng)，地上植被從灌木逐漸演替到草本植物，植被種類(lèi)、數(shù)量顯著減少，而通過(guò)DGGE指紋圖譜進(jìn)行分析，條帶數(shù)目隨石漠化程度加深而減少，潛在石漠化土樣(A)的條帶最多，5個(gè)樣地的細(xì)菌香農(nóng)指數(shù)和豐富度指數(shù)與石漠化程度成負(fù)相關(guān)，而玉米耕作地土壤細(xì)菌香指數(shù)、均勻度指數(shù)與豐富度指數(shù)最低，這與張平究的研究結(jié)果類(lèi)似，說(shuō)明隨著石漠化程度的加劇，地面裸露程度增加，導(dǎo)致地面植被種類(lèi)、蓋度隨之減少，進(jìn)而影響到土壤一系列的生化反應(yīng)，導(dǎo)致土壤中參與生化反應(yīng)的細(xì)菌種類(lèi)和數(shù)量發(fā)生了改變。另一方面，在石漠化地區(qū)的土地上進(jìn)行農(nóng)業(yè)耕作，降低了土壤細(xì)菌群落多樣性，對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)帶來(lái)了負(fù)面的影響。

3.2 土壤細(xì)菌遺傳多樣性對(duì)不同石漠化的響應(yīng)

本研究選取5個(gè)樣品在DGGE凝膠中特異的10個(gè)片段進(jìn)行克隆測(cè)序，每個(gè)片段選擇3個(gè)克隆進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果顯示，克隆片段在系統(tǒng)發(fā)育分析中聚成10個(gè)分支，說(shuō)明土壤細(xì)菌在不同程度石漠化土壤中會(huì)形成不同的種類(lèi)，隨著石漠化程度的加重，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的變化，并且改變了土壤細(xì)菌群落的遺傳多樣性，但值得注意的是，沒(méi)有檢測(cè)到的細(xì)菌類(lèi)群不能歸納為沒(méi)有，因?yàn)楸疚闹皇沁x擇部分克隆用于分析和測(cè)序，這里細(xì)菌多樣性的比較與其說(shuō)是反映土壤細(xì)菌群落多樣性，不如說(shuō)是反映細(xì)菌群落的物種豐度[21]。本研究在構(gòu)建克隆文庫(kù)中，超過(guò)一半序列是屬于新的“種”分類(lèi)上的細(xì)菌，對(duì)這些新細(xì)菌的進(jìn)一步研究，將有助于揭示石漠化生態(tài)系統(tǒng)功能退化的微生物機(jī)理。

綜上所述，本試驗(yàn)結(jié)果顯示石漠化程度越嚴(yán)重，土壤中的細(xì)菌群落復(fù)雜性與多樣性越低，在不同程度石漠化灌叢草地土壤中細(xì)菌會(huì)形成不同的群落結(jié)構(gòu)，并具高度的遺傳多樣性。另一方面，在石漠化土地上進(jìn)行農(nóng)耕作業(yè)會(huì)明顯降低土壤中細(xì)菌的豐富度與多樣性，這會(huì)影響土壤的肥力，并對(duì)土壤的健康狀態(tài)帶來(lái)負(fù)面的影響，因此在制定石漠化恢復(fù)的措施時(shí)，要考慮到土壤微生物對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的重要作用，采用多種植物混播的培育模式。